專利名稱：一種花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法。
背景技術(shù)：
花椒(Zanthoxylum spp.)系蕓香科、花椒屬植物,全世界約250種,分布于亞洲、美洲、非洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。研究表明，花椒(這里指花椒果實的果皮，以下與此同意)的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、生物堿、脂肪酸酰胺、木質(zhì)素、香豆素和脂肪酸等；以花椒素為代表的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺是花椒特有的辛麻味成分，該類具有麻味的酰胺有8種、并統(tǒng)稱為麻味素(以下簡稱總酰胺或麻味素)。長期以來，花椒品質(zhì)的界定沒有ー個統(tǒng)一、科學(xué)的標準，其原因就在于未能找到ー種快速、準確的麻味素類物質(zhì)檢測方法。因此，研究花椒麻味素含量的快速檢測方法，并針對不同產(chǎn)地不同花椒品種麻味素含量特征建立 數(shù)據(jù)庫，對建立花椒的質(zhì)量評價體系、質(zhì)量標準及品質(zhì)的地理區(qū)劃有著重要意義?；ń仿槲端仡?總酰胺)物質(zhì)的測定和分析方法包括高效液相色譜分析、分光光度法、反相高效液相色譜法、GC-MC測定法、紅外光譜法、薄層層析法、色差儀技術(shù)、微生物法等。但或因需要8種麻味酰胺的標準樣、或分析儀器昂貴、或提取與檢測操作繁瑣、或穩(wěn)定性與可靠性差等原因，而難以在花椒質(zhì)量的常規(guī)檢測中使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法，該方法是ー種快速、準確的麻味素檢測方法。其具體技術(shù)方案為一種花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法，包括以下步驟I)總酰胺浸膏的提取粉碎待測花椒，提取溶劑用95%こ醇。稱取花椒粉末10. 00g，放入500ml三角瓶中，提取時間為I 4h，液料比為I : 5 I : 15，提取溫度為30 50°C，提取物用布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，稱重所得浸膏留用。2)酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮取步驟I)所得浸膏3. 00g，加入球型冷凝器的錐形瓶中后用15mlこ醇溶解，再加入20ml的50%濃H2S04、120°C下用磁力攪拌器攪拌，硝化反應(yīng)25min，反應(yīng)完全后加2g顆粒狀活性炭，100°C下用球型冷凝器加熱回流脫色30min，趁熱過濾，濾液用蒸餾水定容至250ml留用。3)銨態(tài)氮含量測定取步驟2)所得濾液50ml放入250ml錐形瓶，加入2 3滴甲基紅指示劑，用Imol/L NaOH溶液滴定至呈現(xiàn)黃色，PHS-3B計酸度測定使pH 6，以除去濾液中的剰余酸；然后加入IOml的18% (1+1)除酸甲醛，2 3滴酚酞指示劑后充分搖勻，靜置5min后用準確標定0. 0982mol/L NaOH溶液滴定至橙紅色，并保持0. 5min內(nèi)不褪色即為終點，PHS-3B酸度計測定使pH 9，記錄所用0. lmol/L NaOH溶液體積，該測定重復(fù)3次。步驟I)中所述提取時間為2. 5h，液料比為I : 10，提取溫度為50°C。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明建立了花椒麻味素類物質(zhì)含量的快速檢測技木、即甲醛滴定法，與目前國內(nèi)外的測定方法相比較，本方法所使用的設(shè)備易得、檢測成本較低廉，操作簡單、快捷，且能夠準確檢測出花椒所含的總酰胺含量。


圖I為液相色譜測定值q與滴定法測定值r擬合曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進ー步詳細地說明。 I)材料與方法測定原理花椒中含氮的成分有麻味素酰胺、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、生物堿等，在提取麻味素酰胺時為避免或減少同時提取出其他含氮成分，應(yīng)選用こ醇作為提取溶劑。提取出浸膏后，用濃硫酸進行硝化反應(yīng)可將酰胺態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚴褂玫味ǚz測的銨態(tài)氮NH4+，而浸膏中其他含氮成分如氨基酸、蛋白質(zhì)中的氮則被濃硫酸分解為N3+，不會對下一步測定花椒總酰胺含量產(chǎn)生影響。但由于NH4+酸性太弱(Ka = 5. 6X 10_1(1)，不能用NaOH標準溶液直接滴定，而應(yīng)采用甲醛法進行測定。樣品、主要試劑和儀器儀器CHJ-I磁力恒溫攪拌器，KQ-100數(shù)控超聲波清洗器，萬分之ー電子天平，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，PHS-3B酸度計，300ml/14*2球型冷凝器ー套。LC-10A分析型高效液相色譜儀(日本島津公司)。試劑鄰苯ニ甲酸氫鉀(KHC8H4O4，分子量204. 23)，lmol/L NaOH溶液，95%こ醇，18%甲醛溶液，50 %濃H2SO4(濃硫酸是指濃度大于或等于70%的硫酸溶液)，準確標定0. 0982mol/L的NaOH溶液，18% (1+1)除酸甲醛，酚酞指示劑，甲基紅指示劑，pH = 5. 0 7. 0的顆粒狀活性炭，蒸餾水。樣品花椒麻味素粗品(江津、蘭州、茂汶)由重慶四面山花椒公司提供。產(chǎn)自江津、茂汶、蘭州的花椒樣品及14種產(chǎn)地的花椒?；ń仿槲段镔|(zhì)標準品由西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院提供。2)花椒中總酰胺含量的測定總酰胺浸膏的提取粉碎待測花椒，提取溶劑用95%こ醇，每處理稱取花椒粉末樣T1 = lO.OOg、放入500ml三角瓶中，設(shè)置9個處理的L9(34)正交設(shè)計，即提取時間A(lh、2.511、411)，液料比8(1 5、I 10、I 15)，提取溫度((30で、40で、50で)，以選擇最佳的超聲波提取條件。提取物用布氏漏斗抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，稱重所得浸膏T2 (g)留用。試驗結(jié)果采用方差分析方法及SPASS統(tǒng)計軟件分析。酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮取上述浸膏T3 = 3. OOg,加入球型冷凝器的錐形瓶中后用15mlこ醇溶解，再加入20ml的50%濃H2S04、120°C下用磁力攪拌器攪拌、硝化反應(yīng)25min。反應(yīng)完全后加2g顆粒狀活性炭，100°C下用球型冷凝器加熱回流脫色30min，趁熱過濾，濾液用蒸餾水定容至Vl = 250ml留用。銨態(tài)氮含量測定取上述濾液V2 = 50ml放入250ml錐形瓶，加入2 3滴甲基紅指示劑，用lmol/L NaOH溶液滴定至呈現(xiàn)黃色(PHS-3B計酸度測定使pH 6)，以除去濾液中的剩余酸；然后加入IOml的18% (1+1)除酸甲醛、2 3滴酚酞指示劑后充分搖勻，靜置5min后用準確標定0. 0982mol/L NaOH溶液滴定至橙紅色，并保持0. 5min內(nèi)不褪色即為終點(PHS-3B酸度計測定使pH ^ 9)，記錄所用0. lmol/L NaOH溶液體積%。該測定重復(fù)3次。3)驗證實驗分別對重慶四面山花椒公司 提供麻味素粗品(由江津、蘭州、茂汶花椒所提取)，采用液相色譜和滴定法檢測其總酰胺含量，以驗證和校正滴定法檢測結(jié)果。液相色譜檢測以花椒麻味素標準品為標樣，采用高效液相色譜法檢測。滴定法檢測稱取花椒麻味素粗品(江津、蘭州、茂汶)T4た0. 5g，加入45mlこ醇溶液，待溶解完全后，濾除不溶性雜質(zhì)。加入20ml的50%濃％304，在120で下消化反應(yīng)251^11，反應(yīng)完成后加入約Ig活性炭，加熱回流脫色30min,濾紙過濾,定容至V1 = 250ml。取V2'=25ml溶液3份，各加入2 3滴甲基紅指示劑，其余方法與銨態(tài)氮含量測定方法相同，該方法也適宜測定花椒油中酰胺類麻味物質(zhì)的含量。4)花椒中酰胺類麻味物質(zhì)含量計算滴定法測定每克花椒粉末樣品中總酰胺含量Q(mg/g)=a[( E VSi/3) XCX 14. 0067XbXT2]/(T1XT3);滴定法測定時，驗證實驗中每克樣品中花椒麻味素粗品的總酰胺含量Q' (mg/g) = a[VNa0H_iXCX 14. 0067Xb' ]/T4,該式也適宜計算花椒油中酰胺類麻味物質(zhì)的含量。式中，V3i為銨態(tài)氮含量測定中消耗的NaOH溶液體積(ml)，C為NaOH溶液的準確標定濃度，T1為花椒粉末樣重(g)，T2為T1花椒粉末樣所得浸膏重(g)，T3為酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮時的浸膏重(g)，T4為驗證實驗中花椒麻味素粗品用量(ghV-H為驗證實驗中消耗的NaOH溶液體積(ml)，14. 0067為N的分子量，a為系統(tǒng)誤差矯正系數(shù)，b = V1A2, b' = V1/V。5)結(jié)果與分析花椒總酰胺超聲波提取條件花椒總酰胺超聲波提取的L9 (34)正交實驗結(jié)果如表I。方差分析表明，A因素的顯著值P-value = 0. 318, B因素的顯著值P-value = 0. 341, C因素的顯著值P-value =0. 046'即，時間和料液比對花椒總酰胺的提取效果無顯著影響，而溫度對提取效果影響顯著。且影響次序為C > A > B。通過直觀分析，A因素應(yīng)選水平2，B因素應(yīng)選水平2，C因素應(yīng)選水平3，即，最佳提取組合為A2B2C3，因此，超聲波提取花椒酰胺的最佳條件為50°C，料液比為I : 10，提取2. 5h。表I花椒總酰胺超聲波提取條件試驗方案及結(jié)果
試驗號 A時間(h) B料液比(g/ml) C溫孝(0C)空白浸膏質(zhì)量'^)提取率(％)
11(1.0)I (1:5)1(30)I3.054830.55
21(1.0)2(1:10)2(40)23.483334.83
31(1.0)3(1:15)3(50)34.782847.83
42(2.5)I (1:5)2(40)33.482534.83
52(2.5)2(1:10)3(50)I5.350453.50·62(2.5)3(1:15)1(30)23.318133.18
73(4.0)I (1:5)3(50)23.992939.93
83(4.0)2(1:10)1(30)33. 139931.40_ 93(4.0)3(1:15)2(40)I3.453934.54
EK111.320910.53029.512811.859134.0586
EK212.151011.973610.419710.7943
EK310.586711. 554814. 1261 _11.4052け…)
平 k,3.77363.51013.1709
均.k2 4.05033.99123.4732
值 k3 3.52893.85164.7087_
―極差 R_ 0. 5214 _0. 4811 _I. 5378 _ _驗證實驗結(jié)果滴定法與用液相色譜測定的花椒麻味素類物質(zhì)含量如表2。由圖I可知，滴定法測定值r與液相色譜測定值q之間存在系統(tǒng)誤差，其線型關(guān)系符合q = 2. 2696ff/ (R2 =0. 9781)，即采用滴定法檢測花椒總酰胺含量時，應(yīng)使用校正系數(shù)2. 2696對其測定值進應(yīng)校正。分別對滴定法校正值、液相色譜測定值采用一個樣本的K-S檢驗表明，滴定法校正值的顯著值P-value = 0. 626，液相色譜測定值的顯著值P-value = 0. 268，所以兩者都服從泊松分布(表示單位時間內(nèi)隨機時間發(fā)生的次數(shù))。再對滴定法校正值與液相色譜測定值進行配對樣本T檢驗，得到顯著值P-value = 0. 866，即液相色譜測定值與滴定法校正值間無差異。表2滴定法與液相色譜測定結(jié)果比較

花椒麻味素消耗0. lmol/L NaOH 滴定法測定值高效液相色譜測滴定法校正值Q'
(g) #IR VNB0 -i (ml) _ ず(rag/g) 定值 q (mg/g) 2.2696 W' (mg/g) 江津 1.15 31.2975 71.0000 71.0328 (0.5054g) I. 17 31.8418 72.0000 72.2681 I. 12 30.4811 70.0000 69.1799 茂汶 0.84 22.5882 50.0000 51.2662 (0.5115g) 0.86 23.1260 50.0000 52.4868 0.85 22.8571 50.0000 51.8765 蘭州 0. 70 18.8825 44.0000 42.8557 (0.5099g) 0.69 18.6128 45.0000 42.2436 _0. 70_ 18. 8825 _45.0000 _42. 8558 _不同產(chǎn)地花椒麻味素類物質(zhì)含量來自全國各地14種花椒中的總酰胺含量測定結(jié)果如表3。從表3可以看出，不同花椒產(chǎn)區(qū)的花椒總酰胺的含量是有較大差異，但花椒麻味物質(zhì)即總酰胺的含量在高山區(qū)紅椒(韓城、山東青島嶗山、甘肅隴南康縣、陜西洛南、西藏朗縣)較高于低山區(qū)(山西芮城、云南昆明、寶雞鳳縣、湖北恩施來鳳縣、山東淄博博山)及青花椒，青花椒的總酰胺含量也以高山區(qū)的較高。表3不同產(chǎn)地花椒中的總酰胺含量
權(quán)利要求
1.一種花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 1)總酰胺浸膏的提取 粉碎待測花椒，提取溶劑用95%乙醇，稱取花椒粉末10. 00g，放入500ml三角瓶中，提取時間為I 4h，液料比為I : 5 I : 15，提取溫度為30 50°C，提取物用布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，稱重所得浸膏留用； 2)酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮 取步驟I)所得浸膏3. 00g，加入球型冷凝器的錐形瓶中后用15ml乙醇溶解，再加入20ml的50%濃H2S04、120°C下用磁力攪拌器攪拌，硝化反應(yīng)25min，反應(yīng)完全后加2g顆粒狀活性炭，100°C下用球型冷凝器加熱回流脫色30min，趁熱過濾，濾液用蒸餾水定容至250ml留用； 3)銨態(tài)氮含量測定 取步驟2)所得濾液50ml放入250ml錐形瓶，加入2 3滴甲基紅指示劑，用lmol/LNaOH溶液滴定至呈現(xiàn)黃色，PHS-3B計酸度測定使pH 6，以除去濾液中的剩余酸；然后加入IOml的18% (1+1)除酸甲醛，2 3滴酚酞指示劑后充分搖勻，靜置5min后用準確標定0. 0982mol/L NaOH溶液滴定至橙紅色，并保持0. 5min內(nèi)不褪色即為終點，PHS-3B酸度計測定使pH ^ 9,記錄所用0. lmol/L NaOH溶液體積。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法，其特征在于，步驟I)中所述提取時間為2. 5h，液料比為I : 10，提取溫度為50°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法，其特征在于，花椒麻味素(總酰胺)含量的計算式為 Q(mg/g) = a [ ( Σ VSi/3) X CX 14. 0067 X b X T2] / (T1X T3)；花椒油中麻味素(總酰胺)含量的計算式為Q' (mg/g) = a[V__iXCX14· 0067Xbi ]/T4; 式中，V3i為銨態(tài)氮含量測定中消耗的NaOH溶液體積(ml)，C為NaOH溶液的準確標定濃度，T1為花椒粉末樣重(g)，T2為T1花椒粉末樣所得浸膏重(g)，T3為酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮時的浸膏重(g)，T4為驗證實驗中花椒麻味素粗品用量(g)，VNaraH為驗證實驗中消耗的NaOH溶液體積(ml)，14. 0067為N的分子量，a = 2. 2696、為系統(tǒng)誤差矯正系數(shù)，b = V1A2,b' =VV。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花椒麻味素類物質(zhì)含量快速檢測方法，包括以下步驟1)總酰胺浸膏的提??；2)酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮；3)銨態(tài)氮含量測定。本發(fā)明建立了花椒麻味素類物質(zhì)含量的快速檢測技術(shù)、即甲醛滴定法，與目前國內(nèi)外的測定方法相比較，本方法所使用的設(shè)備易得、檢測成本較低廉，操作簡單、快捷，且能夠準確檢測出花椒所含的總酰胺含量。
文檔編號G01N21/78GK102954961SQ20121041046
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者李孟樓, 李菲菲, 聶勛良, 聶勛杰 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)