專利名稱：一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，特別是利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián) 用儀同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇含量的方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是一種寄生真菌，學(xué)名為蝙蝠蛾被毛孢，寄生于生長在高海拔的對鱗翅目的幼蟲，在中國已被作為食品和草藥用于治療各種疾病。它不僅可以作為一種珍貴的藥物，用來治療許多疾病，如咳嗽、肺和腎臟的功能紊亂，據(jù)最近的報道，還可作為一種抗衰老的保健滋補食品。冬蟲夏草被證明含有蟲草素、腺苷、甘露醇、肌苷、腺嘌呤、蟲草素多糖等主要生物活性成分，具有抗氧化、增強免疫力和調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的功效，特別是其中三個最重要的活性成分蟲草素、腺苷、甘露醇，可視為冬蟲夏草的質(zhì)量評價的指標(biāo)。許多研究報道指出，人工的蟲草菌絲也具有相似的化學(xué)成分、藥理作用和臨床療效，能夠替代天然的冬蟲夏草，而且一些不法商販將一些替代品如蛹蟲草和添加劑進(jìn)行銷售，使市場魚龍混雜，使人們的身體健康及生命財產(chǎn)受到了傷害，因此，蟲草及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制是非常重要的，急需一些快速、有效的檢測方法來確保其安全和功效。目前腺苷成分含量是利用薄層色譜法、高效液相色譜和毛細(xì)管電泳來檢測的，但靈敏度低、選擇性差和耗用時間長。甘露醇的定量方法主要報道如氧化還原法、高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜掃描等。黃光裕等曾采用LC/ESI-MS法，以2-氯腺苷為內(nèi)標(biāo)物來測量冬蟲夏草中腺苷的含量(Huang LF, Liang YZ, Guo FQ, Zhou ZF, Cheng BM.Simultaneous separation and determination of active components in Cordycepssinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS. J Pharm Biomed Anal 2003 Dec4;33(5):1155-62.)，但此種方法一次只能測量一種組分，不能同時檢測蟲草素、腺苷、甘露醇，并且耗時長，靈敏度不高。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述方法的不足，本發(fā)明提供了一種用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇含量的方法，與以上方法相比具有分離能力強、定性分析結(jié)果準(zhǔn)確、檢測限低、分析時間快等優(yōu)點。所采用的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供了一種利用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀快速、同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，包括以下步驟
(一)樣品處理
精確稱取冬蟲夏草樣本的菌絲體粉O. 50 g，均勻研磨和混合，在IOml容量瓶瓶中用超純水定容，水浴超聲提取30分鐘，然后用O. 45 μ m過濾膜過濾，所得濾液用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測定；
(二)高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀的測定條件
(1)液相條件色譜柱為Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2. I mm, i. d. 5μπι);柱溫為30°C，進(jìn)樣量為5μ I ;流動相為0.05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速為 O. 2 ml/min ；
(2)質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，蟲草素、腺苷采用正電離模式，甘露醇采用負(fù)電離模式；保護(hù)氣體為氮氣，流速為40 A. U.;輔助氣體為氦氣,流速為5 A. U.;毛細(xì)管溫度為350°C，噴霧電壓為4. O kV,毛細(xì)管電壓是28 V ;ESI接口和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳；選擇性離子檢測模式(SIM)進(jìn)行質(zhì)譜采集； (三)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品腺苷、蟲草素、甘露醇適量，用超純水溶解使腺苷、蟲草素濃度為100mg/L,甘露醇濃度為500mg/L，作為貯備液；然后分別適量儲備液，用純水稀釋，依次配置腺苷和蟲草素濃度均為 10. O mg/L、20.0 mg/L、30. O mg/L、40. O mg/L、50. O mg/L,甘露醇濃度為 100. O mg/L,200. O mg/L、300. O mg/L,400. 0 mg/L、500. 0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣IOul在所述色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以各組分的峰面積對濃度作回歸分析，得到峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(四)數(shù)據(jù)的分析
測得蟲草素的線性范圍為1-50 μ g/ml，腺苷的線性范圍為0-500 yg/ml，甘露糖醇的線性范圍為1-50 μ g/ml，三種成分的回收率從95. 2%到103. 9%，腺苷、蟲草素、甘露醇的檢出限分別為 O. 16 μ g/ml, O. 23 μ g/ ml、7. 3 μ g/ml。本發(fā)明將色譜對樣品的高分離能力，與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，具有分離能力強、定性分析結(jié)果準(zhǔn)確、檢測限低、分析時間快等優(yōu)點。


圖I為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品的蟲草素、腺苷、甘露醇的質(zhì)譜圖。圖2為本發(fā)明樣品的蟲草素、腺苷、甘露醇的質(zhì)譜圖。圖3為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品中的蟲草素、腺苷、甘露醇色譜圖。圖4為本發(fā)明樣品的蟲草素、腺苷、甘露醇色譜圖。圖5為本發(fā)明蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為本發(fā)明腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為本發(fā)明甘露醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式I、實驗儀器及材料
(O儀器美國熱電公司生產(chǎn)的高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，型號為LCQ-Deca-XP,其配備的 LC 系統(tǒng)(Thermo Finnigan, San Jose, CA, U.S.A.),包括四兀泵、在線脫氣器、柱加熱器部分，自動取樣器和PDA(光電二極管陣列)檢測器和多級離子講質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan),其由一個ESI接口和一個離子講質(zhì)譜分析儀,數(shù)據(jù)處理和獲取通過 Xcalibur I. 3 工作站；Milli-Q 超純水系統(tǒng)((Millipore Inc, Billerica , MA，U. S. A.)；電子天平,高速離心機(jī),超聲儀；
(2)試劑甲醇(HPLC 級，Merck, Darmstadt, Germany);甲酸(分析級，Merck,Darmstadt, Germany);蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度> 99%)、冬蟲夏草菌絲體粉膠囊。2、樣品處理
精確稱取冬蟲夏草樣本的菌絲體粉O. 50 g，均 勻研磨和混合，在IOml容量瓶瓶中用超純水定容，水浴超聲提取30分鐘，然后用O. 45 μ m過濾膜過濾，所得濾液用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測定。3、高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀的測定條件
(1)液相條件色譜柱為Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2· I mm, i. d. 5μπι);柱溫為30°C，進(jìn)樣量為5μ I ;流動相為O. 05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速為 O. 2 ml/min ；
(2)質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，蟲草素、腺苷采用正電離模式，甘露醇采用負(fù)電離模式；保護(hù)氣體為氮氣，流速為40 A. U.;輔助氣體為氦氣，流速為5 A. U.;毛細(xì)管溫度為350°C，噴霧電壓為4. O kV,毛細(xì)管電壓是28 V ;ESI接口和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳；選擇性離子檢測模式(SIM)進(jìn)行質(zhì)譜采集。4、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品腺苷、蟲草素、甘露醇適量，用超純水溶解使腺苷、蟲草素濃度為100mg/L,甘露醇濃度為500mg/L，作為貯備液；然后分別適量儲備液，用純水稀釋，依次配置腺苷和蟲草素濃度均為 10. O mg/L、20.0 mg/L、30. O mg/L、40. O mg/L、50. O mg/L,甘露醇濃度為 100. O mg/L,200. O mg/L、300. O mg/L,400. 0 mg/L、500. 0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣IOul在所述色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以各組分的峰面積對濃度作回歸分析，得到峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、數(shù)據(jù)的分析
(1)SM模式和TIC質(zhì)譜圖標(biāo)準(zhǔn)品中的蟲草素(RT = 4. 31)、腺苷(RT = 3.88)和甘露醇(RT = 2.54)，如圖I所示。SM模式和TIC質(zhì)譜圖樣品中的蟲草素(RT = 4. 13)、腺苷(RT = 3.83)和甘露醇(RT = 2. 52)，如圖2所示。通過與標(biāo)準(zhǔn)的蟲草素、腺苷、甘露醇對比可判別樣品中的蟲草素、腺苷、甘露醇；
(2)樣品中的蟲草素的色譜峰保留時間(RT)在SIM模式下(質(zhì)量范圍267.00--269. 00)為4. 14分鐘，這與蟲草素標(biāo)準(zhǔn)的保留時間(4. 53分鐘)相似；樣品中的腺苷的色譜峰保留時間(RT)在SM模式下(質(zhì)量范圍251. 00 - -253. 00)為3. 83分鐘，這與腺苷標(biāo)準(zhǔn)的保留時間(3. 66分鐘)相似；樣品中的甘露醇的色譜峰保留時間(RT)在SIM模式下(質(zhì)量范圍180. 00 - -182. 00)為2. 52分鐘，這與甘露醇標(biāo)準(zhǔn)的保留時間(2. 54分鐘)相似,如圖3和圖4所示；
(3)如圖5、圖6和圖7所示，測得蟲草素的線性范圍為1-50μ g/ml，腺苷的線性范圍為0-500 μ g/ml，甘露糖醇的線性范圍為1-50 μ g/ml，所得峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為
蟲草素Y=l. 68925e+0. 07+1. 90848e+0. 07*X, R2=O. 9931 ；腺苷Y=5. 81761e+0. 06+1. 77824e+0. 06*X, R2=O. 9919 ；
甘露醇Y=-2. 01439e+0. 07+895246*X, R2=O. 9957 ；
測定的蟲草素，腺苷和甘露糖醇的樣品濃度平均值分別為1.09 mg/L, 37.2 mg/L和253 mg/L ；(4)腺苷蟲、草素和甘露醇的檢出限分別為O. 16 μ g/ml、0. 23 μ g/ ml和7. 3 μ g/ml,三種成分的回收率從95. 2%到103.9%。
權(quán)利要求
1.一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，其特征在于利用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中的蟲草素、腺苷、甘露醇。
2.如權(quán)利要求I所述一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，其特征在于包括以下步驟 (一)樣品處理 精確稱取冬蟲夏草樣本的菌絲體粉O. 50 g,均勻研磨、混合，在容量瓶中用超純水定容，水浴超聲提取30分鐘，然后用0.45 μ m過濾膜過濾，所得續(xù)濾液用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測定； (二)高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀的測定條件(1)液相條件色譜柱為Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2. I mm, i. d. 5μπι);柱溫為30°C，進(jìn)樣量為5μ I ;流動相為O. 05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速為 O. 2 ml/min ； (2)質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，蟲草素、腺苷采用正電離模式，甘露醇采用負(fù)電離模式；保護(hù)氣體(N2)，流速為40 A. U.;輔助氣體(He)，流速為5 A. U.;毛細(xì)管溫度為350°C，噴霧電壓為4. O kV,毛細(xì)管電壓是28 V ;ESI接口和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳； (三)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品腺苷、蟲草素、甘露醇適量，用超純水溶解使腺苷和蟲草素的濃度為100mg/L,甘露醇的濃度為500mg/L，作為貯備液；然后分別適量儲備液，用純水稀釋，依次配置腺苷和蟲草素濃度均為 10. O mg/L、20.0 mg/L、30. O mg/L、40. O mg/L、50. O mg/L,甘露醇濃度為 100. O mg/L,200. O mg/L、300. O mg/L,400. 0 mg/L、500. 0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣IOul在所述色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以各組分的峰面積對濃度作回歸分析，得到峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.如權(quán)利要求I或2所述的一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，其特征在于樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的測定采用選擇性離子檢測模式(SIM)進(jìn)行質(zhì)譜采集。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，特別是利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀來同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇含量的方法，包括樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的前處理、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的條件優(yōu)化及樣品測定、數(shù)據(jù)的分析等步驟，最終確定流動相為甲酸-甲醇混合物(94:6,v/v)，色譜柱為ThermoBioBasic-18PIONEER(150mm×2.1mm,i.d.5μm)，采用選擇性離子檢測模式(SIM)，對三個活性組分進(jìn)行定性、定量分析。本方法結(jié)合了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點，測定過程簡單快速，測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中的蟲草素、腺苷、甘露醇的分析檢測。
文檔編號G01N30/02GK102967670SQ20121047635
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者黃宏南 申請人:黃宏南