檢測(cè)伏馬毒素的elisa試劑盒的制備及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明為檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及其檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的檢測(cè)。所述試劑盒包括：包被了伏馬毒素抗原的酶標(biāo)板、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮樣品稀釋液和濃縮洗滌液。伏馬素素檢測(cè)試劑盒的原理是固相間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)，把提取的樣品、酶標(biāo)二抗工作液和抗體工作液加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)孔中，孵育一段時(shí)間后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里將會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，加入終止液，顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。顯色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中伏馬毒素的含量成反比例關(guān)系。該方法可直接用于檢測(cè)玉米中的伏馬毒素。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種用于定量檢測(cè)堅(jiān)果、谷物和谷物產(chǎn)品中的伏馬毒素殘留量的ELISA試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]伏馬毒素(Fumonisins)是一組主要由串珠鍵刀菌ipusarium moniliforme)在一定溫度和濕度條件下繁殖所產(chǎn)生的真菌毒素。1988年，Gelderblom等首次從玉米中分離出伏馬毒素BI。伏馬毒素在自然界中分布廣泛，且危害性大，逐漸引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。目前，已發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素結(jié)構(gòu)類似物主要分為A、B、C、P四類，包括FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FPl 等。
[0003]伏馬毒素(B1，B2，和B3)是由鐮孢菌(霉)屬念珠菌產(chǎn)生的真菌毒素。在世界范圍內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了伏馬毒素污染玉米的現(xiàn)象。研究表明伏馬毒素可以誘發(fā)老鼠患肝癌，豬的肺水腫和馬的腦脊髓白質(zhì)病。在一些地區(qū)中玉米中伏馬毒素含量很高，在這些地區(qū)(比如中國(guó)和非洲)人的食道癌具有高發(fā)性。
[0004]研究證實(shí)伏馬毒素可致馬大腦白質(zhì)軟化癥(EL-EM )，神經(jīng)性中毒而表現(xiàn)意識(shí)障礙、失明和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重者甚至造成死亡。對(duì)豬造成肺水腫綜合征(PPE)，并能造成肝臟和食道損傷。伏馬毒素還可引起靈長(zhǎng)類動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化樣改變，誘發(fā)大鼠肝癌，與人類食道癌的發(fā)生也密切相關(guān)。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)與加利福尼亞環(huán)境保護(hù)機(jī)構(gòu)已宣布伏馬毒素為人類潛在的致癌物質(zhì)(2B級(jí)致癌物)。
[0005]基于伏馬毒素的污染范圍較廣，毒性作用也較大，許多國(guó)家和地區(qū)對(duì)伏馬毒素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。但目前國(guó)際上對(duì)于食品與飼料中伏馬毒素的限量及檢測(cè)方法尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。瑞典規(guī)定人類食物中伏馬毒素的限量為I mg/kg，美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)發(fā)布了供人類食用的玉米和玉米產(chǎn)品伏馬毒素的最高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素最高限量為2 mg/kg。同時(shí)，F(xiàn)DA的畜牧醫(yī)學(xué)中心(CVM)也發(fā)布了動(dòng)物飼料中伏馬毒素的最高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定其限量范圍為廣50 mg/kg。在FA0/WH0聯(lián)合會(huì)上關(guān)于食品添加劑的會(huì)議(2001年2月)中規(guī)定，伏馬毒素對(duì)人體的安全限量為每天攝入量按人體體重算FB1、FB2、FB3量不超過(guò)2 g/kg。FBI以低于最大限量為最好，對(duì)FB2、FB3的限制相對(duì)較寬。我國(guó)對(duì)此的相關(guān)法規(guī)也正在制定中。在出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)中，液相色譜法對(duì)伏馬毒素B1、B2的測(cè)定低限均為0.05 mg/kg，而酶聯(lián)免疫吸附法則推薦檢測(cè)低限為12 g Ag0這些行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法均可為我國(guó)制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。
[0006]免疫學(xué)技術(shù)具有敏感、特異、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，近年來(lái)已被應(yīng)用于伏馬毒素殘留檢測(cè)。目前伏馬毒素的免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒大多來(lái)自進(jìn)口，而國(guó)內(nèi)有關(guān)伏馬毒素的試劑盒的開發(fā)還相對(duì)落后。本發(fā)明旨在建立一種檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒，其檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的檢測(cè)。本發(fā)明提供了檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法。
[0008]檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法,包括酶標(biāo)板、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0009]檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品的制作、伏馬毒素單克隆抗體及其工作液的制備、伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
[0010]其進(jìn)一步特征在于:所述的伏馬毒素包被抗原是將伏馬毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將伏馬毒素抗原稀釋成1:10000比例，100 μ?ν孔，37°C放置2 h,取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 μ L/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0011]所述的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。
[0012]伏馬毒素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體工作液的制備:采用伏馬毒素人工抗原免疫兔所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:40000。
[0013]所述伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液的制備:用酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋成1:2000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0014]伏馬毒素的ELISA試劑盒的檢測(cè)方法，基于抗原抗體進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)，該方法包括以下步驟:
(1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有伏馬毒素抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ L/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中；
(4)加入伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液，50μ L/孔，然后加入伏馬毒素抗體工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ；
(5)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；
(6)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15~20min ；
(7)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；
(8)以標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中伏馬毒素的含量。[0015]其中，所述處理后的樣品是經(jīng)過(guò)以下處理的樣品:
(1)配制90%的甲醇溶液(每個(gè)樣品需要:4mL蒸餾水+36 mL甲醇)；
(2)研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過(guò)一個(gè)20目的濾網(wǎng))；
(3)稱量20g研磨過(guò)濾后的樣品加入40 mL 90%的甲醇溶液，樣品稀釋比為1:2 (w/
V);
(4)在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin ；
(5)靜置、用濾紙(Whatman#1)過(guò)濾5_10 mL以上處理的液體，收集濾液；
(6)以1:20的比例稀釋濾液(取0.1 mL濾液然后加入1.9 mL的蒸餾水或去離子水)，混勻待測(cè)。
[0016]本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法來(lái)檢測(cè)。用于檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的測(cè)定原理:樣品中的伏馬毒素與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過(guò)酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來(lái)判斷樣品中伏馬毒素的含量。如果樣品中的伏馬毒素含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒,其包括酶標(biāo)板、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0019]下面具體描述本發(fā)明中檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備。
[0020]伏馬毒素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備:
將伏馬毒素半抗原與載體蛋白BSA按12:1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入入碳二亞胺，攪拌I?2h，置室溫反應(yīng)24 h，最后用0.2 mol/L pH 7.6的PBS透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，即可得到伏馬毒素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
[0021]伏馬毒素抗體的制備:
選用3月齡健康大白兔，通過(guò)三次免疫，每次伏馬毒素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物免疫原用量為50 μ g/0.05 mL，每次免疫間隔時(shí)間為2周。初次免疫分別將免疫抗原與費(fèi)氏佐劑及不安全佐劑等量混合，勁部皮下多點(diǎn)注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注Λ 25 Pg伏馬毒素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫后第6 d耳靜脈取血，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定效價(jià)。取得較高效價(jià)后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后頸動(dòng)脈采全血，分離抗血清，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，制成凍干粉后于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022]酶標(biāo)伏馬毒素的制備:
將25%戊二醛用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋至5%，稱取5 mg HRP溶于0.5 mL 5%的戊二醛，37°C水浴結(jié)合2 h ;加入0.15 mol/L NaCl 1.0 mL，充分混勻后，置4°C預(yù)冷10 min ;加入無(wú)水乙醇2.4 mL,顛倒混合,立即1000 r/min離心10 min ;棄掉上清，沉淀用冷的75%乙醇洗一次，將離心管倒置，風(fēng)干；加入0.05 mol/L pH 9.6的CBS 0.5mL溶解沉淀物；將5 mg PEA抗體溶于0.5 mL 0.15 mol/LNaCl，再與醛化HRP溶液混合；力口Λ 1.0 mol/L pH 9.6的CBS溶液，調(diào)節(jié)pH至9.0?9.5，于4°C下，電磁攪拌結(jié)合24 h ;加入
0.1 mL 0.15 mol/L賴氨酸，以封閉殘留的醛基，終止反應(yīng)，放置于4°C下2 h ;將反應(yīng)物通過(guò)S印hadex G-200凝膠柱，用PBS洗脫，收集第一洗脫峰；或?qū)⒎磻?yīng)物裝入透析袋，用0.01mol/L pH7.2 PBS，4°C透析過(guò)夜并收集；即為酶標(biāo)記抗體(HRP-伏馬毒素)。
[0023]制備包被有伏馬毒素包被抗原的酶標(biāo)板:
酶標(biāo)板包被伏馬毒素抗原，包被抗原是將伏馬毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將伏馬毒素抗原稀釋成1:10000比例，100μ L/孔，37°C放置2 h,取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 μ L/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0024]所述的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL>20 ng/mL>50ng/mL、150 ng/mL。
[0025]所述的伏馬毒素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體工作液的制備:采用伏馬毒素人工抗原免疫兔所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成I =40000。
[0026]所述伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液的制備:用酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋成1:2000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0027]基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標(biāo)板XI塊(包被有偶聯(lián)抗原)；
(2)標(biāo)準(zhǔn)液X 6 瓶:(ImL/瓶)O ng/mL>5 ng/mL、10 ng/mL>20 ng/mL、50 ng/mL、150ng/mL ；
(3)酶標(biāo)二抗工作液7 mL ；
(4)抗體工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)終止液7 mL ；
(8)10X濃縮洗滌液20 mL;
使用本試劑盒時(shí)的注意事項(xiàng):
(1)室溫低于20°C或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20?25°C)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低；
(2)在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作；
(3)每加一種試劑前需將其搖勻；
(4)反應(yīng)終止液為2M鹽酸,避免接觸皮膚；
(5)不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試齊U，摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑； (6)儲(chǔ)存條件:保存試劑盒于2?8°C，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
(7)試劑變質(zhì)的跡象:發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。O標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630 nm)值小于0.5(A45CI nm<0.5)時(shí),表示試劑可能變質(zhì),請(qǐng)勿使用；
(8)該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
[0028]本發(fā)明伏馬毒素的ELISA試劑盒在檢測(cè)堅(jiān)果、谷物和谷物產(chǎn)品中的伏馬毒素殘留量中的應(yīng)用:
本發(fā)明的試劑盒用于檢測(cè)堅(jiān)果、谷物和谷物產(chǎn)品中的伏馬毒素殘留量時(shí)，通過(guò)以下步驟實(shí)施:樣品預(yù)處理、用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)、分析結(jié)果。
[0029](I)樣品預(yù)處理
配制90%的甲醇溶液(每個(gè)樣品需要:4 mL蒸餾水+36 mL甲醇)；研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過(guò)一個(gè)20目的濾網(wǎng))；稱量20 g研磨過(guò)濾后的樣品加入40 mL 90%的甲醇溶液，樣品稀釋比為1:2(w/v);在密封的容器里混合，震蕩渦旋I min ;靜置、用濾紙(Whatman #1)過(guò)濾5_10 mL以上處理的液體，收集濾液；以1:20的比例稀釋濾液(取0.1mL濾液然后加入1.9 mL的蒸餾水或去離子水)，混勻待測(cè)。
[0030](2)用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)上述樣品中伏馬毒素殘留量
取包被有伏馬毒素抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ L/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中；加入伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液，50 μ L/孔，然后加入伏馬毒素抗體工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ;小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260 μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干；加入底物液A 50 μ L/孔,底物液B 50 μ L/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15?20min ;加入終止液50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；對(duì)比待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值大小，定量分析待測(cè)樣品中的伏馬毒素的殘留量。
[0031](3)分析結(jié)果
用上述制備的試劑盒中的6個(gè)伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、50 ng/mL> 150 ng/mL,在 450/630 nm 處測(cè)量吸光度值。
[0032]百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，SP
百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0-O ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。
[0033]以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)附圖1。Y= — 19.495X+101.84，R2=0.9989。將樣本的BziBci值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出所對(duì)應(yīng)樣本的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中伏馬毒素的實(shí)際濃度。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，包括酶標(biāo)板、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
2.檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品的制作、伏馬毒素單克隆抗體及其工作液的制備、伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述伏馬毒素的檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的伏馬毒素包被抗原是將伏馬毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將伏馬毒素抗原稀釋成1:10000比例，100 μ L/孔，37°C放置2 h,取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 μ L/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述伏馬毒素的檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、150 ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述伏馬毒素的檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的伏馬毒素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體是采用伏馬毒素人工抗原免疫兔所得，該抗體工作液用 抗體稀釋液稀釋成1:40000。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述伏馬毒素的檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，其特征在于:所述的伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液用酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋成1:2000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
7.權(quán)利要求2所述的檢測(cè)伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測(cè)方法，基于抗原抗體進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)，該方法包括以下步驟: (1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液工作液中； (2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻； (3)取包被有伏馬毒素抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ L/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中； (4)加入伏馬毒素酶標(biāo)二抗工作液，50μ L/孔，然后加入伏馬毒素抗體工作液，50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ； (5)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)； (6)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15~20 min ； (7)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))； (8)以標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中伏馬毒素的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述處理后的樣品是經(jīng)過(guò)以下處理的樣品: (1)配制90%的甲醇溶液(每個(gè)樣品需要:4mL蒸餾水+36 mL甲醇)； (2)研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過(guò)一個(gè)20目的濾網(wǎng))；(3)稱量20g研磨過(guò)濾后的樣品加入40 mL 90%的甲醇溶液，樣品稀釋比為1:2(w/V); (4)在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin ； (5)靜置、用濾紙(Whatman#1)過(guò)濾5_10 mL以上處理的液體，收集濾液； (6)以1:20的比例稀釋濾液(取0.1 mL濾液然后加入1.9 mL的蒸餾水或去離子水)，混勻待測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103792356SQ201210433003
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月4日
【發(fā)明者】杜道林, 洪霞 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司