專利名稱：調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法。
背景技術(shù)：
流式細(xì)胞儀是能對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)計(jì)數(shù)并記錄其相關(guān)參數(shù)的細(xì)胞分析儀器，優(yōu)勢(shì)在測(cè)量速度快，細(xì)胞檢測(cè)量大，能多參數(shù)分析，在臨床上有廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞儀結(jié)合熒光單抗技術(shù)為臨床上造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)提供了一種快速、定量、重復(fù)性好的方法。目前造血干細(xì)胞移植技術(shù)已越來(lái)越多地用于治療血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及一些 遺傳性疾病。在治療惡性血液病時(shí)，大劑量化療或放療摧毀病人的骨髓后，給病人移植造血干細(xì)胞可以幫助病人重建骨髓，有助于恢復(fù)病人的造血機(jī)能和免疫功能。實(shí)體腫瘤病人通過(guò)造血干細(xì)胞移植可以抗衡大劑量化療導(dǎo)致的毒副作用，與大劑量化療相配合的造血干細(xì)胞移植已在臨床大大提高了某些腫瘤病人的長(zhǎng)期存活率。因此，造血干細(xì)胞移植對(duì)多種疾病的治療具有重要意義，而準(zhǔn)確的造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)對(duì)于干細(xì)胞移植的成敗又十分重要。對(duì)于有劑量要求的造血干細(xì)胞移植方案而言，精確的干細(xì)胞計(jì)數(shù)十分重要，此重要性還體現(xiàn)在動(dòng)員及白細(xì)胞分離過(guò)程中，如通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)胞水平判斷動(dòng)員是否成功、何時(shí)為最佳采集時(shí)間以及采集到的干細(xì)胞數(shù)量是否足夠等等。由于干細(xì)胞所占的比例很小，在外周血中不到O. 1%在骨髓中也只占單個(gè)核細(xì)胞的1%至4%，因此利用流式細(xì)胞儀在大量細(xì)胞中快速準(zhǔn)確地篩選并計(jì)數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求非常高。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，被檢細(xì)胞的濃度與反應(yīng)抗體間的適宜比例是檢測(cè)成功并至結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵要素之一，細(xì)胞濃度通常通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法得到，傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法需要血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和顯微鏡，或者采用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每種方法都有一定的局限性。由此，發(fā)明人結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，另辟蹊徑，不需要測(cè)定具體的細(xì)胞濃度，通過(guò)與設(shè)立的對(duì)照組在流式細(xì)胞儀上所測(cè)得的流速進(jìn)行比對(duì)，建立了這套用于造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法。該方法具有不增加任何成本，快速簡(jiǎn)便、易于流式細(xì)胞專業(yè)技術(shù)人員操作，提高檢測(cè)精確度和成功率的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的思路是借助流式細(xì)胞儀本身具備的細(xì)胞流速電子控制功能，設(shè)立抗凝新鮮外周血做對(duì)照，同時(shí)將動(dòng)員后采集液與對(duì)照組分別在流式細(xì)胞儀上所測(cè)得的流速進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而調(diào)整動(dòng)員后采集液的反應(yīng)細(xì)胞濃度在適宜范圍，從而達(dá)到精確測(cè)定造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的目標(biāo)。
具體的技術(shù)方案如下調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法，它包括如下步驟(I)準(zhǔn)備抗凝新鮮正常人外周血O. 5mL，動(dòng)員后外周血采集液O. 5mL ；(2)流式細(xì)胞儀開(kāi)機(jī)后首先進(jìn)行儀器質(zhì)控，保持電子儀器工作狀態(tài)穩(wěn)定；(3)取正常人外周血50yL加500μ I生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀的中檔進(jìn)行測(cè)速，反復(fù)10次，記錄每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)，繪出測(cè)速所得的上下限范圍；(4)取動(dòng)員后外周血采集液50μ L加500 μ L生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀中檔進(jìn)行測(cè)速，反復(fù)10次，記錄每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)；(5)將步驟(4)的得到的細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)與步驟(3)得到的細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，確定動(dòng)員后外周血采集液在造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)分析中應(yīng)稀釋的倍數(shù)；(6)取稀釋后的動(dòng)員后外周血采集液50μ L加500 μ L生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀中檔進(jìn)行測(cè)速，當(dāng)采集液最終的細(xì)胞數(shù)落在步驟第(3)測(cè)速所得的上下限范圍內(nèi)時(shí)，則該濃度采集液就可以進(jìn)行造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)；(7)進(jìn)行造血干細(xì)胞⑶34絕對(duì)計(jì)數(shù)的常規(guī)操作流程。步驟(5)中，動(dòng)員后外周血采集液在造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)分析中應(yīng)稀釋或濃縮的(刪)倍數(shù)的計(jì)算方法為步驟(4)得到的外周血采集液每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)除以步驟
(3)得到的正常人外周血每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取整數(shù)即為稀釋的倍數(shù)。步驟(7)中，造血干細(xì)胞⑶34絕對(duì)計(jì)數(shù)的常規(guī)操作流程包括如下步驟(7a)分別向已編好號(hào)的試管中加入單克隆抗體⑶45和⑶34試劑各5 μ L，加步驟
(6)確定好的取稀釋后的動(dòng)員后外周血米集液50 μ L,混勾室溫避光反應(yīng)20分鐘；(7b)加0PTILYSE 250 μ L，混勻室溫避光放置10分鐘；(7c)加pH7 7. 2的PBS緩沖液250 μ L，靜置5分鐘；(7d)加 FLOW COUNT 50 μ L ；(7e)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，被檢細(xì)胞的濃度與反應(yīng)抗體間的適宜比例是檢測(cè)成功并至結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵要素之一，細(xì)胞濃度通常通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法得到，傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法需要血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和顯微鏡，或者采用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每種方法都有一定的局限性。由此，發(fā)明人結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，另辟蹊徑，不需要測(cè)定具體的細(xì)胞濃度，通過(guò)與設(shè)立的對(duì)照組在流式細(xì)胞儀上所測(cè)得的流速進(jìn)行比對(duì)，建立了這套用于造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于不需要測(cè)定具體的細(xì)胞濃度就能完成造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，測(cè)定結(jié)果應(yīng)該與先測(cè)具體細(xì)胞濃度的造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)得到的結(jié)果一致，否則就沒(méi)有意義了。有益效果本發(fā)明方法具有不增加任何成本、快速簡(jiǎn)便、易于本領(lǐng)域的技術(shù)人員操作、提高檢測(cè)精確度和成功率的優(yōu)點(diǎn)。


圖I 一份腫瘤患者動(dòng)員后外周血采集液細(xì)胞的光散射圖。圖2P為動(dòng)員后外周血采集液經(jīng)稀釋后的反應(yīng)液中有核細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)556/ul。
圖3X為動(dòng)員后外周血采集液經(jīng)稀釋后的反應(yīng)液中造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)6/ul。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例I :調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法，它包括如下步驟(I)準(zhǔn)備抗凝新鮮正常人外周血O. 5mL，動(dòng)員后外周血采集液O. 5mL ；(2)流式細(xì)胞儀開(kāi)機(jī)后首先進(jìn)行儀器質(zhì)控，保持電子儀器工作狀態(tài)穩(wěn)定； (3)取正常人外周血50yL加500μ I生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀的中檔進(jìn)行測(cè)速，反復(fù)10次，記錄每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)，繪出測(cè)速所得的上下限范圍；(4)取動(dòng)員后外周血采集液50μ L加500 μ L生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀中檔進(jìn)行測(cè)速，反復(fù)10次，記錄每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)；(5)將步驟(4)的得到的細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)與步驟(3)得到的細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，確定動(dòng)員后外周血采集液在造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)分析中應(yīng)稀釋的倍數(shù)，倍數(shù)的計(jì)算方法為步驟(4)得到的外周血采集液每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)除以步驟(3)得到的正常人外周血每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取整數(shù)即為稀釋的倍數(shù)；(6)取稀釋后的動(dòng)員后外周血采集液50μ L加500 μ L生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀中檔進(jìn)行測(cè)速，當(dāng)采集液最終的細(xì)胞數(shù)落在步驟第(3)測(cè)速所得的上下限范圍內(nèi)時(shí)，則該濃度采集液就可以進(jìn)行造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)；(7)進(jìn)行造血干細(xì)胞⑶34絕對(duì)計(jì)數(shù)的常規(guī)操作流程(7a)分別向已編好號(hào)的試管中加入單克隆抗體⑶45和⑶34試劑各5 μ L，加步驟
(6)確定好的取稀釋后的動(dòng)員后外周血米集液50 μ L,混勾室溫避光反應(yīng)20分鐘；(7b)加0PTILYSE 250 μ L，混勻室溫避光放置10分鐘；(7c)加pH7 7. 2的PBS緩沖液250 μ L，靜置5分鐘；(7d)加 FLOW COUNT 50 μ L ；(7e)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果動(dòng)員后外周血采集液經(jīng)稀釋后的反應(yīng)液中有核細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)556/μ L,得出實(shí)際動(dòng)員后外周血有核細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)556/μ LX200 ;動(dòng)員后外周血采集液經(jīng)稀釋后的反應(yīng)液中造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)6/μ L,得出實(shí)際動(dòng)員后外周血造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)6/μ LX200 ο
權(quán)利要求
1.調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法，其特征在于，它包括如下步驟 (1)準(zhǔn)備抗凝新鮮正常人外周血O.5mL，動(dòng)員后外周血采集液O. 5mL ； (2)流式細(xì)胞儀開(kāi)機(jī)后首先進(jìn)行儀器質(zhì)控，保持電子儀器工作狀態(tài)穩(wěn)定； (3)取正常人外周血50μ L加500 μ I生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀的中檔進(jìn)行測(cè)速，反復(fù)10次，記錄每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)，繪出測(cè)速所得的上下限范圍； (4)取動(dòng)員后外周血采集液50μL加500 μ L生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀中檔進(jìn)行測(cè)速，反復(fù)10次，記錄每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)； (5)將步驟(4)的得到的細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)與步驟(3)得到的細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，確定動(dòng)員后外周血采集液在造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)分析中應(yīng)稀釋的倍數(shù)； (6)取稀釋的動(dòng)員后外周血采集液50μ L加500 μ L生理鹽水放入同一上機(jī)管中，采用流式細(xì)胞儀中檔進(jìn)行測(cè)速，當(dāng)采集液最終的細(xì)胞數(shù)落在步驟第(3)測(cè)速所得的上下限范圍內(nèi)時(shí)，則該濃度采集液就可以進(jìn)行造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)； (7)進(jìn)行造血干細(xì)胞⑶34絕對(duì)計(jì)數(shù)的常規(guī)操作流程。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法，其特征在于，步驟(5)中，動(dòng)員后外周血采集液在造血干細(xì)胞CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)分析中應(yīng)稀釋的倍數(shù)的計(jì)算方法為步驟(4)得到的外周血采集液每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)除以步驟(3)得到的正常人外周血每秒通過(guò)的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取整數(shù)即為稀釋的倍數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法，其特征在于，步驟(7)中，造血干細(xì)胞⑶34絕對(duì)計(jì)數(shù)的常規(guī)操作流程包括如下步驟 (7a)分別向已編好號(hào)的試管中加入單克隆抗體⑶45和⑶34試劑各5 μ L，加步驟(6)確定好的取稀釋后的動(dòng)員后外周血米集液50 μ L,混勾室溫避光反應(yīng)20分鐘； (7b)加OPTILYSE 250 μ L，混勻室溫避光放置10分鐘； (7c)加pH7 7. 2的PBS緩沖液250 μ L，靜置5分鐘；(7d)加 FLOW COUNT 50 μ L ； (7e)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種調(diào)整反應(yīng)細(xì)胞濃度的流式細(xì)胞測(cè)速方法。該方法通過(guò)對(duì)動(dòng)員后采集液與設(shè)立的對(duì)照組外周血分別在流式細(xì)胞儀上所測(cè)得的流速進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而調(diào)整動(dòng)員后采集液的反應(yīng)細(xì)胞濃度在適宜范圍，從而達(dá)到精確測(cè)定造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的目標(biāo)。該方法具有不增加任何成本，快速簡(jiǎn)便、易于操作，提高檢測(cè)精確度和成功率的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)G01N15/14GK102879319SQ20121039425
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者許旭欣, 吳曉柳, 戴立玲, 沈宗麗, 吳良偉 申請(qǐng)人:許旭欣