專利名稱：：雞毒霉形體抗體免疫膠體金快速檢測試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于免疫應用領域，涉及動物分子生物學、免疫學等相關領域。具體的講,本發(fā)明屬于雞毒霉形體抗體快速檢測試劑盒，分別用于雞血清中雞毒霉形體抗體的檢測，以確定被檢雞是否感染雞毒霉形體或免疫過的雞體內是否產(chǎn)生了相應的抗體。
背景技術：
：眾所周知，禽流感、新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、雞毒霉形體病、馬立克、減蛋綜合癥等疫病是危害全球養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病。雞毒霉形體(Mycoplasmagallisepticum)是一類缺乏細胞壁、能獨立繁殖的最小的單細胞原核微生物，屬于原核生物中軟壁菌門軟皮體綱。主要引起雞的慢性呼吸道疾病，是養(yǎng)禽業(yè)相當棘手的疾病問題之一。主要引起呼吸道感染及免疫抑制，多年來一直在各類雞群中廣泛存在，至今仍沒有有效的疫苗進行防控，致使雞群長期帶毒，常引起其他疫病的繼發(fā)感染，給我國養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟損失。根據(jù)血清學調查，霉形體病在我國感染率很高，大部分雞群的感染率超過50%,有的甚至高達70%-90%，而且經(jīng)常繼發(fā)其它疾病，尤其是與大腸桿菌或新城疫、傳染性支氣管炎等病原并發(fā)感染，造成雞群大量死亡(王承宇，宣華.雞毒支原體病研究迸展.中國預防獸醫(yī)學報，2000，22(增刊)208-211)。而清除這種疫病的最有效的方法是淘汰帶毒雞群，保留健康不帶毒的雞群。要做到這一點，就要有一種快速簡便的檢測方法來確定感染雞群。而已有的研究中，沒有合適的快速檢測雞毒霉形體的新方法。如瓊脂擴散試驗(Agarosegelimmunodiffusion;AGID)、血凝抑制試驗(Hemagglutinationinhibition;HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay;ELISA)、血清平板凝集試驗(serumplateagglutinationtest;SPA)等，這些方法有的耗費時間長(如瓊脂擴散試驗需2448小時；血凝抑制試驗需23小時；ELISA試驗需35小時等)，有的需要昂貴的儀器設備和繁瑣的操作步驟，只能在實驗室完成，不便于適時和快速診斷，血清平板凝集試驗判定結果的時間比較短，但其主觀性比較強，沒有一定的經(jīng)驗很難做出準確的判定。免疫層析(immunochromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨特的免疫分析方法，該方法的核心技術是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細管作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassay;GICA)是應用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術(OsikowiczGetal.One-stepchromatographicimmunoassayforqualitativedeterminationofchoricogonadotropininurine.ClinChem,19卯,36,1586)。層析過程中，金標記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體(檢測線)發(fā)生特異性的免疫反應而被截留，進一步富集，形成肉眼可見的紫紅色條帶，從而得到直觀的實驗結果，達到快速檢測的目的。這種方法對所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據(jù)這種原理，已經(jīng)研制出了很多膠體金免疫層析快速檢測試紙條。在人醫(yī)應用方面，國內外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細菌、寄生蟲、腫瘤標記物、心血管病標志物、藥物以及其他一些蛋白質等方面應用了金標免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應用方面，例如在豬瘟、犬細小病毒病等方面也應用了金標免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測方面，中國發(fā)明專利(專利號ZL99101537.1)，公開了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應用，但該發(fā)明的要點是針對畜禽疫病病原的檢測，并未涉及對雞毒霉形體抗體的診斷檢測。圖1:本發(fā)明的總體技術路線圖圖2:本發(fā)明試紙卡的側視圖，圖中1樣品墊(樣品端)；2為金標墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端)；5為檢測線，即T線；6為質控線，即C線；7為不吸水的支撐薄片條；8為測試卡；9為加樣孔。圖3:本發(fā)明試紙卡的俯視圖，圖中1樣品墊(樣品端)；2為金標墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端)；5為檢測線，即T線；6為質控線，即C線；8為測試卡；9為加樣孔。圖4:發(fā)明試紙卡結果判定示意圖，圖中&為陽性結果++++;15性結果+++;0為陽性結果++;d為陽性結果+;e為陰性結果；f、g為試紙卡失效圖5:本發(fā)明涉及的pMGA1.2重組蛋白表達質粒的物理構建圖
發(fā)明內容本發(fā)明的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，其第一個目的是組裝一種用于檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒。第二個目的是本發(fā)明的試劑盒在雞毒霉形體抗體檢測中的應用。本發(fā)明的總體技術路線圖見圖1所示。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內的試紙卡、樣品稀釋液組成。試紙卡(結構圖如圖2、3所示)是本發(fā)明的試劑盒的核心，由試紙條與測試卡組成。試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標墊(2)、樣品墊(1)的依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構成。的金標墊(2)上包被有膠體金標記的抗雞IgGFc單克隆抗體(分泌該抗體的雜交瘤細胞系BDRPDP已經(jīng)公布在本申請人在先授權的專利文獻中，專利號ZL200510011521.8，該雜交瘤細胞系的己于2005年3月17日保藏在中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:C200501);硝酸纖維素膜(NC膜)(3)上分別包被有雞毒霉形體重組血凝素蛋白pMGA1.2蛋白構成的檢測線(T線)(5)和兔抗鼠IgG構成的質控線(C線)(6);將試紙條裝入測試卡(8)中構成試紙卡。樣品稀釋液為蒸餾水。所述硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購自Millipore公司。所述親和層析柱購自AmershamBiosciences公司。本發(fā)明所述的重組pKG-pMGA1.2蛋白，是由大腸桿菌BL21/pKG-pMGA1.2所表達的，包含重組質粒pKG-pMGA1.2的大腸桿菌(fsc力eric力iaco乃')BL21/pKG-pMGA1.2于2007年12月20日保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M207207)本發(fā)明的原理是選用親和層析純化的雞毒霉形體重組血凝素pMGA1.2蛋白作為檢測線，抗雞IgGFc片斷單克隆抗體作為膠體金標記的抗體，利用間接法(ShyuRH等，Colloidalgold-basedimmunochromatographicassayfordetectionofricinJToxicon2002，40(3):255-258)來檢測被檢材料中是否含有雞毒霉形體抗體。檢測時，樣品中所有的雞IgG分子的Fc片段先和金標記抗雞IgGFc片段單克隆抗體結合，由于毛細管作用，反應復合物沿包被膜向前泳動，若樣品中有抗雞毒霉形體的特異性抗體，到達檢測線時，遇到包被在硝酸纖維素膜上的重組蛋白，就會形成重組蛋白-抗體-金標記單克隆抗體復合物，從而富集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線；不是抗雞毒霉形體的抗體形成的抗體-金標記單克隆抗體復合物則會通過檢測線，富集在質控線上，形成紅色沉淀線，即判為陽性結果。若樣品中不含有雞毒霉形體抗體，反應復合物到達檢測線時，遇到捕獲抗原就不會形成重組蛋白-抗體-金標記單克隆抗體復合物，反應復合物通過檢測線，富集在質控線上，形成紅色沉淀線，即判為陰性結果。本發(fā)明優(yōu)點1、本發(fā)明的優(yōu)點之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的表達載體pGEX-KG是分子生物學中常用的表達載體，沒有生物危險性，在此基礎上構建的表達載體pKG-pMGAl.2也沒有任何生物危險性。重組大腸桿菌BL21/pKG-pMGA1.2是將表達載體pKG-pMGA1.2轉化至分子生物學中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險性。本發(fā)明中的試紙條檢測線包被的是本發(fā)明制備的雞毒霉形體重組血凝素蛋白(pMGA1.2蛋白)，制備過程中不涉及雞毒霉形體活病毒，因此沒有雞毒霉形體活病毒逃逸、擴散的潛在危險。2、本發(fā)明的優(yōu)點之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的試劑盒所需的核心試劑是抗雞IgGFc段單克隆抗體與毒霉形體重組血凝素蛋白(pMGA1.2蛋白)。抗雞IgGFc單克隆抗體可以通過將分泌抗雞IgGFc片斷的單克隆雜交瘤細胞系(保藏編號為CCTCCNO:C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，誘生腹水，通過經(jīng)濟的辛酸-硫酸銨方法純化而大量獲得。pMGA1.2蛋白可以通過重組大腸桿菌BL21/pKG-pMGA1.2在體外得到大量的表達，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。3、與已公開的用于雞毒霉形體抗體檢測的血清平板凝集試驗(SPA)方法相比，本發(fā)明的試劑盒具有許多SPA方法所不能比擬的優(yōu)點，如靈敏度高，特異性好，結果容易判定；檢測過程中只需一種試劑(蒸餾水)，對人體無危害，對環(huán)境無污染；儲存方便，對溫度要求不高，在4。C下有效保存期可達一年；在室溫下可保存六個月(表l)。表1本發(fā)明的試劑盒與血清平板凝集試驗(SPA)方法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具體實施方式實施例1雞毒霉形體pMGA1.2蛋白的制備所使用的分子生物學方法參見文獻薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯),分子克隆實驗指南.第二版，北京科學出版社，1992中提供的方法進行。1、pMGA基因片段的PCR及克隆本發(fā)明所涉及的pMGA1.2基因是申請人從pMGA重組質粒MgW17(Genbank登錄號為AF2753i2，質粒的構建見文獻翁長江等雞毒霉形體HS株pMGA多基因族的研究，中國獸醫(yī)學報，2003，23(2):149-152)自己亞克隆得到的。整個MgW17重組質粒共計約10.6kb，含有的雞毒霉形體DNA片段為7434bp，其中包含有兩個完整的pMGA基因(pMGA1.2、pMGA1.3)和兩個不完整的pMGA基因的頭部(pMGAl.l)和尾部(pMGA1.4)(見圖--)。pMGA1.1基因位于整個片段的最前端，閱讀框的前半部分被切除，剩下的后半部序列在l-720bp，共720bp，終止密碼為TAA;本研究準備克隆的pMGA1.2基因的閱讀框在1040-3010bp處，全長1971bp，起始密碼為GTG，終止密碼為TAA，編碼656個氨基酸；編碼色氨酸的TGA密碼分別位于1928、2111和2489處，考慮到跨膜區(qū)內疏水性氨基酸及其相臨近的膜內、膜外氨基酸在黏附素抗原性上的相對不重要性以及對表達的不利影響，所以，在設計引物時，申請人刪除了該基因氨基端的膜內區(qū)、跨膜區(qū)以及脯氨酸間隔區(qū)序列共計161bp，從1201-3010共計1800bp，其中3個TGA密碼子將1800bp分解成700bp，216bp，381bp和538bp4個片段。為了表達出全序列，必須對3個TGA進行點突變，因此，申請人首先分別擴增出前后4個片段，經(jīng)兩兩整合成兩個大片段后，再重新將兩個大片段整合到原核表達載體中，從而構建完整表達pMGA1.2基因的載體。根據(jù)MgW17中的pMGA1.2基因3個色氨酸編碼子"TGA"附近的核苷酸序列設計9條特異引物，由上海博雅生物技術公司合成并經(jīng)PAGE純化。引物序列如下.-引物引物序列引物起止序列片段大小(bp)下劃線備注0.0#5,-TCGGAATTCAACTTGAAGTGA-3，-12-4EcoRI1.0#1.1#1.2#1.3#1.4#1.5#1.6#1.7#5，-TTTGAATTCCTAGTGGTGGTATGA-CCAATTGGGAATTGTAGTTTCT-3'-CAATlTGG|AACTTCGCTCAAAGA-，-ACCGGTTGAAGGTCCGTAATAA-5'-ACCGGTTGGTTATACTTCCCT-3'162-179EcoRI700870掘Munl885德Munl2161050-1060cm011066-1087CfrlOI3811426-1447Nhel1441-1465Nhel5381966-1987Xhol5，-CGCTAGCCAAACTATAAGCACT-3，5，-GCTAGCGAIJXgglTCAACATTTATC-3'5'-GGCTCGAGGTTAGTAGTTTAATAG-3'說明方框標記出tga同義突變?yōu)閠gg以MgW17為模板，用引物0.0#和1.7弁進行PCR，然后以該PCR產(chǎn)物為模板用上述其他引物按以下條件進行PCR擴增。反應體系為10x反應緩沖液IOW，dNTP2pl(10mM)，上游引物2[al(20pM)，下游引物2^1(20^M)，TaqDNA聚合酶1pi(5u/|al)，模板DNAlpl，去離子水82pl，共lOOiil。反應條件為94。C變性4min;94。C變性30Sec，不同溫度退火30Sec，72'C延伸90Sec，共30個循環(huán)，最后72。C延伸10min。其中引物對0.0#和1.7#，1.0#和1.7#，1.0#和1.1#，1.2柳1.3#，1.4#和1.5#及1.6#和1.7#PCR時的退火溫度分別為51，51，50，52和51°C，擴增的片段分別為pMGA1.2'，pMGA1.2，I，II，m和IV。取10(alPCR產(chǎn)物經(jīng)0.8o/。瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用DNA回收試劑盒E.Z.N.AGelExtractionKit回收目的片段。在16"條件下將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接過夜，然后轉化到新制備的感受態(tài)DH5a中并涂布含IPTG、Xgal和Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)16-18h。將培養(yǎng)好的平皿4。C放置數(shù)小時后挑白斑進行擴大培養(yǎng)提質粒進行酶切和PCR鑒定。將鑒定的陽性克隆pMD-I，pMD-II，pMD-III和pMD-IV中的I和II，III和IV利用特定酶進行酶切后再T4連接酶整合為pMD-v(i+n)禾卩pmd-vi(in+iv)。2、表達載體pKG-pMGA1.2的構建用五co/I和ATzoI雙酶切pMD-pMGA1.2，五coI和雙酶切含v的質粒pMD-V,C々7仍和Wol雙酶切含VI的質粒pMD-VI后，用E.Z.N.AGelExtractionKit回收分離并純化片段pMGA1.2、V和VI。在16'C條件下，用T4連接酶將回收的酶切片段與用和力ol雙酶切的AmershamBiosciences公司的表達載體pGEX-KG片段進行連接過夜構建表達載體。重組表達載體轉化新鮮制備的DH5a感受態(tài)細胞，并將轉化菌涂布含氨芐青霉素的LB瓊脂平板37'C培養(yǎng)過夜。挑數(shù)個單菌落培養(yǎng)過夜后用堿裂解法小量制備質粒，進行酶切分析和pcr擴增鑒定。將得到的陽性克隆命名為pKG-pMGA1.2。包含該重組質粒pKG-pMGA1.2的大腸桿菌(Esc/^n'c/n'aco//)BL21/pKG-pMGA1.2保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日2007年12月20日；保藏編號CCTCCNO:M207207。對陽性克隆用常規(guī)的堿裂解法大量制備質粒dna，并分裝凍存于-2(TC。重組表達質粒pKG-pMGA1.2構建流程如圖5所示。3、雞毒霉形體pMGA1.2蛋白的表達將構建好的表達質粒pKG-pMGAl.2轉入表達用大腸桿菌的感受態(tài)細胞5w/^n'c/n'flco/iBL21(DE3)(Esc/^r油aco/iBL21(DE3)購自Stratagene公司)中，涂布到含有抗生素(氨芐青霉素60pg/mL)的LB平皿上，37。C培養(yǎng)1618h，長出單菌落。挑取數(shù)個單菌落于加有抗生素(氨芐青霉素60pg/mL)的3mLLB中培養(yǎng)過夜，進行細菌活化。將過夜培養(yǎng)物按比例l:50稀釋入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37'C中振蕩培養(yǎng)(250300rpm)至UOD600=0.50.8時，加入終濃度為lmmol/L異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)誘導表達3h。4'C條件下8,000rpm離心15min，收集細菌。細菌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS，配方如下140mMNaCl，2.7mMKC1，lOmMNa2HP04，1.8mMKH2P04，pH7.2)洗滌一次后離心，反復快速凍融34次，用適量緩沖液STE(配方100.0mmol/LNaCl，10,0mmol/LTris-Cl，1.0mmol/LEDTApH8.0)重懸。用大超聲頭，設定功率400瓦、20個循環(huán)和破碎5秒、間隔10秒，在冰浴中超聲破碎lmin。4。C條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清對0.01MpH7.2PBS進行充分透析后濃縮至體積為5mL，按蛋白純化柱(GlutathioneSepharose4BHiTrapaffinitycolumns,AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)說明書提供的程序進行親和層析純化，得到純化的pMGA1.2蛋白。該蛋白可用于制備檢測雞毒霉形體抗體的試劑。實施例2兔抗鼠IgG抗體的制備1、Balb/C小鼠IgG的提取IgG的提取和純化按沈關心等(沈關心等，現(xiàn)代免疫學實驗技術(第二版)[M]，湖北科學技術出版社，2002)等所述方法進行取IO.OmL健康Balb/C小鼠血清與等量生理鹽水混合后，逐滴加入飽和(NH4)2S04溶液20.0mL，使成50%飽和度的(1^14)2804溶液。4。C靜置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min，棄上清，沉淀中加20.0mL生理鹽水；待沉淀溶解后，緩慢加入10.0mL飽和(NH4)2S04溶液，使成33%飽和度的(NHU)2S04溶液。4。C放置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min。棄上清，沉淀重復進行上述操作后，將沉淀溶于l.OmL生理鹽水(原血清量體積的1/10)，裝入透析袋內用生理鹽水透析除鹽。用2XBaCl2溶液檢測(NH4)2S04是否己被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000濃縮至適當體積，4"下12，000r/min離心10min，取上清，測定蛋白質含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。2、Balb/C小鼠IgG的純化根據(jù)樣品的種類與容積及所選擇的層析柱來確定所選葡聚糖凝膠的種類和柱床的體積。柱床的體積按如下公式計算Vt二兀r211(Vt—柱床的體積；兀一圓周率；r一半徑；h—柱床高)根據(jù)樣品的種類，本發(fā)明用葡聚糖凝膠(SephadexG-200)作為層析材料。純化的具體過程如下稱取3.0gSephadexG-200倒入數(shù)倍體積的蒸餾水中混合均勻，置室溫浸泡3d，每天換蒸餾水2次，慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾水，凝膠浸泡好后置4'C冰箱保存?zhèn)溆?。將潔凈的層析柱垂直固定于實驗架上，加少量洗脫?0.01mol/L,pH7.2PBS)，檢査出液管的通暢性，合格后，關閉出液口。從4'C冰箱取出浸泡好的SephadexG-200，平衡至室溫后灌裝層析柱。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與柱內徑相當?shù)臑V紙片，0.01mol/LpH7.2的PBS平衡過夜，在凝膠的上方留出lcm2cm高的液層，準備加樣。加樣時，將凝膠上方的液層放出，待剛露出濾紙片時，立即關閉出液口。用滴管吸取樣品，在接近濾紙?zhí)幯毓鼙诹飨?，取少許生理鹽水沖洗樣品瓶，將洗液加入，最后用洗脫液清洗管壁。打開出液口，在樣品全部進入柱床且剛出現(xiàn)濾紙時，立即加入洗脫液，使柱床上部形成5cm10cm厚的液層。樣品上柱后，不時以20%磺基水楊酸液檢測洗出液，當洗出液出現(xiàn)輕微乳濁反應時，立即用已經(jīng)編號的1.5mLEP管收集洗出液，每管lmL，直至洗出液用20%磺基水楊酸檢測不出渾濁時結束收集。結束收集后，用紫外分光光度計測定每管流出液中蛋白質含量，以EP管編號為橫坐標，管內流出液蛋白質含量為縱坐標繪制曲線圖，根據(jù)蛋白濃度分布收集所需溶液，裝入透析袋中，PEG-20,000濃縮至適當體積。4。C12,000r/min離心10min,收集上清，用紫外分光光度計測定經(jīng)過濃縮后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-20'C凍存。3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化選取體重在2,5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制備的抗原，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫劑量為2mglgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免與二免間隔3周外，其余每次免疫間隔10天，且每次免疫劑量中Balb/C小鼠IgG的含量較前一次高0.8mg,每次免疫途徑全部采用皮下多點注射。免疫3次后，采血檢測血清效價，當血清AGID(瓊脂凝膠免疫擴散試驗(agargelimmunodiffusion,AGID)簡稱瓊擴試驗)效價達到1:32時，再加強免疫l次，IO天后頸動脈放血，分離血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。按照本實施例步驟1和步驟2的方法進行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化。即可得到本發(fā)明所需高特異性、高效價的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為本發(fā)明膠體金試紙卡的質控線(C線)。實施例3硝酸纖維素膜的制備1包被緩沖液的配制含3%甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液為包被緩沖液，0.22p膜濾過，置4'C備用，有效期一周。1000ml3。/o甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液配方NaC18g、KC10.2g、Na2HP04'12H202.9g、KH2P040.2g、甲醇30ml，用雙蒸去離子水定容至1000ml。2硝酸纖維素膜的制備用本實施例步驟1中的包被緩沖液將pMGA1.2蛋白稀釋到5010(^g/ml，調整機器，劃線為T線，即為檢測線，T線靠近金標墊端，距金標墊端約5mm;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到50100ng/ml,調整機器，劃線為C線，即為質控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離58mm，線應細致、均勻。37t烘千，封裝備用。實施例4膠體金、金標記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4"C備用，有效期四個月。1000mlin/。氯金酸溶液配方10g氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)1%擰檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解檸檬酸三鈉，配成1。/。溶液，0.22)Lim膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)O.IM碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22nm膜濾過，置4"C備用，有效期四個月。1000ml0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)2%聚乙二醇(PEG)-20000的配制用雙蒸去離子水配制，0.22)am膜濾過，置4。C備用，有效期四個月。1000ml2y。PEG-20000溶液配方20gPEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%疊氮鈉(NaN3)、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm膜濾過，置4'C備用，有效期四個月。1000ml標記洗滌保存液配方20gBSA、0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入2mlP/。擰檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。3、膠體金標記單克隆抗體的制備用0.1M碳酸鉀調膠體金的pH值至8.2，按810嗎抗體/ml膠體金加入抗雞IgGFc單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min,攪拌下加入BSA至終濃度為1%，靜置1小時。13000rpm、4。C離心30min，棄上清，沉淀用標記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標記洗滌保存液將沉淀重懸，置4'C備用，有效期一周。實施例5金標墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白BSA、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm微孔濾膜濾過，置4。C備用，有效期四個月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2金標墊的制備將金標墊浸泡于本實施例步驟l中的封閉液中30min后，于37'C烘干。然后將制備好的金標記抗體均勻的鋪在金標墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4"C備用。實施例6試紙條樣品墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%Tween陽20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm微孔濾膜濾過，置4"C備用，有效期四個月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5.NaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2樣品墊的制備將樣品墊浸泡于本實施例1中的封閉液中30min后，于37匸烘干，封裝，置4'C備用。實施例7試紙卡的組裝將硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維、樣品墊按圖依次層疊起來，切成3.6mm寬的小條，然后裝入測試卡。每十個一包，加入干燥劑，真空封裝。48'C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個月。實施例81快速檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒包括①試紙卡一包(10個/包)②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)2相關溶液的配制快速檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒的樣品稀釋液蒸餾水。實施例9本發(fā)明試劑盒的使用方法1.樣品制備雞血清樣品的制備，將血清樣品用蒸餾水稀釋20倍。2.檢領!l:取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙卡，取100pl制備好的樣品滴入試紙卡的加樣孔中，10-15分鐘內判定結果。3.結果判定如圖4所示，當試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陰性，記為"一"；當試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質控線，同時也出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陽性，記為"+";檢測線顏色深度與被檢血清中的抗體效價呈正相關，顏色越深說明被檢測樣品的抗體效價越高；檢測線顏色濃厚，與質控線顏色一致或接近時判為++++，顏色深度介于+與++++之間時酌情判++或+++。達到+及以上的顏色深度時，判為該份被檢血清的抗體為陽性。質控線無條帶出現(xiàn)則判為檢測試紙卡失效。實施例10快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒穩(wěn)定性考核設計溫度20°C、4°C設計時間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月保存方法試紙卡真空封裝(貯存在4'C的冰箱內或2(TC室溫中)考核指標敏感性表2本發(fā)明試劑盒試紙卡穩(wěn)定性測試結果0天10天20天30天2月4月6月8月10月12月0。C1:10241:10241:10241:10241:10241:10241:10241:256I:641:1620'C1:10241:10241:10241:10241:1024h10241:256失效實施例11快速檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒的制備及應用1快速檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒的制備按實施例1-9的方法制備快速檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒。2速檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒的應用2.1雞標準血清的檢測①特異性試驗分別將雞禽流感病毒H5、H9亞型陽性血清(購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所)、雞新城疫(ND)陽性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)陽性血清、雞傳染性法氏囊(IBD)陽性血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)按本發(fā)明實施例9所述方法(GICA)進行試驗。結果見表3。表3顯示，本發(fā)明檢測試紙卡與雞毒霉形體陽性血清試驗后，質控線及檢測線均出現(xiàn)明顯的紫紅色條帶；而與蒸餾水(空白)、SPF雞陰性血清、雞新城疫(ND)、雞傳染性法氏囊(IBD)、雞傳染性支氣管炎(IB)等陽性血清試驗后，檢測線不出現(xiàn)紫紅色條帶。這表明本發(fā)明試紙卡特異性高，與雞的其他呼吸道疫病病毒抗體無任何交叉反應。表3本發(fā)明的試劑盒對雞標準血清檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>②敏感性試驗將雞毒霉形陽性血清(購自中國中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)進行倍比稀釋，取100(il稀釋好的樣品按本發(fā)明方法(GICA)進行試驗。同時，用常規(guī)平板凝集(SPA)(沈關心，周汝麟.現(xiàn)代免疫學實驗技術(第二版)[M],湖北科學技術出版社，2002)測定MG標準陽性血清的效價(試驗結果見表4)。結果表明，本發(fā)明檢測試劑盒的靈敏度比平板凝集試驗高128倍。表4本發(fā)明試劑盒與常規(guī)檢測方法對雞毒霉形體抗體檢測的敏感性試驗結果_GICA檢測SPA檢測MG標準陽性血清1:10241:82.2送檢雞血清樣品的檢測從湖北、河南等地的3個雞場共采集120份雞血清，按本發(fā)明方法(GICA)進行試驗。同時，用常規(guī)平板凝集(SPA)測定效價。(結果見5)。表5顯示，GICA法檢出率為44.17。/。(53/120)，SPA法為24.17°/。(29/120)，二者的符合率為61.67%((18+56)/120，(SPA和GICA同為陽性+SPA和GICA同為陰性)/總樣品數(shù))；SPA法檢出率為24.17%(29/120)，比GICA法檢出率低，是因為GICA法的敏感度比SPA高128倍(1024/8)，使得GICA法陽性時而SPA法為陰性，二者的符合率為61.67%((18+56)/120，(SPA和GICA同為陽性+SPA和GICA同為陰性y總樣品數(shù))。表5本發(fā)明的試劑盒與常規(guī)方法檢測效果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>盡管本發(fā)明的內容是結合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的范圍內對本發(fā)明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護范圍內。權利要求1、一種適用于檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒，它包含盒體、設在盒體內的試紙卡和樣品稀釋液，其特征在于其中的試紙卡由試紙條與測試卡組成；試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構成。所述的金標墊(2)上包被有膠體金標記的抗雞IgGFc片段單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有雞毒霉形體重組血凝素pMGA1.2蛋白構成的檢測線(5)和兔抗鼠IgG構成的質控線(6)；所述的樣品稀釋液為蒸餾水。2、權利要求l中所述的試劑盒在檢測雞毒霉形體抗體中的應用。全文摘要本發(fā)明屬于免疫應用領域，涉及動物分子生物學、免疫學等相關領域。公開了一種用于快速檢測雞毒霉形體抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設在盒體內的試紙卡和樣品稀釋液。其中的試紙卡是由樣品墊、吸收墊、分別包被有雞毒霉形體pMGA1.2重組蛋白作為檢測線和包被有抗鼠IgG作為質控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構成。所述的試劑盒檢測相應的抗體具有特異性強、靈敏度高、操作簡便和診斷快速的顯著優(yōu)點。文檔編號G01N33/577GK101196525SQ20071016910公開日2008年6月11日申請日期2007年12月29日優(yōu)先權日2007年12月29日發(fā)明者梅劉,張展英,張文通,張進良,李自力,畢丁仁,政王,王喜亮,石德時,肖運才,胡思順,許青榮申請人:華中農(nóng)業(yè)大學