專利名稱：一種三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合了免疫磁微粒分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的三碘甲狀腺原氨酸(T3)的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法。
背景技術(shù)：
三碘甲狀腺原氨酸(3，5，3’-三碘甲狀腺原氨酸，T3)是一種分子量為651的碘化酪氨酸，與甲狀腺素(T3) —樣是一種重要的甲狀腺激素。T3、T3在循環(huán)中均有結(jié)合態(tài)和游離態(tài)兩種形式，正常情況下兩種形式之間保持著動態(tài)平衡。Τ3的測定對診斷甲狀腺機能紊亂和監(jiān)測甲狀腺機能低下非常有意義。對甲狀腺機能亢進(jìn)的病人來講，大多數(shù)患者的總Τ3和總Τ3的水平是一致的。不過在某些病例中，甲狀腺機能亢進(jìn)僅僅是由于Τ3的產(chǎn)生增多引起的(Τ3型甲亢癥)，因此在FT3 (血清游離甲狀腺素)正常的甲亢患者，建議檢測Τ3，尤其對于FT3和TSH (促甲狀腺激素)均正常的患者(一般患者常首先檢測FT3和TSH)，更應(yīng)進(jìn)一步檢測Τ3。嚴(yán)重甲狀腺機能減退患者的總Τ3水平通常偏低而中度甲狀腺機能減退患者總Τ3水平可能正常。非甲狀腺疾病的嚴(yán)重病人或是在術(shù)后，可見Τ3水平偏低而反Τ3的水平升高。新生兒及嬰兒的Τ3水平一般較高，但在某些老年病例中Τ3水平也會偏低。目前Τ3的檢測方法目前全部采用免疫學(xué)方法。臨床免疫檢測技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)原理檢測生物體內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)，該技術(shù)的引入使臨床化學(xué)檢驗發(fā)生了革命性的變化檢測項目不斷增加，方法的靈敏度更高、特異性更強，自動化程度更高。自上世紀(jì)80年代以后，免疫學(xué)檢測技術(shù)隨著單克隆抗體、人工合成多肽、基因工程表達(dá)抗原及各種標(biāo)記技術(shù)的成熟而迅速發(fā)展，放射免疫測定(RIA)和酶免疫測定(EIA)逐漸取代傳統(tǒng)的免疫沉淀和免疫凝聚，使檢測的敏感性、特異性都大大提高，隨后化學(xué)發(fā)光技術(shù)的應(yīng)用使免疫學(xué)檢測的敏感性和線性范圍得到進(jìn)一步的提高。這些技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用為疾病的定量檢測、療效觀察及病因探討提供了更直接和客觀的資料。Τ3是目前醫(yī)院開展的常規(guī)免疫檢測項目，對甲狀腺疾病的診斷有無可替代的重要參考價值。目前我國已批準(zhǔn)上市的Τ3免疫檢測試劑有進(jìn)口和國產(chǎn)兩大類，其中進(jìn)口試劑有貝克曼等跨國定量檢測公司的產(chǎn)品，采用的方法學(xué)多為化學(xué)發(fā)光，而國產(chǎn)試劑中采用的方法學(xué)多數(shù)為放免法，近兩年開始出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光類產(chǎn)品。放免分析法存在線性范圍窄、不易實現(xiàn)全自動化等方法學(xué)限制因素。而化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有靈敏度高、檢測線性范圍寬、操作簡便，自動化程度高等優(yōu)勢。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因其有上述諸多有點得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測物，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。
磁微粒免疫檢測技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點，在外加磁場作用下可定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。中國發(fā)明專利公開C N101949944A公開了一種了三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒及其制備方法，其中，試劑盒包括包被有二碘甲狀腺原氨酸-明膠的磁微?；鞈乙骸⑷饧谞钕僭彼嵯盗行?zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體、發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液及濃縮洗液。使用該專利公開的試劑盒成功利用了磁微粒免疫檢測技術(shù)實現(xiàn)了對三碘甲狀腺原氨酸的準(zhǔn)確檢測。然而，該試劑盒的制備成本和使用成本高，原因是，一方面，在進(jìn)行包被有二碘甲狀腺原氨酸-明膠的磁微?；鞈乙旱闹苽鋾r，不僅過程復(fù)雜，而且直接將二碘甲狀腺原氨酸-明膠包被于磁微粒上的包被率較低，導(dǎo)致較高的成本；另一方面，其采取辣根過氧化物酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體，該抗體的制備也是非常繁瑣，且標(biāo)記率低，限制其檢測效果和導(dǎo)致成本增加。此外，試劑盒在制備工藝上所存在的不易控和穩(wěn)定性較差的因素，除了導(dǎo)致如前所述的成本增加的問題外，還使得檢測的批間差大，限制了檢測方法的精密度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)三碘甲狀腺原氨酸準(zhǔn)確和高精確地定量測定。本發(fā)明同時還提供一種三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒的制備方法，該方法工藝穩(wěn)定，成本低，且所得試劑盒的精密度高。癌抗原所用的試劑盒的簡便和低成本的制備方法。一種三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括第一試劑含熒光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的溶液；磁分離劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。優(yōu)選地，該堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原由堿性磷酸酶與三碘甲狀腺原氨酸抗原通過交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯連接構(gòu)成。進(jìn)一步地，所述磁微粒試劑中，包被有熒光素抗體的磁微粒由熒光素抗體與磁微粒通過偶聯(lián)劑相化學(xué)偶聯(lián)。進(jìn)一步地，所述第一試劑中的熒光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的濃度為
O.5^1 μ g/mL，所述第一試劑的pH為7-9 ;所述第二試劑中的堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的濃度為O. 02、.1 μ g/mL，所述第二試劑的pH為7_9。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括有其它檢測所需的試齊U，例如底物溶液。但是諸如底物 溶液等其它試劑可以另行購買或配制，因此，雖然試劑盒中可以包括這些試劑，但它們對于本發(fā)明試劑盒來說并非必不可少。
本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是一種上述的三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述第一試劑、所述第二試劑以及磁分離劑的步驟，其中所述第二試劑的制備過程如下①使三碘甲狀腺原氨酸抗原與交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯在二甲基亞砜溶劑中，在室溫下反應(yīng)，使生成三碘甲狀腺原氨酸抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物，于2l°C下保存?zhèn)溆?，其中所述的三碘甲狀腺原氨酸抗原、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg ；②將含有堿性磷酸酶的緩沖液與步驟①所得溶液按照堿性磷酸酶與三碘甲狀腺原氨酸抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物的摩爾比為1:1.1 1. 3的比例混合，在室溫下反應(yīng)，使生成所述堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱除鹽，選擇具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得，其中堿性磷酸酶的緩沖液的濃度為O. 5^1. 5mg/ml。優(yōu)選地，步驟①中，取三碘甲狀腺原氨酸抗原，加入二甲基亞砜溶解該抗原至濃度為2(T50mg/mL，加入交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯，室溫反應(yīng)2 3小時，用二甲基亞砜將反應(yīng)液1:10稀釋，于21 °C下保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，步驟②中，取濃度大于等于5mg/ml的堿性磷酸酶的磷酸鹽緩沖液，用PHflO的碳酸氫鈉緩沖液稀釋至O. 5^1. 5mg/ml，加入步驟①所得反應(yīng)液，室溫靜置反應(yīng)20 60mino 進(jìn)一步地，所述的第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為擴10的緩沖液，然后按照熒光素與三碘甲狀腺原氨酸抗體的分子比為2(Γ200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為9 10的緩沖液與三碘甲狀腺原氨酸抗體的pH為9 10的緩沖液混合,混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得所述的第一試劑。其中適當(dāng)PH值的緩沖液可以為例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。進(jìn)一步地，所述磁分離劑的制備方法如下將含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)2 18小時，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述的磁分離劑。其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5^2 μ m,每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價大于1:100萬。優(yōu)選地，上述的具有適當(dāng)pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。本發(fā)明所述的熒光素可以是已知的各種熒光素，常用的有例如異硫氰酸熒光素，四乙基羅丹明，四甲基異硫氰酸羅丹明等。本發(fā)明同時還提供了一種采用上述的試劑盒應(yīng)用于三碘甲狀腺原氨酸定量檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)免疫反應(yīng)在檢測管中加入待測樣本原液，依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在25 40°C下進(jìn)行第一次溫育，然后加入磁分離試劑，混勻，在25 40°C下進(jìn)行第二次溫育；(2)洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；(3)加底物溶液檢測發(fā)光強度在檢測管中加入堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物，去除磁場，充分混懸后檢測發(fā)光強度值。進(jìn)一步地，步驟(I)中所述第一次溫育的時間可以為5 30mi n，通常為15min ；第二次溫育的時間可以為2"!Omin,通常為5min。由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點1.申請人發(fā)現(xiàn)，采取辛二酸二琥珀酰亞胺酯作為交聯(lián)劑進(jìn)行堿性磷酸酶和三碘甲狀腺原氨酸抗原的偶聯(lián)時，具有和其它交聯(lián)劑相比更高的偶聯(lián)效率，在降低制備成本的同時，有利于提高檢測效果。因此，本發(fā)明的試劑盒中的三種試劑均可以通過穩(wěn)定的制備工藝制備得到，生產(chǎn)成本低，且由于制備工藝的穩(wěn)定性，試劑盒分析批間差小，檢測的分析間精密度提高。2.本發(fā)明的試劑盒中的含有堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的溶液的制備方法，能夠有效將三碘甲狀腺原氨酸抗原與堿性磷酸酶偶聯(lián)，偶聯(lián)效率高，進(jìn)一步降低試劑盒的成本低和確保試劑盒的檢測效果。

3、采取本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確度好，精密度高，靈敏度高，檢測范圍寬，樣品無需預(yù)稀釋，操作簡單省時。與采用進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測的方法相比，本發(fā)明的檢測方法在成本上具有顯著的優(yōu)勢。


圖1為測試校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為靈敏度評價擬合曲線；圖3為血清樣本檢測結(jié)果相關(guān)性(其中橫坐標(biāo)X為實施例4制備得的試劑盒樣本測值，濃度單位為ng/mL，縱坐標(biāo)y為雅培公司試劑盒樣本測值，濃度單位為ng/mL)。
具體實施例方式實施例1第一試劑的制備(I)材料與儀器以磷酸鹽緩沖液保存的三碘甲狀腺原氨酸(T3)單克隆抗體(純度超過95wt%，濃度為2mg/mL);異硫氰酸熒光素(FITC)，碳酸鈉等試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；G_25凝膠純化柱采購自GE公司。(2)制備步驟①用O.1 O. 2mol/L ρΗ9· (TlO. O的碳酸鹽緩沖液配制O. 5mg/mL的FITC溶液；②按照三碘甲狀腺原氨酸單克隆抗體與FITC分子比為1:20的比例在抗體溶液中加入步驟①所配FITC溶液，混合均勻，室溫靜置12h小時，反應(yīng)生成T3抗體-FITC連接物；③將經(jīng)過步驟②的反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的FITC，得到含有T3抗體-FITC連接物(即FITC標(biāo)記的T3抗體)的溶液；④將步驟③所得含有T3抗體-FITC連接物的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA)ρΗ8· O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到T3抗體-FITC連接物濃度為O. 5 I μ g/mL,即為第一試劑。實施例2第二試劑的制備(I)材料與儀器T3抗原(固體粉末，純度超過95wt%)；以磷酸緩沖液保存的堿性磷酸酶(ALP溶液，ALP純度為約99%，比活性為約1500U/mg，濃度為10mg/mL);交聯(lián)劑DSS購自THERMO公司，TRIS等化學(xué)試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；G_25凝膠純化柱為GE公司產(chǎn)品。(2)制備步驟①取Img T3抗原，加入DMSO溶解該抗原至濃度為2(T50mg/mL，加入DSSO. 5mg,室溫反應(yīng)2小時，用DMSO將反應(yīng)液1:10稀釋，2-8 °C保存?zhèn)溆?；②取Img的ALP溶液，用O.1M pH9. 5的NaHCO3緩沖液將ALP溶液稀釋到lmg/ml，稀釋后的ALP緩沖液中加入步驟①制備的T3-DMS0溶液進(jìn)行連接反應(yīng)，加入T3-DMS0溶液體積為ALP緩沖液體積的1/20，室溫靜置反應(yīng)30min，用G-25凝膠柱除鹽，2_8°C保存?zhèn)溆茫虎蹖⒉襟E②的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白BSA) pH8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到O. 02 O.1 μ g/ml和pH9 10，即為第二試劑。實施例3磁分離試劑的制備(I)材料與儀器磁微粒的懸浮液磁微粒含量5wt%，磁微粒含羧基(COOH)活性集團(tuán)，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩爾(mmol)，具有超順磁性，直徑在O. 5_2μπι之間。

抗FITC抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，純度為90wt%以上，稀釋效價超過1:100萬；2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、TRI S和其他試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純。(2)制備步驟①取IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用O. 05mol/L, pH4. 5 5MES緩沖液IOmL重懸；②加入2 4mg的抗FITC抗體，室溫混懸3(T60min ；③加入O. 5 ImL新鮮配制的10mg/mL的EDC水溶液,室溫混懸2 12h ；④磁分離，去上清，用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)pH8.0的0. lmol/L的TRIS緩沖液重懸到lmg/mL, pH8. O,即為磁分離試劑。實施例4三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒該試劑盒包括按照實施例1方法制備的第一試劑(濃度為0. 75 μ g/mL), 5mL ；按照實施例2方法制備的第二試劑(濃度為0. 06 μ g/mL), 5mL ；按照實施例3方法制備的磁分離試劑5mL。實施例5三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒該試劑盒包括按照實施例1方法制備的第一試劑(濃度為0. 5 μ g/mL), 5mL ；按照實施例2方法制備的第二試劑(濃度為0. 02 μ g/mL), 5mL ；按照實施例3方法制備的磁分離試劑5mL。實施例6三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒該試劑盒包括
按照實施例1方法制備的第一試劑(濃度為I μ g/mL), 5mL ；按照實施例2方法制備的第二試劑(濃度為O.1 μ g/mL), 5mL ；按照實施例3方法制備的磁分離試劑5mL。實施例7采取實施例4的試劑盒進(jìn)行三碘甲狀腺原氨酸的定量檢測(I)檢測步驟①免疫反應(yīng)在檢測管中加入30 μ L待測樣本(血清或血衆(zhòng))原液，然后加入50 μ L第一試劑，50 μ L第二試劑，混勻，37± I°C條件下溫育15min ;加入50 μ L磁分離試劑，混勻，37±1°C條件下溫育5min ；②洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入600 μ L的清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；此步驟重復(fù)3次；③加底物溶液檢測發(fā)光強度在檢測管中加入150 μ L堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液(北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司APCL-1 )，震蕩使磁微粒充分混懸，在5min內(nèi)檢測發(fā)光強度。(2)繪制校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖1。(3)靈敏度評價檢測“O”濃度樣本，重復(fù)檢測20次，計算相對發(fā)光強度(RLU)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并計算M-2SD值， 根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU進(jìn)行兩點回歸擬合得出一次方程，將M-2SD值帶入上述方程中，求出對應(yīng)的濃度值，即為最低檢測限。本方法的靈敏度不大于5ng/mL。其中A點發(fā)光值分別參見表1:表I
權(quán)利要求
1.一種三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，所述試劑盒包括第一試劑含突光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的溶液；磁分離劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原由堿性磷酸酶與三碘甲狀腺原氨酸抗原通過交聯(lián)劑辛二酸二琥拍酰亞胺酯連接構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，其特征在于所述第一試劑中的熒光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的濃度為O. 5^1 μ g/mL，所述第一試劑的pH為7-9 ;所述第二試劑中的堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的濃度為O. 02、.1 μ g/mL，所述第二試劑的pH為7_9。
4.一種如權(quán)利要求3所述的三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述含有熒光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的溶液、所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的溶液以及所述包被有熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的步驟，其特征在于所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的溶液的制備過程如下①使三碘甲狀腺原氨酸抗原與交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯在二甲基亞砜溶劑中，在室溫下反應(yīng)，使生成三碘甲狀腺原氨酸抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物，于2 8°C下保存?zhèn)溆?，其中所述的三碘甲狀腺原氨酸抗原、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%,且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg ；②將含有堿性磷酸酶的緩沖液與步驟①所得溶液按照堿性磷酸酶與三碘甲狀腺原氨酸抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物的摩爾比為1:1. Γ1. 3的比例混合，在室溫下反應(yīng)，使生成所述堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱除鹽，選擇具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得，其中堿性磷酸酶的緩沖液的濃度為O. 5 1· 5mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟①中，取三碘甲狀腺原氨酸抗原，加入二甲基亞砜溶解該抗原至濃度為2(T50mg/mL，加入交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯，室溫反應(yīng)2 3小時，用二甲基亞砜將反應(yīng)液1:10稀釋，于2 8°C下保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于步驟②中，取濃度大于等于5mg/ml的堿性磷酸酶的磷酸鹽緩沖液，用pH 9^10的碳酸氫鈉緩沖液稀釋至O. 5^1. 5mg/ml，加入步驟①所得反應(yīng)液，室溫靜置反應(yīng)2(T60min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為7、的緩沖液,然后按照熒光素與三碘甲狀腺原氨酸抗體的分子比為20^200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為7、的緩沖液與三碘甲狀腺原氨酸抗體的pH為7、的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去的熒光素，得到含有熒光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和PH，即得第一試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述磁分離劑的制備方法如下使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)疒18小時，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述的磁分離劑；其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5 2 μ m，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量大于等于O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%,稀釋效價大于1:100萬。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或7或8所述的制備方法，其特征在于所述的具有適當(dāng)pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。
10.采用權(quán)利要求Γ3中任一項權(quán)利要求所述的試劑盒用于對三碘甲狀腺原氨酸定量檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)免疫反應(yīng)在檢測管中加入待測樣本原液，依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在25 4(TC下進(jìn)行第一次溫育，然后加入磁分離試劑，混勻，在25 4(TC下進(jìn)行第二次溫育；(2)洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；(3)加底物溶液檢測發(fā)光強度在檢測管中加入堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物，去除磁場，充分混懸后檢測發(fā)光強度值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三碘甲狀腺原氨酸的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法，該試劑盒包括第一試劑含熒光素標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸抗原的溶液；磁分離劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。本發(fā)明使得能夠以更低成本和更高準(zhǔn)確度和精密度對三碘甲狀腺原氨酸進(jìn)行定量檢測。
文檔編號G01N33/535GK103048477SQ20121055022
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者于大為, 程曉蕾 申請人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司