專利名稱：一種胰蛋白酶的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種胰蛋白酶的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶能夠催化水解靶蛋白中的特異性肽鍵，涉及調(diào)控重要的生理、病理過程。胰蛋白酶是一種由胰腺分泌的水解酶，可將肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基的羧基端切斷，胰蛋白酶在醫(yī)藥、食品及工業(yè)生產(chǎn)中均有應(yīng)用，能溶解變形蛋白質(zhì)，對(duì)未變性的蛋白質(zhì)無作用，能使膿液、痰液、血凝塊等分解、變稀，加速創(chuàng)面凈化，還有抗炎的作用；臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等；胰蛋白酶在促進(jìn)其他胰腺酶原活化，控制胰腺外分泌功能中具有重要作用；胰蛋白酶的升高是急性酒精 性胰腺炎最準(zhǔn)確的指示器；胰蛋白酶的缺乏或變異將會(huì)引起胎糞性腸梗塞、遺傳性胰腺炎等胰腺疾病。因此胰蛋白酶的檢測(cè)在健康、醫(yī)藥和食品質(zhì)量控制中具有重要的作用。現(xiàn)有技術(shù)中胰蛋白酶的檢測(cè)方法主要有熒光法、電化學(xué)法、比色法。熒光法一般需要選擇合適的熒光標(biāo)記物，并要對(duì)探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，電化學(xué)方法涉及復(fù)雜的電極修飾，步驟繁瑣。金屬與蛋白質(zhì)結(jié)合成為金屬納米簇，當(dāng)金屬納米簇與胰蛋白酶混合時(shí)，金屬納米簇中的蛋白質(zhì)被胰蛋白酶水解后與金屬分離，分離后的金屬粒子會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，溶液的顏色會(huì)發(fā)生改變，可通過比色來實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的檢測(cè)，如Lin等(Biomaterials, 2010, 31,6087-6095)將胰蛋白酶底物和1_巰基己醇吸附在金納米顆粒表面，當(dāng)胰蛋白酶水解底物，金納米顆粒的穩(wěn)定環(huán)境被破壞，產(chǎn)生聚集；Zhang等(Analyst, 2011,136, 3136-3141)基于短的聚精氨酸(Arg6)能夠誘導(dǎo)金納米顆粒聚集，而聚精氨酸被胰蛋白酶水解為小的片段后不能誘導(dǎo)金納米顆粒聚集。比色方法無需修飾和標(biāo)記，相對(duì)簡單，易于操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提出一種利用比色進(jìn)行胰蛋白酶檢測(cè)的方法，步驟簡單，易于操作。本發(fā)明提供了一種胰蛋白酶檢測(cè)方法，包括以下步驟將胰蛋白酶與核-殼型納米顆粒反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物；檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中核-殼型納米顆粒的吸光值；檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中金屬納米粒子的吸光值；計(jì)算金屬納米粒子的吸光值與核-殼型納米顆粒的吸光值的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-殼型納米顆粒為蛋白質(zhì)或多肽包被金屬納米粒子形成。 優(yōu)選地，所述的核-殼型納米顆粒選自多聚賴氨酸-金納米顆粒、多聚賴氨酸-銀納米顆粒、多聚精氨酸-金納米顆粒或多聚精氨酸-銀納米顆粒。優(yōu)選地，所述的反應(yīng)溫度為30_40°C。優(yōu)選地，所述的反應(yīng)時(shí)間為l_2h。
優(yōu)選地，所述的反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為2h。優(yōu)選地，所述的核-殼型納米顆粒中金屬的物質(zhì)的量與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為(5-50)μ moI : (5-50)mg。優(yōu)選地，所述的核-殼型納米顆粒中金屬的物質(zhì)的量與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為I μ mo I : Img0優(yōu)選地，所述的核-殼型納米顆粒按照以下方法制備將金屬離子和蛋白質(zhì)或多肽混合，得到混合溶液；將混合溶液放置于50-70°C下孵育O. 5_3h。優(yōu)選地，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。 本發(fā)明的胰蛋白酶檢測(cè)方法利用蛋白質(zhì)或多肽包被金屬形成核-殼型納米顆粒，既作為胰蛋白酶作用的底物，又作為顏色變化的指示劑，未加入胰蛋白酶時(shí)，溶液顯示的為核-殼型納米顆粒的顏色，當(dāng)與胰蛋白酶混合后，核-殼型納米顆粒表面的蛋白質(zhì)被水解，核-殼型納米顆粒結(jié)構(gòu)被破壞，金屬核心暴露并發(fā)生聚集，形成金屬納米粒子，溶液的顏色發(fā)生變化，核-殼型納米顆粒的顏色變淺，金屬納米粒子的顏色得到顯現(xiàn)，利用這兩種顏色吸光值的比值表征核-殼型納米顆粒的減少量，即蛋白質(zhì)被水解的量，即也表征胰蛋白酶的含量。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明提供的胰蛋白酶檢測(cè)方法操作簡單，且無需對(duì)探針進(jìn)行修飾或標(biāo)記。


圖I是實(shí)施例I中制備的核-殼型納米顆粒的紫外-可見吸收光譜。圖2是實(shí)施例I中制備的核-殼型納米顆粒的粒徑分布圖。圖3是實(shí)施例I中的胰蛋白酶濃度與吸光度比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4是實(shí)施例2中的胰蛋白酶濃度與吸光度比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5是實(shí)施例3中的胰蛋白酶濃度與吸光度比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖6是實(shí)施例5中胰蛋白酶檢測(cè)的特異性對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)實(shí)施例中的附圖，對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。本發(fā)明提供了一種胰蛋白酶的檢測(cè)方法，包括以下步驟將胰蛋白酶與核-殼型納米顆粒反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物；檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中核-殼型納米顆粒的吸光值；檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中金屬納米粒子的吸光值；計(jì)算金屬納米粒子的吸光值與核-殼型納米顆粒的吸光值的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-殼型納米顆粒為蛋白質(zhì)或多肽包被金屬形成。胰蛋白酶為蛋白水解酶的一種，能夠選擇性的水解蛋白質(zhì)，只作用于精氨酸和賴氨酸的羧基端，在醫(yī)藥、食品、工業(yè)生產(chǎn)中都有著廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明以核-殼型納米顆粒作為顏色變化的指示劑，利用胰蛋白酶水解核-殼型納米顆粒中的蛋白質(zhì)后金屬發(fā)生聚集形成金屬納米粒子，產(chǎn)生顏色變化，利用比色法對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法中所述的核-殼型納米顆粒優(yōu)選按照以下方法制備將金屬離子和蛋白質(zhì)混合，得到混合溶液；將混合溶液放置于50_70°C下孵育O. 5_3h。優(yōu)選地，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。核-殼型納米顆粒是一種由金屬作為核心，蛋白質(zhì)或多肽分子作為保護(hù)基團(tuán)組裝 而成的核-殼型納米顆粒，為水溶性，在可見光到近紅外光區(qū)范圍內(nèi)可發(fā)射光譜，還具有生物相容性好、光穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中金屬優(yōu)選為金離子或銀離子，更優(yōu)選為金離子，最優(yōu)選為氯金酸中的金離子；所述的蛋白質(zhì)或多肽優(yōu)選為多聚精氨酸或多聚賴氨酸，更優(yōu)選為多聚賴氨酸；所述的金屬的物質(zhì)的量與蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)量比優(yōu)選為(5-50) μ mol (5-50)mg，更優(yōu)選為(25-50) μ mo I : (25-50) mg,最優(yōu)選為 I μ mo I : Img。得到混合溶液后，將混合溶液置于50_70°C下孵育O. 5_3h，更優(yōu)選為65_70°C下孵育O. 5-3h，最優(yōu)選為65°C下孵育3h，反應(yīng)后得到本發(fā)明的核-殼型納米顆粒。得到核-殼型納米顆粒后，將胰蛋白酶與核-殼型納米顆粒混合，核-殼型納米顆粒優(yōu)選為多聚賴氨酸-金納米顆粒、多聚賴氨酸-銀納米顆粒、多聚精氨酸-金納米顆?；蚨嗑劬彼?銀納米顆粒，更優(yōu)選為多聚賴氨酸-金納米顆粒、多聚賴氨酸-銀納米顆粒，最優(yōu)選為多聚賴氨酸-金納米顆粒；胰蛋白酶與核-殼型納米顆粒混合反應(yīng)溫度采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的胰蛋白酶最適溫度，優(yōu)選為30-40°C，更優(yōu)選為37°C ;胰蛋白酶與核-殼型納米顆?；旌戏磻?yīng)時(shí)間優(yōu)選為l_2h，更優(yōu)選為2h。反應(yīng)完畢后，得到反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)核-殼型納米顆粒和金屬納米粒子的吸光值，所述的核-殼型納米顆粒測(cè)定波長優(yōu)選為核-殼型納米顆粒紫外-可見光吸收光譜中吸光值得到最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的波長，金屬納米粒子測(cè)定波長優(yōu)選為金屬納米粒子紫外-可見光吸收光譜中吸光值得到最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的波長。根據(jù)上述技術(shù)方案得到核-殼型納米顆粒和金屬納米粒子的吸光值后，計(jì)算所述金屬納米粒子與核-殼型納米顆粒吸光值的比值，根據(jù)所述比值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，得到胰蛋白酶的含量。其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線中金屬納米粒子與核-殼型納米顆粒吸光值的檢測(cè)與所述的技術(shù)方案中金屬納米粒子與核-殼型納米顆粒吸光值的檢測(cè)方法相同，按照一定的濃度梯度配置胰蛋白酶溶液，即為胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，將已知濃度的胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液與核-殼型納米顆?；旌戏磻?yīng)，計(jì)算各個(gè)濃度的胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)產(chǎn)物的金屬納米粒子與核-殼型納米顆粒吸光值的比值，根據(jù)金屬納米粒子與核-殼型納米顆粒吸光值的比值與胰蛋白酶濃度的對(duì)數(shù)作圖(胰蛋白酶濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，金屬納米粒子與核-殼型納米顆粒吸光值的比值為縱坐標(biāo))，進(jìn)行線性回歸分析，得到胰蛋白酶濃度與所述比值的線性方程。所述的胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置采用本領(lǐng)域人員熟知的胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置方案。所述的胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度優(yōu)選為(10-9-10-3) g/mL。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例試劑配置多聚賴氨酸溶液稱取多聚賴氨酸(分子量30000 70000) 5mg溶于ImL超純水中，分裝，凍存，備用。多聚賴氨酸溶液濃度為5mg/mL。聚精氨酸溶液稱取聚精氨酸(分子量30000 70000) 5mg溶于ImL超純水中，分裝，凍存，備用。聚精氨酸溶液濃度5mg/mL。氯金酸溶液將Ig三水合氯金酸溶于50mL超純水中，盛于棕色試劑瓶中，4°C保存，備用。氯金酸溶液濃度為O. 05mol/L。胰蛋白酶溶液稱取胰蛋白酶lmg，溶于ImL PBS(10mM,pH = 7. 4)中，分裝，凍存， 備用。胰蛋白酶溶液濃度為lmg/mL。牛血清白蛋白BSA溶液稱取BSA Img,溶于 ImL PBS(10mmol/L,pH = 7. 4)中，4°C保存，備用。BSA溶液的濃度為lmg/mL。實(shí)施例I取200 μ L，5mg/mL多聚賴氨酸溶液溶于780 μ L超純水中，取20 μ L，O. 05mol/L氯金酸溶液與多聚賴氨酸溶液溶混合，震蕩數(shù)秒，在65°C下，培育3h，即得到多聚賴氨酸包被的核-殼型納米顆粒。圖I為核-殼型納米顆粒的紫外-可見吸收光譜，核-殼型納米顆粒的最大吸收波長為530nm ;圖2所示為核-殼型納米顆粒的粒徑分布，所制備的核_殼型納米顆粒的粒徑約為20. 49nm。將lmg/mL胰蛋白酶溶液稀釋為胰蛋白酶終濃度分別為250 μ g/mL，10 μ g/mL，I U g/mL, 0. I μ g/mL, 0. 01 μ g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取50 μ L制得的核-殼型納米顆粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)體系的終體積為400 μ L，在37°C下，反應(yīng)2h，即可觀察到反應(yīng)前后溶液顏色的變化。實(shí)驗(yàn)得知，金屬納米粒子的最大吸收波長為600nm。本實(shí)施例中核-殼型納米顆粒呈粉紅色，由于多聚賴氨酸被水解，核-殼型納米顆粒的蛋白質(zhì)外殼被破壞，金屬發(fā)生團(tuán)聚形成金屬納米粒子，反應(yīng)后溶液呈紫色。將反應(yīng)后的溶液分別在600nm和530nm下檢測(cè)吸光值，并計(jì)算二者的比值。以胰蛋白酶質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示，本實(shí)施例中胰蛋白酶質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)與反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值之間正相關(guān)，線性回歸曲線方程為Y =
O.12071gC+l. 5478，R2為O. 9737，其中C為胰蛋白酶的質(zhì)量濃度，Y為反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值，線性范圍為10_4_10_8g/mL。本發(fā)明的胰蛋白酶檢測(cè)方法具有較高的靈敏度，檢測(cè)線可達(dá)10_8g/mL。實(shí)施例2取40 μ L, 5mg/mL多聚賴氨酸溶液溶于920 μ L超純水中，取40 μ L,0. 05mol/L氯金酸溶液與多聚賴氨酸溶液溶混合，震蕩數(shù)秒，在50°C下，培育O. 5h，即得到多聚賴氨酸包被的核-殼型納米顆粒。將lmg/mL胰蛋白酶溶液稀釋為胰蛋白酶終濃度分別為250 μ g/mL，10 μ g/mL，I μ g/mL, O. I μ g/mL, O. OI μ g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取50 μ L制得的核-殼型納米顆粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)體系的終體積為400 μ L，在30°C下，反應(yīng)2h，即可觀察到反應(yīng)前后溶液顏色的變化。將反應(yīng)后的溶液分別在600nm和530nm下檢測(cè)吸光值，并計(jì)算二者的比值。以胰蛋白酶質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4所示，本實(shí)施例中胰蛋白酶質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)與反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值之間正相關(guān)，線性回歸曲線方程為Y =
O.12581gC+l. 5517，R2為O. 8506，其中X為胰蛋白酶的質(zhì)量濃度，Y為反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值。實(shí)施例3·
取400 μ L, 5mg/mL多聚賴氨酸溶液溶于596 μ L超純水中，取4μ L,0. 05mol/L氯金酸溶液與多聚賴氨酸溶液溶混合，震蕩數(shù)秒，在70°C下，培育3h，即得到多聚賴氨酸包被的核-殼型納米顆粒。將lmg/mL胰蛋白酶溶液稀釋為胰蛋白酶終濃度分別為250 μ g/mL，10 μ g/mL，I U g/mL, 0. I μ g/mL, 0. 01 μ g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取50 μ L制得的核-殼型納米顆粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)體系的終體積為400 μ L，在40°C下，反應(yīng)lh，即可觀察到反應(yīng)前后溶液顏色的變化。將反應(yīng)后的溶液分別在600nm和530nm下檢測(cè)吸光值，并計(jì)算二者的比值。以胰蛋白酶質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示，本實(shí)施例中胰蛋白酶質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)與反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值之間正相關(guān)，線性回歸曲線方程為Y =
0.15741gC+l. 7239，R2為O. 8982，其中X為胰蛋白酶的質(zhì)量濃度，Y為反應(yīng)后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值。實(shí)施例4取50 μ L實(shí)施例I中制備的核-殼型納米顆粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶樣品，反應(yīng)體系的終體積為400 μ L，在37°C下，反應(yīng)2h，即可觀察到反應(yīng)前后溶液顏色的變化。將反應(yīng)后的溶液分別在600nm和530nm下檢測(cè)吸光值，并計(jì)算二者的比值為
1.0647。將比值代入到圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到胰蛋白酶樣品的濃度為100μ g/mL。實(shí)施例5取50 μ L實(shí)施例I中制備的核-殼型納米顆粒分散于250 μ L PBS溶液中，并加入100 μ L lmg/mL的胰蛋白酶溶液，反應(yīng)體系的終體積為400 μ L，在37°C下，反應(yīng)2h，即可觀察到反應(yīng)前后溶液顏色的變化。將反應(yīng)后的溶液檢測(cè)吸光值。對(duì)比例I取50 μ L實(shí)施例I中制備的核-殼型納米顆粒分散于250 μ L PBS溶液中，并加入100 μ L BSA溶液,反應(yīng)體系的終體積為400 μ L,在37°C下,反應(yīng)2h,即可觀察到反應(yīng)前后溶液顏色的變化。將反應(yīng)后的溶液檢測(cè)吸光值。對(duì)比例2取50 μ L實(shí)施例I中制備的核-殼型納米顆粒分散于250 μ L PBS溶液中，并加入100 μ L超純水,反應(yīng)體系的終體積為400 μ L,在37°C下,反應(yīng)2h,即可觀察到反應(yīng)前后溶液顏色的變化。將反應(yīng)后的溶液檢測(cè)吸光值。圖6為實(shí)施例5，對(duì)比例1，對(duì)比例2反應(yīng)后的溶液在不同波長下吸光值的變化，對(duì)比例I和對(duì)比例2在530nm處吸光值最大，沒有發(fā)生金屬團(tuán)聚，核_殼型納米顆粒表面的多聚賴氨酸沒有被水解；而實(shí)施例5在600nm處吸光值最大,實(shí)施例5發(fā)生了金屬團(tuán)聚,賴氨 酸被胰蛋白酶水解，對(duì)比例I中多聚賴氨酸不能被BSA水解，說明本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)胰蛋白酶有特異性。以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種胰蛋白酶檢測(cè)方法，包括以下步驟 將胰蛋白酶與核-殼型納米顆粒反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物； 檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中核-殼型納米顆粒的吸光值； 檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中金屬納米粒子的吸光值； 計(jì)算金屬納米粒子的吸光值與核-殼型納米顆粒的吸光值的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到胰蛋白酶的含量； 其中，所述的核-殼型納米顆粒為蛋白質(zhì)或多肽包被金屬形成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胰蛋白酶檢測(cè)方法，其特征在于，所述的核-殼型納米顆粒選自多聚賴氨酸-金納米顆粒、多聚賴氨酸-銀納米顆粒、多聚精氨酸-金納米顆?；蚨嗑劬?氨酸-銀納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胰蛋白酶檢測(cè)方法，其特征在于，所述的反應(yīng)溫度為30-40。。。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胰蛋白酶檢測(cè)方法，其特征在于，所述的反應(yīng)時(shí)間為l_2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胰蛋白酶檢測(cè)方法，其特征在于，所述的反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胰蛋白酶檢測(cè)方法，其特征在于，所述的核-殼型納米顆粒中金屬的物質(zhì)的量與蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)量比為(5-50) μ mol (5-50)mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的胰蛋白酶檢測(cè)方法，其特征在于，所述的核-殼型納米顆粒中金屬的物質(zhì)的量與蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)量比為Iymol Img0
8.—種權(quán)利要求I中所述的核-殼型納米顆粒的制備方法，包括以下步驟 將金屬離子和蛋白質(zhì)或多肽混合，得到混合溶液； 將混合溶液放置于50-70°C下孵育O. 5-3h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核-殼型納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核-殼型納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述金屬離子的物質(zhì)的量與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為(5-50) μ mol (5-50)mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胰蛋白酶檢測(cè)方法，步驟如下將胰蛋白酶與核-殼型納米顆粒反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物；檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中核-殼型納米顆粒的吸光值；檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中金屬納米粒子的吸光值；計(jì)算金屬納米粒子的吸光值與核-殼型納米顆粒的吸光值的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-殼型納米顆粒為蛋白質(zhì)或多肽包被金屬形成。本發(fā)明還提供了所述核-殼型納米顆粒的制備方法。本發(fā)明提供的胰蛋白酶檢測(cè)方法操作簡單，且無需對(duì)探針進(jìn)行修飾或標(biāo)記。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102944558SQ20121050608
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者蔡林濤, 武春雷, 張鵬飛, 粟武 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院