專利名稱：檢測(cè)h5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于禽類免疫效果檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能同時(shí)對(duì)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)的膠體金三聯(lián)檢測(cè)試紙條，可用于禽類免疫效果的檢測(cè)和流行病的調(diào)查。
背景技術(shù)：
禽流感、新城疫和雞傳染性法氏囊病都是流行于禽類中的烈性傳染病，嚴(yán)重威脅 養(yǎng)禽業(yè)的正常發(fā)展，養(yǎng)殖場(chǎng)的禽類一旦感染這些病毒，將會(huì)導(dǎo)致禽肉類市場(chǎng)供求關(guān)系混亂、禽產(chǎn)品出口受阻、政府財(cái)政負(fù)擔(dān)加重和公眾恐慌。因此，使用禽流感、新城疫和雞傳染性法氏囊病的疫苗進(jìn)行免疫注射，并對(duì)免疫效果進(jìn)行檢測(cè)以確定其是否產(chǎn)生相應(yīng)的抗體保護(hù)具有非常重大的意義?？焖贆z測(cè)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條是以膠體金作為示蹤物，通過(guò)將層析法與免疫膠體金技術(shù)相結(jié)合研制而成的產(chǎn)品。該試紙條能同時(shí)對(duì)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)，具備快速、操作簡(jiǎn)單、與酶聯(lián)免疫法相似的特異性及靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型目的在于提供一種操作方便、快速、有效地檢測(cè)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用如下技術(shù)方案—種檢測(cè)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條，該試紙條包括底板、樣品墊、涂覆膠體金顆粒標(biāo)記抗體的玻璃纖維膜、包被膜和吸水紙，其中，包被膜的底面粘貼在底板上面，在該包被膜兩端的上面分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙，在該玻璃纖維膜遠(yuǎn)離包被膜的一端的上面粘貼樣品墊；在所述包被膜的上面設(shè)有檢測(cè)線I、檢測(cè)線II、檢測(cè)線III和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線I包被H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原，檢測(cè)線II包被新城疫病毒的蛋白抗原，檢測(cè)線III包被雞法氏囊病毒的蛋白抗原，質(zhì)控線包被羊抗兔IgG抗體；所述玻璃纖維膜為涂覆膠體金顆粒標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體的玻璃纖維膜。具體的，H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、雞法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗體分別固定于包被膜上并呈四條線平行排列，形成所述的檢測(cè)線I、檢測(cè)線II、檢測(cè)線III和質(zhì)控線。上述的H5亞型禽流感病毒、新城疫病毒和雞法氏囊病毒的蛋白抗原均為高純度的抗原，按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)即可制得，故此處不再贅述。底板可以用PVC材料制成，包被膜可以是硝酸纖維素膜。本實(shí)用新型采用間接法檢測(cè)抗體，通過(guò)對(duì)金標(biāo)記抗體pH、濃度以及包被膜上包被抗原濃度的調(diào)整，使其能夠產(chǎn)生特異條帶，從而滿足農(nóng)戶、基層及個(gè)人對(duì)于H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體檢測(cè)的需求。本實(shí)用新型在對(duì)一份樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，能同時(shí)檢測(cè)出該樣品是否含有H5亞型禽流感病毒抗體和/或新城疫病毒抗體和/或雞法氏囊病毒抗體，其具有特異性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，且不需要使用儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，能廣泛地用于農(nóng)戶、基層以及個(gè)人對(duì)于H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的檢測(cè)。

圖I為本實(shí)用新型的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖，圖中，I為PVC底板；2為樣品墊；3為金標(biāo)記抗體玻璃纖維膜；4為硝酸纖維素包被膜；5為吸水紙，下同；圖2為圖I的俯視圖示意圖，圖中，6為檢測(cè)線I ;7為檢測(cè)線II ；8為檢測(cè)線III ；9為質(zhì)控線； 圖3為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體均陽(yáng)性的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9均顯色)；圖4為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為H5亞型禽流感病毒抗體陽(yáng)性的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線I 6和質(zhì)控線9顯色，而檢測(cè)線II 7和檢測(cè)線III 8不顯色)；圖5為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為新城疫病毒抗體陽(yáng)性的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線II 7和質(zhì)控線9顯色而檢測(cè)線I 6和檢測(cè)線III 8不顯色)；圖6為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為雞法氏囊病毒抗體陽(yáng)性的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9顯色，而檢測(cè)線I 6和檢測(cè)線II 7不顯色)；圖7為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為H5亞型禽流感病毒抗體和新城疫病毒抗體陽(yáng)性的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7和質(zhì)控線9顯色，而檢測(cè)線III 8不顯色)；圖8為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為H5亞型禽流感病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體陽(yáng)性的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9顯色，而檢測(cè)線II 7不顯色)；圖9為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體陽(yáng)性的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線II 7、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9顯色，而檢測(cè)線I 6不顯色)；圖10為本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為陰性的示意圖(即包被膜4表面的質(zhì)控線9顯色，而檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7和檢測(cè)線III 8均不顯色)；圖11為試紙條無(wú)效的示意圖(即包被膜4表面的檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9均不顯色)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本實(shí)用新型的保護(hù)范圍不限于此。如圖I和圖2所示，一種檢測(cè)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條，試紙條包括PVC底板I、樣品墊2、涂覆(每毫升金標(biāo)記抗體溶液涂覆10平方厘米的玻璃纖維素膜)膠體金顆粒標(biāo)記(金標(biāo))兔抗雞IgG抗體的玻璃纖維膜3、包被膜4和吸水紙5，其中，包被膜4的底面粘貼在PVC底板I上面，在該包被膜4兩端的上面分別粘貼玻璃纖維膜3和吸水紙5，在該玻璃纖維膜3遠(yuǎn)離包被膜4的一端的上面粘貼樣品墊2;在所述包被膜4的上面設(shè)有檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9，所述檢測(cè)線I 6包被H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原，檢測(cè)線II 7包被新城疫病毒的蛋白抗原，檢測(cè)線III 9包被雞法氏囊病毒的蛋白抗原，質(zhì)控線9包被羊抗兔IgG抗體。包被膜4為硝酸纖維素膜。H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、雞法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗體分別固定于包被膜4上并呈四條線平行排列，形成所述的檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9。通過(guò)檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9的顯色來(lái)進(jìn)行定性。本實(shí)用新型所述試紙條采用四條帶顯色的膠體金層析法制備，顯帶顏色為紅色線條，具體制備工藝如下·[0026](I)膠體金溶液的制備將雙蒸水置磁力攪拌器上攪拌加熱至沸騰，按終濃度為萬(wàn)分之二的量迅速加入濃度為1%的氯金酸溶液，煮沸5分鐘；再按所加入氯金酸溶液I. 8倍的體積量加入濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，煮沸10分鐘后，冷卻至室溫，用雙蒸水定容至氯金酸終濃度為萬(wàn)分之二，常溫避光保存?zhèn)溆谩?2)金標(biāo)抗體玻璃纖維膜3的制備用5M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至7. 5，按40μδ抗體/毫升膠體金溶液的比例濃度加入兔抗雞IgG抗體，混勻，靜置5分鐘；再按5%體積量加入濃度為10%的BSA溶液，混勻，靜置5分鐘；IOOOOrpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌一次，離心后棄上清，沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)抗體保存液溶解，然后按每毫升溶液鋪10平方厘米的量涂覆在玻璃纖維膜3上，真空干燥3小時(shí)后，置裝有干燥劑的密封袋中保存?zhèn)溆?。上?0%BSA溶液、標(biāo)記洗滌液和金標(biāo)抗體保存液的具體組分配比如下10%BSA溶液每IOOOmL雙蒸水中含牛血清白蛋白100g。標(biāo)記洗滌液每IOOOmL雙蒸水中含牛血清白蛋白4g，2g聚乙二醇8000，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖2g，Tris 1.211g，并調(diào)節(jié)pH至8. I。金標(biāo)抗體保存液每IOOOmL雙蒸水中含牛血清白蛋白25g，5g聚乙二醇8000，Tris 10. 2g，氫氧化鈉2. 5g，7. 5mL吐溫-20，并調(diào)節(jié)pH至8. 5。(3)硝酸纖維素包被膜4的制備在硝酸纖維素膜上分別噴涂H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、雞法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗體，并呈四條線平行排列，分別形成所述的檢測(cè)線I 6、檢測(cè)線II 7、檢測(cè)線III 8和質(zhì)控線9，37°C烘干處理2小時(shí)，置裝有干燥劑的密封袋中保存?zhèn)溆?。檢測(cè)線I 6 :調(diào)試噴膜儀，噴液量為 μ /cm，用包被緩沖液稀釋H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原，濃度為3. Omg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。檢測(cè)線II 7 :調(diào)試噴膜儀，噴液量為 μ /cm，用包被緩沖液稀釋新城疫病毒的蛋白抗原，濃度為2. Omg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。檢測(cè)線III 8 :調(diào)試噴膜儀，噴液量為 μ /cm，用包被緩沖液稀釋雞法氏囊病毒的蛋白抗原，濃度為2. 5mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。[0036]質(zhì)控線9 :調(diào)試噴膜儀，噴液量為 μ /cm，用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體，濃度為2. Omg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。上述包被緩沖液的具體組分配比為每IOOOmL雙蒸水中含牛血清白蛋白O. Olg,十二水合磷酸氫二鈉30. 072g，磷酸二氫鉀2. 176g。包被膜上所劃四條線應(yīng)細(xì)致均勻，相鄰兩線間隔O. 3cm。(4)大板組條大板組條各組分規(guī)格(長(zhǎng)X寬)=PVC底板I :30cmX7. 6cm ;樣品墊2 :30cm X 3. Ocm ;金標(biāo)記抗體玻璃纖維膜3 :30cm X O. 7cm ;硝酸纖維素包被膜4 :30cm X 2. Ocm ；吸水紙 5 30cmX3. 2cm。各組分按如下方法進(jìn)行組條將硝酸纖維素包被膜4的底面粘貼在PVC底板I上，在該包被膜4兩端的上面分別粘貼金標(biāo)記抗體玻璃纖維膜3和吸水紙5，在該金標(biāo)記抗體玻璃纖維膜3遠(yuǎn)離包被膜4的一端的上面粘貼樣品墊2 ;即在PVC底板I上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、金標(biāo)記抗體玻璃纖維膜3、包被膜4和吸水紙5，組成大板。組裝車間的濕度要控制在30%以下。(5)切條用切條機(jī)將大板切成單個(gè)人份，每人份寬度為4毫米，隨機(jī)抽檢，靈敏度能檢出室內(nèi)質(zhì)控，條帶顯色程度達(dá)到一個(gè)“ + ”號(hào)，無(wú)非特異性條帶。(6)封袋與組盒將I份已切好的試紙條、一包干燥劑和一根塑料滴管裝在鋁箔袋內(nèi)，用封口機(jī)密封，密封完畢后放入試劑盒中，常溫干燥保存。本實(shí)用新型采用高純度的H5亞型禽流感病毒、新城疫病毒和雞法氏囊病毒的蛋白抗原作為包被抗原進(jìn)行特異的H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體檢測(cè)。其原理是試紙條中含均勻分布的膠體金標(biāo)記兔抗雞IgG抗體，H5亞型禽流感病毒、新城疫病毒和雞法氏囊病毒的蛋白抗原以及羊抗兔IgG抗體分別固定在硝酸纖維素膜4上并呈四條平行線排列，羊抗兔IgG抗體在最上方為質(zhì)控線9 (陰性對(duì)照)，雞法氏囊病毒蛋白抗原在第二條為檢測(cè)線III 8，新城疫病毒蛋白抗原在第三條為檢測(cè)線II 7，H5亞型禽流感病毒蛋白抗原在最下方為檢測(cè)線I 6。膠體金標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體能與樣品中的H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體相結(jié)合形成免疫復(fù)合物，隨樣品從包被膜4上流過(guò)，包被膜4上所包被的蛋白抗原與之結(jié)合形成相應(yīng)的免疫復(fù)合物，當(dāng)樣品中含有一定量的目的抗體時(shí)，相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)區(qū)即可形成肉眼可見(jiàn)的紅色帶，依據(jù)有無(wú)紅色帶的形成進(jìn)行結(jié)果的判斷。具體的，當(dāng)待檢樣品中僅含有H5亞型禽流感病毒抗體時(shí)，H5亞型禽流感病毒抗體與金標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，隨樣品從包被膜4上流過(guò)，包被膜4上的H5亞型禽流感病毒蛋白抗原與之結(jié)合，檢測(cè)線I 6上形成紅色帶，檢測(cè)結(jié)果為H5亞型禽流感病毒抗體陽(yáng)性(如圖4所示)。當(dāng)待檢樣品中僅含有新城疫病毒抗體時(shí)，新城疫病毒抗體與金標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，隨樣品從包被膜4上流過(guò)，包被膜4上的新城疫病毒蛋白抗原與之結(jié)合，檢測(cè)線II 7上形成紅色帶，檢測(cè)結(jié)果為新城疫病毒抗體陽(yáng)性(如圖5所示)。當(dāng)待檢樣品中僅含有雞法氏囊病毒抗體時(shí)，雞法氏囊病毒抗體與金標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，隨樣品從包被膜4上流過(guò)，包被膜4上的雞法氏囊病毒蛋白抗原與之結(jié)合，檢測(cè)線III 8上形成紅色帶，檢測(cè)結(jié)果為雞法氏囊病毒抗體陽(yáng)性(如圖6所示)。當(dāng)待檢樣品中含其中任意兩種病毒抗體時(shí)，其在包被膜4上相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)區(qū)形成紅色帶，其他檢測(cè)區(qū)不能形成紅色帶，檢測(cè)結(jié)果為其對(duì)應(yīng)的病毒抗體陽(yáng)性(如圖7、圖8、圖9所示)。當(dāng)待檢樣品中同時(shí)含有H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體時(shí)，H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體分別與金標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體相結(jié)合形成免疫復(fù)合物，隨樣品從包被膜4上流過(guò)，包被膜4上的H5亞型禽流感病毒蛋白抗原、新城疫病毒蛋白抗原和雞法氏囊病毒蛋白抗原分別與之結(jié)合，檢測(cè)線I
6、檢測(cè)線II 7和檢測(cè)線III 8上均形成紅色帶，檢測(cè)結(jié)果為H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體均為陽(yáng)性(如圖3所示)。當(dāng)待測(cè)樣品中未含有H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體時(shí)，金標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體無(wú)法與包被膜4上的H5亞型禽流感病毒蛋白抗原、新城疫病毒蛋白抗原和雞法氏囊病毒蛋白抗原結(jié)合，致使金標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體無(wú)法在膜上滯留，檢測(cè)區(qū)不能形成紅色帶(即檢測(cè)線I 6、
檢測(cè)線II 7和檢測(cè)線III 8上均不顯色)，檢測(cè)結(jié)果為陰性(如圖10所示)。質(zhì)控區(qū)如有紅色帶形成標(biāo)志該試紙條的檢測(cè)結(jié)果有效；否則，該試紙條的檢測(cè)結(jié)果無(wú)效(如圖11所示)。本實(shí)用新型具有特異性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，且不需要使用儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，能廣泛地用于農(nóng)戶、基層以及個(gè)人對(duì)于H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的檢測(cè)。
權(quán)利要求1.一種檢測(cè)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條，其特征在于，試紙條包括底板、樣品墊、涂覆膠體金顆粒標(biāo)記抗體的玻璃纖維膜、包被膜和吸水紙，其中，包被膜的底面粘貼在底板上面，在該包被膜兩端的上面分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙，在該玻璃纖維膜遠(yuǎn)離包被膜的一端的上面粘貼樣品墊；在所述包被膜的上面設(shè)有檢測(cè)線I、檢測(cè)線II、檢測(cè)線III和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線I包被H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原，檢測(cè)線II包被新城疫病毒的蛋白抗原，檢測(cè)線III包被雞法氏囊病毒的蛋白抗原，質(zhì)控線包被羊抗兔IgG抗體；所述玻璃纖維膜為涂覆膠體金顆粒標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體的玻璃纖維膜。
2.如權(quán)利要求I所述檢測(cè)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條，其特征在于，H5亞型禽流感病毒的蛋白抗原、新城疫病毒的蛋白抗原、雞法氏囊病毒的蛋白抗原及羊抗兔IgG抗體分別固定于包被膜上并呈四條線平行排列，形成所述的檢測(cè)線I、檢測(cè)線II、檢測(cè)線III和質(zhì)控線。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)H5亞型禽流感病毒抗體、新城疫病毒抗體和雞法氏囊病毒抗體的膠體金測(cè)試試紙條，包括底板、樣品墊、涂覆膠體金顆粒標(biāo)記抗體的玻璃纖維膜、包被膜和吸水紙，其中包被膜的底面粘貼在底板上面，在該包被膜兩端的上面分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙，在該玻璃纖維膜遠(yuǎn)離包被膜一端的上面粘貼樣品墊；在包被膜的上面設(shè)有檢測(cè)線I、II及III和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線I、II及III分別包被H5亞型禽流感病毒、新城疫病毒及雞法氏囊病毒的蛋白抗原，質(zhì)控線包被羊抗兔IgG抗體。該試紙條特異性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快。
文檔編號(hào)G01N33/543GK202693594SQ20122033425
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者路紀(jì)琪, 何宏軒, 張義鋒, 趙林萍, 任寶紅, 朱晗羽, 趙璐 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)