進(jìn)行數(shù)字測量的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了進(jìn)行數(shù)字化測量的方法、裝置和系統(tǒng)。
【專利說明】進(jìn)行數(shù)字測量的方法和系統(tǒng)
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2011年I月20日提交的第61/434，670號美國臨時專利申請的權(quán)利，出于所有目的將其全文清楚地弓I入本文作為參考。
[0003]發(fā)明背景
[0004]本發(fā)明涉及進(jìn)行數(shù)字測量的方法、裝置和系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及在不同體積中進(jìn)行數(shù)字測量的方法、裝置和系統(tǒng)。
[0005]數(shù)字測量因其所提供的穩(wěn)定性、較高的靈敏度和較高的準(zhǔn)確性而在生物學(xué)中日益重要。此外，與模擬測量不同，在所述模擬測量中通常必須通過加標(biāo)(running standard)進(jìn)行校準(zhǔn)，數(shù)字測量是基于計算二進(jìn)制是或否的回復(fù)，不需要校準(zhǔn)，從而節(jié)省用戶的時間，增強穩(wěn)定性和分析的方便性。
[0006]數(shù)字分析的一個重要應(yīng)用是對樣品中存在的DNA或RNA的準(zhǔn)確定量。在這里，檢測DNA或RNA的最廣泛使用的方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中樣品通常在約60°C和95°C的兩個或三個溫度之間循環(huán)。使用PCR擴增DNA或RNA大大地推進(jìn)了大范圍的學(xué)科，范圍從基礎(chǔ)生物學(xué)到臨床診斷學(xué)和法醫(yī)學(xué)。診斷學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中常用的一種特別形式的PCR是定量PCR (qPCR)，它不僅能夠檢測樣品中是否存在DNA或RNA，而且能準(zhǔn)確地測量其濃度。這是進(jìn)行后續(xù)決策和分析的一個重要的數(shù)據(jù)點——例如，通過在試驗樣品中檢測到的病毒RNA載量確定給患者的HIV治療藥物的量。
[0007]目前，進(jìn)行qPCR的最常見形式是實時PCR，廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷學(xué)。在實時PCR中，樣品的絕對濃度是通過擴增過程的時間進(jìn)展推導(dǎo)出來的，其中所述擴增過程通過能夠具體地識別擴增產(chǎn)物的熒光探針監(jiān)測，如分子信標(biāo)或Taqman?探針。實時PCR對各種錯誤敏感，包括不需要的引物二聚體的形成，其中引物分子由于其序列中的互補段而彼此附著。這樣就會產(chǎn)生一種副產(chǎn)物，可以與現(xiàn)有PCR試劑的靶元素相競爭，從而能夠抑制靶序列的擴增，并且干擾準(zhǔn)確的定量。目標(biāo)的定量還要求對每個循環(huán)的擴增效率有精確的了解，并且由于增長是指數(shù)性的，擴增效率中微小的不確定性(例如，低于閾值檢測水平)會使目標(biāo)拷貝數(shù)的確定發(fā)生極大的錯誤。當(dāng)核酸的初始濃度低或熒光檢測不夠靈敏時，這種錯誤會非常大。雖然實時PCR能夠識別并定量復(fù)雜樣品中的靶DNA，但還是不能足夠精確地定量低樣品濃度，而這正是例如病原體檢測或臨床診斷學(xué)所需要的。
[0008]為了解決實時PCR難以定量低拷貝數(shù)DNA的問題，發(fā)展了數(shù)字或限制稀釋DNA擴增，所述數(shù)字或限制稀釋DNA擴增能夠更準(zhǔn)確地定量樣品中模板拷貝的絕對數(shù)。在dPCR中，總樣品被分為一批小的體積，使得根據(jù)Poisson統(tǒng)計，只有少數(shù)的體積含有一個或多個靶分子，而大多數(shù)體積不含DNA。然后，在所有體積中同時進(jìn)行DNA擴增，使只有含有靶分子的那些少數(shù)體積中的熒光增加。通過對熒光體積(即含有DNA拷貝的那些)進(jìn)行計數(shù)，就能簡便而準(zhǔn)確地確定DNA拷貝數(shù)。
[0009]dPCR的概念很有吸引力，但其尚未廣泛應(yīng)用，這是因為(I)不易建立dPCR中使用的一大批的極小的體積(皮升到納升)，以及(2)實驗的動態(tài)范圍由離散陣列的大小和數(shù)量限定，通常極低。為了準(zhǔn)確地定量樣品中DNA或蛋白的量，大多數(shù)區(qū)室通常最多含有一個靶分子。這就意味著樣品的初始濃度與分析的動態(tài)范圍相匹配。換句話說，初始樣品濃度應(yīng)當(dāng)在向運行dPCR的設(shè)備中輸入正確的樣品濃度之前進(jìn)行測定。這會增加運行dPCR的不便，并會限制具有恒定體積的數(shù)字陣列的可能性。
[0010]不管使用何種具體的反應(yīng)，重要的是克服數(shù)字分析的有限動態(tài)范圍。直接的方法是通過增加相同大小的數(shù)字體積的數(shù)量來擴大分析的范圍。這一方法是有問題的；為了容納大量的體積，設(shè)備需要很大，并會涉及相當(dāng)復(fù)雜和昂貴的微加工過程。因此，需要進(jìn)行數(shù)字測量的另外的方法和系統(tǒng)。
[0011]除了上述dPCR的實際問題之外，精確的溫度控制和溫度循環(huán)也阻礙著該方法的廣泛使用。一般來說，退火和解鏈步驟的溫度控制在+/-1攝氏度。對于DNA和RNA絕對定量重要的許多應(yīng)用，這些因素難以滿足，或者其實現(xiàn)昂貴，特別是在資源有限的環(huán)境以及醫(yī)療點中。為了提供在這些環(huán)境中擴增DNA和RNA的更為符合人體工學(xué)的方式，開發(fā)了幾種等溫方法，包括滾環(huán)擴增(RCA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)或環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)。
[0012]LAMP是用于擴增DNA或RNA的等溫過程，在60_65攝氏度的固定溫度下有極高的特異性。由于其高的特異性，LAMP在擴增過程中能夠區(qū)分單核苷酸差異。因此，LAMP已應(yīng)用于SNP (單核苷酸多態(tài)性)分型。LAMP還顯示能夠檢測病毒RNA，其靈敏度比RT-PCR高約十倍。LAMP與其它等溫方法區(qū)分的另一個特征是其能夠直接將DNA的擴增與增加溶液渾濁度的焦磷酸鎂的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)。這樣，使用一個濁度計就可以跟蹤LAMP溶液的進(jìn)展。因此，非均質(zhì)分析可以用來檢測LAMP產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物。焦磷酸鎂的產(chǎn)生也能夠以熒光指示劑的形式使用，這對數(shù)字分析的讀出特別有用。在反應(yīng)前，在反應(yīng)混合物中加入少量的鈣黃綠素。在擴增過程中，焦磷酸鹽的產(chǎn)生增加會使含有一個或多個靶分子的體積中的鈣黃綠素?zé)晒饪焖僭黾印?br> [0013]這些反應(yīng)在固定溫度下進(jìn)行，可以減少儀器的復(fù)雜度，降低能耗，使其更適合于治療點診斷和家庭醫(yī)療設(shè)備。將這些方法轉(zhuǎn)換為數(shù)字形式是為了更好、更準(zhǔn)確地在治療點檢測出病原體的重要步驟。另外，數(shù)字分析還會提高基于蛋白擴增的分析的準(zhǔn)確度，如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)或任何單分子分析，其中所述單分子分析可能要求或不要求擴增。
[0014]鑒于上述情況，需要提供進(jìn)行數(shù)字測量的改進(jìn)的方法和系統(tǒng)。此外，還需要提供使用數(shù)字測量的另外的技術(shù)，例如數(shù)字LAMP。本文公開的本發(fā)明提供這些需要以及更多。
[0015]發(fā)明概沭
[0016]本發(fā)明提供進(jìn)行數(shù)字化測量的方法、裝置和系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及在不同體積中進(jìn)行數(shù)字測量的方法、裝置和系統(tǒng)。在一些方面中，本發(fā)明提供增加數(shù)字測量動態(tài)范圍的方法和裝置，包括但不限于數(shù)字PCR、數(shù)字等溫核酸擴增(例如:數(shù)字NASBA和數(shù)字LAMP)、數(shù)字蛋白擴增(例如:數(shù)字ELISA)、數(shù)字單分子測量以及其它形式的數(shù)字測量。
[0017]在一個方面中，本發(fā)明提供一種用于擴大樣品數(shù)字測量的動態(tài)范圍的方法，所述方法包括:
[0018]建立樣品濃度梯度；和/或
[0019]建立不同大小的樣品體積。
[0020]在一個實施方案中，動態(tài)范圍是通過將數(shù)字測量和讀數(shù)與用于形成濃度梯度的方法和裝置整合而擴大的。分析物分子的濃度梯度優(yōu)選地呈對數(shù)或指數(shù)形狀，但也可以是許多其它形狀，包括但不限于線性、多項式、誤差、高斯、指數(shù)、對數(shù)、及其任何組合。
[0021]在另一個實施方案中，通過使用不同大小的數(shù)字化體積擴大動態(tài)范圍。例如，動態(tài)范圍可以通過在同一芯片或基底上具有下列數(shù)字化體積陣列實現(xiàn):體積為IOOnL的第一組陣列、體積為IOnL的第二組陣列、體積為InL的第三組陣列、體積為IOOpL的第四組陣列、體積為IOpL的第五組陣列、體積為IpL的第六組陣列、體積為IOOfL的第七組陣列、體積為IOfL第八組陣列、最后是體積為IfL的第九組陣列。根據(jù)最終的應(yīng)用，可能在同一芯片上不需要有所有這些陣列組。對于一些應(yīng)用，從IfL到InL的陣列可能就足夠了 ；而對于其它應(yīng)用，從IOOnL到IpL的陣列可能更合適。然而對于其它應(yīng)用，僅有不同體積的兩組陣列可能就足夠了。含有不同體積的陣列組的數(shù)量會不同，并取決于每個陣列的大小。例如，如果一個陣列包含一百萬個數(shù)字化體積，則可能無需涵蓋PL到nL的濃度范圍的InLUOOpL和IpL的陣列,僅IOOpL和IpL兩組陣列可能就足夠了。
[0022]在另一個方面中，可以結(jié)合濃度梯度和不同數(shù)字化體積大小進(jìn)一步擴大數(shù)字測量的動態(tài)范圍。在另一個方面中，本發(fā)明是采用濃度梯度或不同大小不相關(guān)體積擴大數(shù)字單分子測量動態(tài)范圍的一種方法。在另一個方面中，本發(fā)明是一種制備具有疏水和親水斑塊(patch)的圖案化表面的工藝，其中所述斑塊導(dǎo)致不同大小樣品體積的潤濕液滴的形成。在另一個方面中，本發(fā)明是非暫時性計算機可讀取介質(zhì)，所述可讀取介質(zhì)具有存儲在其上的計算機可執(zhí)行的指令，所述指令是用于使機器實施本文所述的任何方法的指令。在另一個方面中，本發(fā)明是一種包括疏水和親水斑塊的圖案化表面的陣列，其中所述斑塊導(dǎo)致不同大小樣品體積的潤濕液滴的形成。在另一個方面中，本發(fā)明用于擴大非均質(zhì)分析中樣品數(shù)字測量的動態(tài)范圍。需要注意的是，用于形成濃度梯度和用于數(shù)字化樣品體積的方法很多。本文提供的實例不應(yīng)被視為限制性的。
[0023]本發(fā)明還描述了用于進(jìn)行以下的方法和裝置:(I)數(shù)字NASBA，(2)數(shù)字LAMP，(3)進(jìn)行PCR或使用具有疏水和親水斑塊的圖案化表面形成的表面附著液滴進(jìn)行其它核酸擴增，以及(4)進(jìn)行使用非均質(zhì)分析進(jìn)行數(shù)字核酸擴增讀數(shù)。
[0024]在又一個方面中，本發(fā)明提供一種方法，用于使用數(shù)字測量確定樣品濃度。該方法可以包括產(chǎn)生具有第一體積分布的第一多個液滴，其中第一多個液滴的至少一個液滴包含來自樣品的成分；分析具有第二體積分布的第二多個液滴，以確定第二多個液滴中的單個液滴的體積以及第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴的數(shù)量，其中第一體積分布與第二體積分布是相同的或不同的；并且使用第二多個液滴中的單個液滴體積和第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴數(shù)量確定樣品的濃度。
[0025]在又一個方面中，本發(fā)明提供一種用于對樣品進(jìn)行數(shù)字測量的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括含有第一多個液滴的樣品容器，所述第一多個液滴具有第一體積分布；用于檢測第一多個液滴的至少一個液滴含有的可檢測試劑的探測器；以及包含具有可執(zhí)行指令的存儲裝置的計算機，所述指令由處理器執(zhí)行時，可以使處理器:分析具有第二體積分布的第二多個液滴，以確定第二多個液滴中的單個液滴的體積以及第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴數(shù)量，其中第一體積分布與第二體積分布是相同的或不同的；并且使用第二多個液滴中的單個液滴體積和第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴數(shù)量確定樣品的濃度。
[0026]在又一個方面中，本發(fā)明提供了一種對樣品進(jìn)行數(shù)字環(huán)介導(dǎo)擴增的方法。該方法包括在微流體裝置上產(chǎn)生多個樣品液滴，其中至少多個液滴中的至少一個液滴含有核酸分子；和在至少一個液滴中進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)擴增，以產(chǎn)生核酸分子的擴增產(chǎn)物。
[0027]為了更完整地理解本發(fā)明的性質(zhì)和優(yōu)點，應(yīng)參考隨后的與附圖結(jié)合的詳細(xì)描述。這些附圖以說明的方式表示了本發(fā)明的實施方案。本發(fā)明可以在多個方面修改而不偏離本發(fā)明。因此，附圖/圖示和這些實施方案的描述的本質(zhì)是說明性的，而不是限制性的。
[0028]附圖的簡要i兌明
[0029]圖1描述了含有分析物的梯度濃度的數(shù)字化體積的生成。出于可視化的目的，我們使用熒光染料熒光素作為我們的分析物。我們使梯度流過一列孔。在這里，梯度是使用以200 μ L/min來自頂部入口(上面箭頭)的200 μ M熒光素和以400 μ L/min來自底部入口(下面箭頭)水生成的。當(dāng)孔充滿濃度梯度時，我們使輕質(zhì)礦物油(比水密度小)在孔上方流動，以在孔中建立單個數(shù)字化體積。在這個實例中的孔體積相同，但也可使用不同體積的孔。對于該實驗，孔的直徑為75 μ m,深度為100 μ m,并且位于2mm高的流動室下方。
[0030]圖2描述了使用親水和疏水圖案化表面生成不同大小(體積)的數(shù)字化體積的方法和裝置。在這里，圓形的親水斑塊在疏水表面的背景上形成圖案。當(dāng)該表面暴露于水(或任何其它水溶液，如樣品溶液、PCR試劑溶液或緩沖液)和油時，水溶液會優(yōu)先潤濕親水斑塊，而油溶液會優(yōu)先潤濕疏水表面。這樣，就會在被油包圍的親水斑塊上形成水溶液的液滴(或半液滴)。此外，親水斑塊的面積(即圓圈的面積)各異，以使親水斑塊的不同尺寸控制親水斑塊保留的水溶液的體 積。即使斑塊是圓形的，親水斑塊保留的體積的橫截面也可以有不同的形狀。確切的形狀將取決于所使用的親水和疏水表面以及油相和水相的性質(zhì)。橫截面的形狀可以是半圓或比半圓更圓或更扁。親水斑塊優(yōu)選為圓形的，但也可以為許多其它形狀，包括正方形和長方形。
[0031]圖3提供了對根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的計算機系統(tǒng)的說明。
[0032]圖4描述了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，所占據(jù)的液滴的累積數(shù)對液滴數(shù)量的關(guān)系。圖中所示尺寸模擬針對濃度(在繪圖中從左到右)2.0\10_3、2.0\10_4、
2.0X 10_5、2.0X 10_6、2.0X 10_7 和 2.0XlO^8 摩爾 /fL。所有模擬包含 10，000 個液滴，其直徑由從4到190微米延伸的均勻分布中得到。所有液滴按照體積從最小到最大排列，液滴數(shù)量i的所占據(jù)的液滴的累積數(shù)為液滴數(shù)量< i的所占據(jù)的液滴總數(shù)。
[0033]圖5提供了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，濃度為2.0X 10_6的所占據(jù)液滴累積數(shù)的模擬。其它詳細(xì)信息同圖1。在低位區(qū)域，液滴被占據(jù)的概率極低，因此模擬曲線為零。在高位區(qū)域，液滴被占據(jù)的概率非常接近1，曲線以接近單位斜率上升。在過渡區(qū)域，液滴被占據(jù)的概率從零增加到近乎I。
[0034]圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，均勻液滴分布(直徑為4到190微米)的估計功效(power)。虛線是尺寸E1的測量誤差，實線是尺寸E2的測量誤差。下部兩條線是1.2倍分辨率，上部兩條線是1.5倍分辨率。點線繪制在0.95處。
[0035]圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，均勻液滴分布(直徑為10到100微米)的估計功效。虛線是尺寸E1的測量誤差，實線是尺寸E2的測量誤差。下部兩條線是
1.2倍分辨率，上部兩條線是1.5倍分辨率。點線繪制在0.95處。
[0036]圖8A-8B描述了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，使用顯微鏡確定乳化液滴的大小。圖8A顯示了硅烷化的顯微鏡載玻片上液滴的暗場像。如果液滴足夠分開，則可根據(jù)暗場像確定單個液滴的大小。使液滴呈圓形輪廓的水相和油之間的界面散射的光形成對比度，從此可以測量液滴的直徑。比例尺代表100微米。圖SB顯示了乳化后測量的577個液滴的尺寸分布。分布是不對稱的，中位直徑為20 μ m。大多數(shù)液滴的直徑在10到40微米的范圍內(nèi)。
[0037]圖9顯示了用于說明書的表3中的模擬的部分省略的對數(shù)正態(tài)分布。這一分布理想化地接近圖8中所示的實驗性分布。
[0038]圖10描繪了圖9所示部分省略的對數(shù)正態(tài)液滴分布的估計功效。虛線是尺寸E1的測量誤差，實線是尺寸E2的測量誤差。下部兩條線是1.2倍分辨率，上部兩條線是1.5倍分辨率。點線繪制在0.95處。
[0039]圖11A-11D顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，液滴中PCR擴增的檢測。圖1lA和IlB描繪了 PCR (陰性對照實驗)后不含靶DNA的液滴的圖像。所顯示的是組合的暗場/ ROX (IlA)和暗場/ FAM (11B)圖像，其中ROX是加入反應(yīng)中的參比染料，F(xiàn)AM是檢測DNA擴增的Taqman?探針中使用的熒光指示劑。暗場照亮液滴的環(huán)形輪廓，覆以來自熒光團(tuán)的高斯形熒光信號。插入物顯示沿著穿過液滴中心的淺灰色線測得的強度。液滴中心區(qū)域的信號主要是由于熒光，如果沒有DNA靶標(biāo)，中心區(qū)域保持暗的狀態(tài)，ROX和FAM熒光的比例高(R0X:FAM=120:20=6:1)。圖1lC和IlD是在含有靶DNA液滴的PCR圖像之后。顯示了組合的暗場/ ROX (IlC)和暗場/ FAM (IlD)圖像，其具有穿過液滴的相應(yīng)的線掃描。線掃描顯示中心區(qū)域增強的熒光信號以及空液滴中未觀察到的高斯分布。這兩種熒光信號之間的各自的比例明顯低于空液滴(ROX: FAM=60:30=2:1)。
[0040]圖12A-12C描述了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，數(shù)字LAMP自數(shù)字化芯片的設(shè)計。圖12A是顯示完全組裝的芯片的各個組件的示意圖。微流體陣列可以嵌入PDMS薄片中，所述PDMS薄片的頂部覆蓋有密封膜，底部有PDMS包被的蓋玻片?？諝鈮毫梢酝ㄟ^可拆式接合器送入，所述可拆式接合器可以連接到外部壓力源。圖12B是微流體網(wǎng)絡(luò)的示例性布置。長方形側(cè)室的密集陣列連到薄的主通道。整個陣列由單獨的蓄水池包圍，以在65°C下孵育時飽和PDMS。比例尺表示5mm。圖12C顯示了側(cè)室陣列和主通道的示例性幾何形狀。所有尺寸的單位都是微米。
[0041]圖13A-13E顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案，dLAMP SD芯片中樣品的自數(shù)字化。圖13A提供了使用水溶液初次灌注側(cè)室陣列的連續(xù)圖像。在芯片上涂油之后，含水樣品進(jìn)入主通道并分布到側(cè)室中，置換室中的油相。圖13B提供了顯示側(cè)室中含水樣品自數(shù)字化的一系列圖像。在全部水相進(jìn)入芯片后，主通道中的尾油相將納升大小的液滴隔離到側(cè)室中。圖13C顯示了側(cè)室中液滴大小分布對所施加壓力的依賴關(guān)系。平均相對體積分?jǐn)?shù)(RVF)最高的最均勻分布獲得自7psi的外部壓力。更低和更高的壓力會導(dǎo)致具有更易變的體積和降低的RVF的液滴的形成。圖13D描繪了來自16個單個芯片的5000個自數(shù)字化液滴的RVF值的大小分布。在所有實驗中，外部壓力均設(shè)定為7psi。所有液滴的平均RVF為0.89±0.14。插入物顯示RVF值的累積分布。數(shù)量對應(yīng)于RVF分別超過50%、75%和90%的液滴分?jǐn)?shù)。例如，所有液滴的85%充滿側(cè)室的75%以上。圖13E顯示了樣品自數(shù)字化的重現(xiàn)性。所顯示的是15個單個芯片的平均RVF值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個芯片有7psi的外部壓力。
[0042]圖14A和14B描繪了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在升高的溫度下的芯片性能。圖14A顯示了液滴體積上孵育的效果。顯示了在65°C下孵育70分鐘之前和之后典型的液滴大小分布。樣品包含沒有模板的陰性對照溶液，因此不會發(fā)生擴增。液滴平均收縮約10%。從插入物中可以看到，位于陣列外周的液滴收縮會稍微增加，這是因為他們更多地暴露于大量的PDMS。而在陣列中心的液滴則較少地受到收縮的影響。圖14B顯示了在我們的芯片中觀察到的數(shù)字LAMP簽名。顯示了孵育之前和之后的室陣列的一部分。強度分布對應(yīng)于穿過各室中心的線。一些側(cè)室中的環(huán)介導(dǎo)DNA擴增導(dǎo)致它們的熒光激增。鄰近的非LAMP活性的室顯示熒光未增強，表明相鄰室之間的樣品串?dāng)_可以忽略。
[0043]圖15A-15F顯示了不同DNA模板濃度Ci的數(shù)字LAMP結(jié)果=Ci=Ctl/^ (15A)、Ci=Co/30 (15B)、Ci=Co/150 (15C)、Ci=C(l/430 (15D)和 Ci=c0/1300 (15E)。C0 為模板儲備溶液的濃度。LAMP有效室的各分?jǐn)?shù)在圖16中分析。對于在最低樣品濃度(C(l/1300)下的實驗，使用535室芯片以增加陽性室的絕對數(shù)量。圖15F顯示了不加模板的LAMP溶液的對照實驗。如預(yù)期的一樣，沒有室顯示超過背景的熒光的增強。
[0044]圖16A和16B顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，DNA濃度的相對和絕對變化的定量。圖16A顯示了LoopAmp?試劑盒中所含的對照DNA樣品的稀釋系列，見圖15。對于每個樣品濃度，分析至少三個不同的芯片。實線代表在儲備溶液中模板濃度為0.99X IO4摩爾每μ I的泊松分布基礎(chǔ)上的預(yù)期的陽性事件的分?jǐn)?shù)。該濃度由三個最低樣品確定。圖16Β顯示了 DNA濃度的絕對定量。顯示了在65°C下孵育70分鐘之前和之后的535孔芯片。λ-噬菌體DNA稀釋到20拷 貝每μ I的終濃度，我們預(yù)期約有12%的陽性室。在孵育之后，在535孔陣列中檢測到9.8%的LAMP有效液滴(最初形成的479個液滴中的47個)。期望值和測量值之間的差異fa可能是由于八倍稀釋系列所累積的吸量誤差導(dǎo)致的。
[0045]圖17顯示了表2，其中包括由Z-測試和模擬估計的置信水平的比較。
[0046]發(fā)明詳沭
[0047]本發(fā)明涉及進(jìn)行數(shù)字測量的方法和系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及在變化的體積中進(jìn)行數(shù)字測量的方法和系統(tǒng)。
[0048]1.綜述
[0049]雖然不是限制性的，本發(fā)明部分基于通過生成大小可變化的體積來增加數(shù)字分析的動態(tài)范圍。對于給定的樣品濃度，體積的大小可以確定被一個或多個感興趣的分子(例如:模板分子)占據(jù)的概率。在擴增相關(guān)技術(shù)的實例中，體積大小的變化可以用來改變占據(jù)概率，從而改變顯示擴增的孔的數(shù)量或樣品體積(即液滴)。尤其地，本發(fā)明優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，所述現(xiàn)有技術(shù)僅增加大小恒定的體積的數(shù)量以擴大動態(tài)范圍。這一優(yōu)點是由于本文公開的方法和系統(tǒng)不要求很大的面積來容納需要擴展動態(tài)范圍的體積，那樣會增加芯片上產(chǎn)生缺陷的可能性，其中數(shù)字化體積在所述芯片上不正確形成或有其它缺陷。此外，僅增加體積的數(shù)量也會增加分析所有數(shù)字化體積所需的時間。
[0050]另外，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行動態(tài)范圍增加的數(shù)字分析的方法、系統(tǒng)和裝置，其中生成大量大小不同的體積。與上述預(yù)制的平臺不同，本發(fā)明可以包括使用連續(xù)的而非離散的大小(例如，體積)分布。在一些實施方案中，可以隨機地或通過微流體的可控式應(yīng)用，按照各種方式建立大小不同的液滴。例如，本領(lǐng)域公知通過使用T形接頭或流動集中(flowfocusing)設(shè)備來微流體生成恒定體積液滴。在這些系統(tǒng)中，液滴的大小可以通過剪切速率和通道尺寸控制。如果對于給定的T形接頭幾何的剪切速率連續(xù)變化，那么可以生成不同體積的液滴。這些方法可以通過例如計算機控制的注射泵或調(diào)整氣壓實現(xiàn)，所述計算機控制的注射泵或調(diào)整氣壓調(diào)整水相和載油流體的相對流速。
[0051]在一些實施方案中，可以通過在樣品容器(例如，試管)中乳化而隨機生成不同大小的液滴。由于例如無需努力控制液滴的大小，因此液滴隨機性可以簡化實驗。在乳化過程中，不同體積的液滴可以通過使用不同的表面活性劑穩(wěn)定。該乳化方法特別有用，原因如下:(1)該方法與每個生物醫(yī)學(xué)實驗室中發(fā)現(xiàn)的基本儀器兼容，(2)液滴的生成簡單，不要求復(fù)雜的芯片設(shè)計或用于流量控制的精細(xì)設(shè)備，(3)液滴不限制在單個孔中，從而使需要容納大量液滴的空間最小化，以及(4)由于擴增過程中液滴的生成和存儲可以使用相同容器而使分析簡單。在液滴生成和擴增反應(yīng)之間無需樣品轉(zhuǎn)移。
[0052]術(shù)語“動態(tài)范圍”定義為可變化量的最大和最小可能值之間的比率。
[0053]術(shù)語“數(shù)字化體積”是指在分析的準(zhǔn)備中獲得初始樣品并將其分為物理上明顯更小的體積后產(chǎn)生的體積。
[0054]術(shù)語“均質(zhì)分析”是指在檢測時溶液相中存在所有分析組分。在均質(zhì)分析中，沒有分析組分散射可檢測的光。
[0055]術(shù)語“非均質(zhì)分析”是指在檢測時一種或多種分析組分存在于固相中。沉淀或顆粒的形成，例如在LAMP或滾環(huán)擴增中，是異質(zhì)分析的常見形式。在這類型的分析中，固相成分可能散射可檢測的光。
[0056]如本文所提供，術(shù)語“連續(xù)體積分布”意在描述一種體積分布，所述體積分布在體積分布中連續(xù)而非通過預(yù)定義離散等級(step)變化。例如，基于芯片的平臺可能包括通過預(yù)定義離散等級定義的體積分布的孔或液滴體積，作為芯片的一部分制造。也就是說，芯片可以制備成具有存在于IOOnLUOnL和InL的體積，在那些離散等級之間沒有其它體積。相反地，連續(xù)體積分布不是預(yù)定義的(即體積分布在生成或形成液滴體積之前沒有確定)。連續(xù)體積分布可以，例如，通過乳化產(chǎn)生，如本文進(jìn)一步描述。在乳液中，體積(例如，液滴體積)具有不連續(xù)體積，但分布中的液滴體積在液滴產(chǎn)生之前沒有確定(即沒有通過制作技術(shù)預(yù)定義)，體積根據(jù)連續(xù)體積分布隨機分布。液滴體積的上限和下限可以通過施加于乳液的力改變(例如，渦旋振蕩速度或振搖強度)。但是，采用這種技術(shù)生成的液滴體積會隨著產(chǎn)生的體積分布不斷變化。
[0057]在一些方面中，連續(xù)體積分布也可具有特征，以使對于任意組(或多個)液滴體積，其分布函數(shù)可以表示為f (X)，其中f (x)dx為組中給定液滴的體積為X到x+dx的可能性。(dx為無限小的小數(shù)。)在某些實施方案中，連續(xù)分布是指液滴組中液滴的體積為(I)未預(yù)先指定以及(2)對于某些范圍，ΧΤΚ〈Χ〈Χ±Κ, f (X)總是大于零(XtrF能等于XUPPOT，有關(guān)f(x)無需了解更多)。因此，本發(fā)明在一些實施方案中可以包括使用連續(xù)分布的液滴組，測量組中每個液滴的體積，并將測得的液滴體積用于分析。
[0058]1.數(shù)字測量的方法
[0059]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于建立與數(shù)字測量和讀數(shù)整合的濃度梯度。例如，微流體梯度生成可以與樣品數(shù)字化芯片結(jié)合。圖1顯示了使用微通道插入物形成濃度梯度的實例。對于動態(tài)范圍的擴大，優(yōu)選對數(shù)或指數(shù)濃度梯度，但現(xiàn)在有許多方法可用于在芯片上形成各種類型和形狀的濃度梯度，包括非線性梯度，如功效、指數(shù)、誤差、高斯和立方根函數(shù)。圖1描繪了包含分析物梯度濃度的數(shù)字化體積的生成。
[0060]為了使用圖1所示的微流體設(shè)計類型生成濃度梯度，只需要兩個插入口貯液器或通道，但更多也可適用于本發(fā)明。一個入口用于樣品，一個用于緩沖液(或數(shù)字PCR情況下的PCR試劑)。當(dāng)兩種溶液流過網(wǎng)絡(luò)時，樣品溶液按照預(yù)定義的方式被緩沖液(水或PCR試劑)稀釋，以在各出口通道存在不同濃度的樣品。采用這一設(shè)計的變型已生成跨越六個數(shù)量級的線性、多項和對數(shù)梯度。
[0061]在另一個實施方案中，使用濃度跨越六個數(shù)量級的對數(shù)或指數(shù)梯度。樣品和PCR溶液被吸移到兩個入口貯液器中，之后它們將經(jīng)過孔陣列?？壮錆M濃度梯度后，在孔上流過輕質(zhì)礦物油或其它不互溶流體，以在孔內(nèi)建立數(shù)字化體積。在該實例中的孔體積相同。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在圖1中描繪的圖表與不同體積的孔一同使用。
[0062]在另一個實施方案中，樣品和PCR溶液被吸移到兩個入口貯液器中，之后它們將經(jīng)過親水和疏水斑塊陣列。當(dāng)樣品流經(jīng)親水斑塊時，會導(dǎo)致不同大小樣品體積的潤濕液滴的形成。
[0063]供選擇地，樣品可通過使用圖2所示的圖案化表面數(shù)字化。
[0064]在本發(fā)明的另一個方面中，梯度與使用閥門、孔或液滴建立的數(shù)字化體積聯(lián)合使用。在采用液滴的實施方案中，液滴能夠以T通道幾何或流動集中幾何的連續(xù)流動方式形成，這兩種方式都是本領(lǐng)域公知的。
[0065]為了數(shù)字化已稀釋的樣品，可以使用圖1所述的數(shù)字化方案。在這里，包含不同濃度的靶分子的樣品溶液流經(jīng)地形圖案化的表面，以形成數(shù)字化的離散體積，用于后續(xù)的數(shù)字測量和讀數(shù)。供選擇地，我們可以采用圖2所示的圖案化表面數(shù)字化所示的樣品。
[0066]在另一個實施方案中，可以使用微流體通道和不互溶的流體相數(shù)字化樣品。在這一實施方案中，樣品相被引入通道，之后引入不互溶相，形成由側(cè)腔的幾何尺寸限定的離散樣品體積(D.E.Cohen, T.Schneider, M.Wang, D.T.Chiu Anal.Chem.82，5707-5717)。
[0067]本發(fā)明的另一個方面包含進(jìn)行本發(fā)明方法的裝置。這樣的裝置可以建立與數(shù)字測量和讀數(shù)整合的濃度梯度。在另一個實施方案中，裝置進(jìn)行用于擴大樣品數(shù)字測量的動態(tài)范圍的方法，包括建立樣品濃度梯度，和/或建立不同大小的樣品體積。
[0068]在一些實施方案中，本發(fā)明包括擴大數(shù)字測量動態(tài)范圍的方法，所述數(shù)字測量基于建立不同大小的數(shù)字化離散體積陣列。該方法優(yōu)于僅通過增加數(shù)字化體積的數(shù)量來擴大動態(tài)范圍的方法。這是因為增加數(shù)字化體積的數(shù)量會增加體積所占據(jù)的面積以及增加芯片上具有缺陷的可能性，在所述芯片上數(shù)字化體積不正確地形成或有其它缺陷。僅增加數(shù)字化體積的數(shù)量還會增加分析所有數(shù)字化體積所需的時間。擴展動態(tài)范圍的更好方法是建立不同大小的數(shù)字化體積的陣列，而不是僅增加數(shù)字化體積的數(shù)量。不同大小數(shù)字化體積陣列可以是隨機陣列(例如，不同直徑的液滴均存在并隨機分布在容器中)，也可以是規(guī)則的陣列(例如，圖2所示的陣列)。
[0069]圖2顯示了建立不同大小的數(shù)字化體積的實例，其中采用圖案化表面建立不同大小的體積陣列。在該實例中，建立了七組陣列，每組陣列包含900個數(shù)字化體積(30X30)。陣列通過在疏水表面的背景中建立圓形親水斑塊形成。因此，當(dāng)表面暴露于水溶液和油時，親水斑塊會被油包圍的水滴覆蓋。圖下方顯示了水滴的側(cè)視圖。該側(cè)視圖描繪了半圓形液滴，但液滴的形狀可以根據(jù)我們所使用的具體表面以及使用的油和水溶液而變化(更扁或更圓)。在一個實施方案中，使用了重油，由于油會壓迫液滴，因此液滴會更扁。
[0070]限定每組900個親水斑塊的圓圈大小不同,其直徑可以是I μ m到5 μ m到10 μ m到50 μ m到100 μ m到500 μ m和直徑最終到1mm。由于液滴的體積粗略地測量為直徑的立方，因此斑塊的直徑增加10倍，體積就會增加約1000倍。因此，從空間和讀數(shù)來說，使用不同大小的數(shù)字化體積比僅使用大小相同的數(shù)字化體積更為有效。在一個實施方案中，使用每組陣列900個數(shù)字化體積，這是由于該數(shù)字適合實現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)穩(wěn)定的數(shù)字讀數(shù)。但是，根據(jù)具體的應(yīng)用和所需的讀數(shù)穩(wěn)定性，可以在每組陣列中設(shè)計更多或更少的數(shù)字化體積。
[0071]由于不同大小的表面圖案親水斑塊的容易性，這一設(shè)計的使用代表了建立大小不同的數(shù)字化體積陣列的獨特方案。因此，對于數(shù)字PCR等通常需要大的動態(tài)范圍的應(yīng)用，在采用圖2所述的圖案化表面建立的液滴中進(jìn)行PCR是高度有益的。
[0072]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用數(shù)字測量確定樣品濃度的方法。該方法可以包括產(chǎn)生具有第一體積分布的第一多個液滴，其中第一多個液滴的至少一個液滴包含來自樣品的成分；分析具有第二體積分布的第二多個液滴，以確定第二多個液滴中的液滴體積以及第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴的數(shù)量，其中第一體積分布與第二體積分布是相同的或不同的；并且使用第二多個液滴中的液滴體積和第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴數(shù)量確定樣品的濃度。
[0073]在一些實施方案中，體積可以使用閥門、孔或液滴建立。涉及液滴的實施方案可能特別有用。在這里，可以采用多種方法生成不同體積(直徑)的液滴。在一種方法中，使用微流體(例如，本領(lǐng)域公知的T形通道或流動集中設(shè)備)生成確定體積的液滴；通過改變剪切速率或通道尺寸，容易地形成不同大小的液滴。在另一種方法中，在不同表面活性劑的輔助下通過乳化生成不同體積的液滴；在這里，使用不同的表面活性劑穩(wěn)定和控制不同體積的液滴。在任何一種方法中，都可以在不同體積(大小)的所有液滴中同時進(jìn)行分析物的擴增(例如，數(shù)字PCR)，之后液滴能夠以單一文件形式流過流式細(xì)胞儀或其它類似設(shè)備，在所述流式細(xì)胞儀或其它類似設(shè)備中可以確定液滴的大小，并測定來自液滴的熒光。在該示例性設(shè)備中，根據(jù)熒光確定每個液滴中是否存在擴增產(chǎn)物，并且根據(jù)液滴的散射信號確定每個液滴的大小(體積)。這樣，通過記錄每個液滴的大小以及每個給定大小的液滴中是否存在擴增產(chǎn)物，可以在測定足量的不同大小的液滴后倒退計算樣品中存在的分析物的初始濃度。由于液滴大小不同，因此對于給定的動態(tài)范圍，出于之前討論的原因，分析比大小相同的液滴快得多。
[0074]如本文所述，可以產(chǎn)生具有多種體積分布的體積，所述多種體積分布可以采用多種不同的方法分析。在一些實施方案中，樣品可以包含可分析的一個或多個感興趣的分子。通過數(shù)字測量，可以生成樣品的離散體積以用于分析。例如，本文所述的方法可以包括產(chǎn)生具有體積分布的多個液滴。在一些實施方案中，可以在含有合并的不互溶流體的乳液中產(chǎn)生樣品的多個液滴，如本文進(jìn)一步描述。在一個實例中，樣品包括含有感興趣的分子(例如，核酸分子)的水溶液。樣品可以與油混合以形成在油中懸浮的樣品液滴。根據(jù)所采用的方法，乳液中多個液滴的體積可以隨著連續(xù)體積分布隨機分布。此外，體積的范圍可以由用于形成乳液的方法控制。例如，可以通過控制渦旋振蕩、振搖和/或超聲波的強度產(chǎn)生所需要的體積分布。
[0075]如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所理解的，體積分布的范圍和體積將取決于給定的分析的多個因素。在一些實施方案中，多個液滴的體積分布包括的體積范圍可以是約100納升(nL)到約I毫微微升(fL)、約IOnL到約10fL、約InL到約lOOfL、約IOOnL到約I皮升(pL)、約IOnL到約10pL、約InL到約IpL0根據(jù)所選擇的液滴生成的因素，通常通過例如改變樣品和油與表面活性劑混合的強度確定體積分布的上限和下限。在體積分布中可以具有體積的范圍。例如，分布中的體積的范圍可以是2倍以上、10倍以上、100倍以上或其它倍數(shù)。如果范圍是2倍，則體積分布的下限可以是例如10nL，上限為20nL。同樣地，如果范圍是10倍，則體積分布的下限可以是例如10nL，上限為100nL。
[0076]除了生成具有第一體積分布的第一多個液滴以外，本發(fā)明還包括對具有第二體積分布的第二多個液滴進(jìn)行分析。對第二多個液滴的分析包括，例如，確定第二多個液滴中液滴的體積。體積的確定可以采用多種方法進(jìn)行(例如，采用散射和/或顯微技術(shù))。在一些實施方案中，可以確定多個液滴中所有液滴的單個體積。在一些實施方案中，只能確定一些液滴的單個體積。液滴的分析還包括確定含有本文進(jìn)一步描述的可檢測試劑(即一種或多種可檢測試劑)的液滴數(shù)量。還應(yīng)當(dāng)指出的是，第二多個液滴是基于與產(chǎn)生的第一多個液滴相同的液滴。這樣，第一體積分布可以與第二體積分布相同，也可以不同(即更窄)。如果分布相同，則第一多個液滴中的每個液滴將包含在第二多個液滴中。在某些實施方案中，第二體積分布比第一體積分布更窄。例如，液滴可以從具有約IfL到約IOOnL的體積分布的乳液中產(chǎn)生。根據(jù)例如樣品的濃度，可以對從IfL到約InL的體積分布進(jìn)行數(shù)字測量的分析，其中第二體積分布比第一體積分布更窄。
[0077]在體積分析之前或分析期間，可以在大小不同的體積中進(jìn)行反應(yīng)(例如，擴增)，確定哪些體積經(jīng)歷了反應(yīng)(例如，有擴增產(chǎn)物)。在特定的實例中，可以確定體積(例如，液滴)大小并計數(shù)所占據(jù)的液滴(例如，含有可檢測試劑的液滴)的數(shù)量。可以分析所有液滴或僅分析某些液滴。分析可以，例如，通過將液滴以單列的形式流過流式細(xì)胞儀或類似設(shè)備來實現(xiàn)，在所述流式細(xì)胞儀或類似設(shè)備中可以確定液滴的大小，并檢測是否存在擴增。液滴的大小可以，例如，根據(jù)來自液滴的散射信號確定，是否存在擴增可以由來自液滴的熒光信號指示。供選擇地，液滴的直徑也可以通過顯微法確定。液滴可以從樣品容器中提取(在反應(yīng)例如擴增之前、期間或完成之后)，并用CCD攝像機取得廣角圖像。液滴，例如，可以鋪展在表面上，或嵌于兩個載玻片之間，并放置在廣角顯微鏡下。通過使用合適的激發(fā)和發(fā)射濾光片，可以定量液滴中的熒光，從而顯示是否存在擴增。通過記錄液滴的大小以及每個液滴中是否存在擴增產(chǎn)物，可以在測定足量的不同大小的液滴之后倒退計算樣品中存在的分析物的初始濃度。由于液滴大小不同，因此對于給定的動態(tài)范圍，出于之前討論的原因，分析比大小相同的液滴快得多。在一些實施方案中，本文的方法進(jìn)一步包括使用多個液滴中的液滴數(shù)量和多個液滴中的液滴體積進(jìn)行數(shù)字測量。例如，樣品中感興趣的分子的濃度可以通過使用多個液滴中的液滴數(shù)量、含有一個或多個感興趣的分子的多個液滴中的液滴數(shù)量以及通過測量多個液滴中一些或所有液滴的體積來確定。確定樣品濃度的示例性方法請見實施例部分。
[0078]本發(fā)明可用于數(shù)字測量提供有關(guān)樣品的有用信息的任何技術(shù)中。因此，本文提供的方法、系統(tǒng)和裝置可以包括含有可檢測試劑的體積。在特定的實施方案中，體積可以是微流體芯片上的孔或室，或含有可檢測試劑的液滴(例如，在乳液中或芯片表面上形成的水滴)。一般理解的是，可檢測試劑可以含有可檢測的單個分子或多個可檢測分子。也可以使用其它類型的可檢測試劑，例如珠子、量子點、納米粒等。另外，可檢測試劑可以，例如，是待分析的樣品中存在的感興趣的分子(例如，血液、血清、唾液或其它溶液中的核酸分子)。供選擇地，可檢測試劑可以是與樣品中感興趣的分子(例如，核酸分子)相關(guān)的分子，從而使該分子可被檢出。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以用于涉及數(shù)字測量的擴增相關(guān)技術(shù)(例如，數(shù)字PCR)。對于擴增測量，體積(例如，液滴)可以包含單個DNA分子，例如，但該體積還包含一般公知用于擴增和檢測的必要組分。在一些實施方案中，可檢測試劑是熒光的，因此，可通過本領(lǐng)域已知的基于熒光的檢測方法檢測。但是，也可使用其它檢測方法(例如，吸光度、化學(xué)發(fā)光、濁度、和/或散射)分析體積的成分。適用于本發(fā)明的多種可檢測試劑都是本領(lǐng)域公知的，并且可以例如在Molecular Probes? Handbook,第11版(2010)中找到。
[0079]在特定的實施方案中，可檢測試劑可與用于檢測的感興趣的分子關(guān)聯(lián)。例如，可檢測試劑可與核酸分子(例如，DNA或RNA)、肽、蛋白、脂質(zhì)或樣品中存在的其它分子(例如，生物分子)關(guān)聯(lián)。如本文所定義，在可檢測試劑上下文中的“關(guān)聯(lián)”包括通過共價和/或非共價相互作用與分子的相互作用。例如，可檢測試劑可以共價連接于靶分子。供選擇地，可檢測試劑可以，例如，是可以用于檢測核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)的插層劑或Taqman?探針?？梢允褂闷渌蓹z測試劑，例如不會與感興趣的體積中的分子關(guān)聯(lián)的參比染料。
[0080]本發(fā)明的一些實施方案包括在不互溶的流體中產(chǎn)生液滴。如本領(lǐng)域公知，多種不互溶流體可以結(jié)合以產(chǎn)生體積不同的液滴。如本文進(jìn)一步描述的，流體可以以多種方式結(jié)合，例如通過乳化作用。例如，水溶液(例如，水)可以與非水流體(例如，油)結(jié)合，在樣品容器內(nèi)或微流體芯片上產(chǎn)生液滴。適用于本發(fā)明的水溶液包括水基溶液，所述水基溶液進(jìn)一步包括緩沖液、鹽及一般已知在諸如PCR的檢測分析中使用的其它組分。因此，本文描述的水溶液可以包括，例如，引物、核苷酸和探針。適合的非水流體可以包括但不限于，有機相流體如礦物油(例如，輕質(zhì)礦物油)、硅油、含氟油或含氟流體(例如，含氟乙醇或Fluorinert)、其它市售材料(例如,Tegosoft?)或其組合。
[0081]除了水溶液和非水流體以外，還可含有表面活性劑，以例如改善液滴的穩(wěn)定性和/或促進(jìn)液滴的形成。合適的表面活性劑可以包括但不限于，非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、硅酮基表面活性劑、含氟表面活性劑或其組合。非離子型表面活性劑可以包括，例如，山梨糖醇酐單硬脂酸酯(Span60)、辛基苯氧基乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(TweenSO)和山梨糖醇酐單油酸酯(SpanSO)。硅酮基表面活性劑包括，例如，ABIL WE09表面活性劑。本領(lǐng)域一般地熟知的其它類型的表面活性劑也同樣可用。在一些實施方案中，表面活性劑可以存在于多種濃度或濃度范圍下，例如按重量計約0.01%、0.1%、0.25%,0.5%、1%、5% 或 10%。
[0082]本發(fā)明進(jìn)一步包括樣品濃度的確定。例如，所述方法和系統(tǒng)可以用于確定(I)液滴的體積，以及(2)含有可檢測試劑的液滴的數(shù)量，以用于確定樣品濃度。這一信息能夠以多種方式應(yīng)用，以確定樣品濃度。例如，靶分子在樣品中以是摩爾/體積的濃度單位存在。樣品可分布為體積不同的液滴，可以對所述體積進(jìn)行分析。(所有或一些)液滴的單個體積可以采用本文提供的方法確定。另外，使用本文所述的檢測方法，可以分析液滴是否含有可檢測試劑。對于給定的樣品濃度，一些體積不同的液滴可能包含可檢測試劑，一些液滴可能不包含。對于更高的樣品濃度，一般地多個液滴中更多的液滴可能包含可檢測試劑，反之亦然；對于低的樣品濃度，多個液滴中更少的液滴可能被可檢測試劑占據(jù)。如本文進(jìn)一步描述的，在具體體積分布中被可檢測試劑占據(jù)的概率可針對廣泛范圍的樣品濃度確定，然后可與實際數(shù)據(jù)比較，確定未知樣品的濃度。下面實施例1和實施例2中進(jìn)一步公開了樣品濃度的確定。實施例所示的方法涉及初步估計樣品濃度，然后計算液滴數(shù)量，預(yù)測所述液滴包含一個或多個可檢測試劑(被占據(jù)的液滴)。然后，使用熟知的數(shù)值法調(diào)整估計的樣品濃度，直到多個液滴中被占據(jù)液滴的預(yù)測數(shù)量與被占據(jù)液滴的實際數(shù)量相等，達(dá)到希望的準(zhǔn)確度。
[0083]如本文進(jìn)一步描述的，本發(fā)明提供了一些現(xiàn)有方法和系統(tǒng)無法實現(xiàn)的數(shù)字測量的多個方面。例如，本發(fā)明能夠提供在廣泛動態(tài)范圍內(nèi)測量樣品濃度的能力。在一些實施方案中，動態(tài)范圍可以是至少三個數(shù)量級、至少四個數(shù)量級、至少五個數(shù)量級、或至少六個數(shù)量級。在一些實施方案中，動態(tài)范圍可以是約?ο—1到約10_9摩爾/ fL、約10_2到約10_8摩爾/ fL、約1(Γ3到約10〃摩爾/ fL、或約1(Γ4到約1(Γ6摩爾/ fL。在特定的實施方案中，可以通過檢測與樣品中感興趣的分子相關(guān)聯(lián)的可檢測試劑來確定動態(tài)范圍內(nèi)的樣品濃度。動態(tài)范圍可以取決于多種因素，諸如乳液中產(chǎn)生的體積的范圍和/或分析和檢測的體積范圍。例如，具有第一體積分布的第一多個液滴能夠產(chǎn)生可檢測濃度的動態(tài)范圍。在某些情況下，動態(tài)范圍可以通過分析具有第二體積分布的第二多個液滴中更窄的體積分布來減小。在特定的實施方案中，體積分布包括連續(xù)變化的液滴體積。
[0084]通過整合dPCR與芯片上的梯度生成、或通過使用大小不同的數(shù)字化體積、或這兩種方法的組合，本發(fā)明有效地將我們的dPCR芯片的動態(tài)范圍從I個數(shù)量級擴大到6個數(shù)量級，所述動態(tài)范圍可以與RT-PCR提供的動態(tài)范圍相當(dāng)。如果需要,可以通過使用更廣范圍的濃度梯度或更大尺寸差異的數(shù)字化體積陣列進(jìn)一步擴大動態(tài)范圍。這種進(jìn)行定量PCR(qPCR)的新方法有幾個主要的優(yōu)點:(I)如前所述的更為準(zhǔn)確，(2)避免了進(jìn)行RT-PCR所需的校準(zhǔn)樣品類型，從而節(jié)省時間，以及(3)無需實時靈敏熒光檢測，所述實時靈敏熒光檢測會使RT-PCR與常規(guī)的PCR機器相比產(chǎn)生相對更高的成本(約十倍)。
[0085]本發(fā)明的另一個方面包括用于實施本發(fā)明方法的裝置。這樣的裝置可以建立不同大小的數(shù)字化和離散體積陣列。在另一個實施方案中，裝置實施用于擴大樣品的數(shù)字化測量動態(tài)范圍的方法，所述方法包括建立樣品濃度梯度和建立不同大小的樣品體積。
[0086]在本發(fā)明的又一個方面中，本文所述的方法、系統(tǒng)和裝置可以用于等溫擴增技術(shù)，例如數(shù)字ELISA、NASBA和LAMP。ELISA是基于蛋白的，常用于蛋白或小分子的定量。NASBA和LAMP是被開發(fā)以補充PCR的等溫擴增方案。
[0087]在等溫擴增中，沒有傳統(tǒng)PCR中發(fā)生的溫度循環(huán)。有幾種類型的等溫核酸擴增方法，例如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增、基于核酸序列的擴增、RNA技術(shù)的信號介導(dǎo)擴增、鏈置換擴增、滾環(huán)擴增、DNA環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、等溫多置換擴增、解鏈酶依賴性擴增、單引物等溫擴增、以及環(huán)狀解鏈酶依賴性擴增。
[0088]NASBA (基于核酸序列的擴增)是用于擴增RNA的等溫(約40°C )過程，并已成功應(yīng)用于檢測臨床樣品中的病毒和細(xì)菌RNA。NASBA的優(yōu)點是:(I)其具有高的擴增效率和快速的擴增動力學(xué)，在一或兩個小時內(nèi)可以實現(xiàn)一千倍以上的擴增；(2)不會產(chǎn)生象RT-PCR那樣由基因組dsDNA導(dǎo)致的假陽性結(jié)果；(3)可以不使用內(nèi)含子側(cè)翼引物而進(jìn)行基因表達(dá)研究；(4)不要求PCR需要的溫度控制和反饋的程度。因此，NASBA已廣泛用于檢測病毒和細(xì)菌RNA。NASBA是一種等溫方法的事實使其可以使用溫控烤箱同時運行多個樣品，這在許多現(xiàn)場工作中都是重要的實用優(yōu)點。[0089]LAMP代表環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，能夠在等溫條件(約60°C )下高特異性、高效率和快速擴增DNA。由于其擴增反應(yīng)的特點，LAMP能夠在擴增過程中區(qū)分單核苷酸差異。因此，LAMP已被用于SNP (單核苷酸多態(tài)性)分型。LAMP已在檢測病毒RNA中的靈敏度比RT-PCR高約十倍。此外，由于DNA的LAMP擴增可以直接與增加溶液渾濁度的焦磷酸鎂的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)，因此使用簡單的濁度計就可以監(jiān)測LAMP的進(jìn)展。因此，非均質(zhì)分析可以用來檢測LAMP產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物。
[0090]在一個方面中，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行樣品的數(shù)字環(huán)介導(dǎo)擴增的方法。該方法可以包含在微流體裝置上產(chǎn)生樣品的多個液滴，其中多個液滴中的至少一個液滴含有核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)；然后在至少一個液滴中進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)擴增，以產(chǎn)生核酸分子的擴增產(chǎn)物。該方法還可以包括擴增產(chǎn)物的檢測。在一些實施方案中，該方法包括確定多個液滴中含有擴增產(chǎn)物的液滴數(shù)量；并使用多個液滴中單個液滴的體積和多個液滴中含有核酸分子的液滴數(shù)量來計算樣品中核酸分子的濃度。微流體裝置可以包括配置以形成多個液滴的多個室。采用本發(fā)明進(jìn)行數(shù)字LAMP的其它方面可見實施例3。
[0091]盡管NASBA和LAMP有這些優(yōu)點，其一個重要的缺點是難以進(jìn)行定量化，而定量化在大多數(shù)情況中都是有益的。定量通常要求在相同的條件下使用標(biāo)準(zhǔn)擴增產(chǎn)物進(jìn)行謹(jǐn)慎的校準(zhǔn)和控制，這可能非常單調(diào)(特別是對于現(xiàn)場研究)，并且在許多情況下不實用。對于非均質(zhì)分析，如檢測LAMP中的沉淀，準(zhǔn)確的校準(zhǔn)可能尤其有挑戰(zhàn)性。
[0092]滾環(huán)擴增(RCA)是一種等溫核酸擴增法。這種方法在幾個方面與聚合酶鏈反應(yīng)和其它核酸擴增方案有區(qū)別。在RCA過程中，短DNA探針退火到感興趣的DNA，如病原生物的DNA或含有有害突變的人類基因。然后，探針充當(dāng)滾環(huán)擴增反應(yīng)的引物。探針的自由端退火到小的環(huán)狀DNA模板。加入DNA聚合酶以延伸引物。DNA聚合酶沿著環(huán)狀DNA模板不斷延伸引物，生成由該環(huán)狀模板的許多重復(fù)拷貝構(gòu)成的長的DNA產(chǎn)物。在反應(yīng)結(jié)束時，聚合酶生成幾千個環(huán)狀模板的拷貝，拷貝鏈與原始靶DNA相連。這允許靶標(biāo)具有空間分辨率，和信號的快速擴增。正向和反向引物的使用可以將上述線性擴增反應(yīng)改變?yōu)樵谝粋€小時內(nèi)生成多達(dá)1012個拷貝的指數(shù)模式。這種定量測量要求的校準(zhǔn)可能比較麻煩。
[0093]為了克服這一缺點，本發(fā)明提供了數(shù)字等溫擴增，如NASBA和LAMP，其中與數(shù)字PCR類似，數(shù)字化體積陣列的使用用于進(jìn)行數(shù)字NASBA、數(shù)字LAMP和滾環(huán)擴增。此外，通過使用濃度梯度和/或不同大小的數(shù)字化體積陣列，我們可以有效地擴大這些數(shù)字測量的動態(tài)范圍。本方法理想地補充了這些等溫擴增方案，使其成為用于測量是否存在RNA和DNA的定量技術(shù)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本方法應(yīng)用于基于抗體的擴增。在另一個實施方案中，該方法應(yīng)用于基于特異性分子識別的擴增。
[0094]II1.數(shù)字測量的系統(tǒng)
[0095]在又一個方面中，本發(fā)明提供了一種系統(tǒng)，用于使用數(shù)字測量測定樣品濃度。該系統(tǒng)可以包括含有具有第一體積分布的第一多個液滴的樣品容器；用于探測第一多個液滴的至少一個液滴中含有的可檢測試劑的探測器；以及包括存儲有可執(zhí)行指令的存儲裝置的計算機，所述指令由處理器執(zhí)行時，可以使處理器:分析具有第二體積分布的第二多個液滴，以確定第二多個液滴中的液滴的體積以及第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴數(shù)量，其中第一體積分布與第二體積分布是相同的或不同的；并且使用第二多個液滴中的液滴體積和第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴數(shù)量確定樣品的濃度。在一些實施方案中，樣品中可檢測試劑的濃度用于計算樣品的濃度。
[0096]如本文進(jìn)一步描述，用于數(shù)字測量的體積可以通過多種方式生成和分析。本發(fā)明包括樣品容器，所述容器用于容納體積，以使體積可以進(jìn)一步被處理和/或分析。本發(fā)明的樣品容器包括試管、微量離心管、微陣列上或微流體芯片中的孔陣列、配置以生成液滴的微流體芯片、以及市售或一般地公知的能夠容納樣品的離散體積(例如，孔或液滴)的裝置。本發(fā)明的系統(tǒng)還包括配置用于分析體積的檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)可以包括用于分析體積成分、確定液滴體積和/或其它感興趣特征的探測器。本文所述的方法一般可以與任何已知的能夠檢測和分析體積(例如，液滴和/或孔)的系統(tǒng)相容。
[0097]在又一個方面中，該系統(tǒng)可以包括計算機可讀取的存儲介質(zhì)，用于進(jìn)行數(shù)字測量。計算機可讀取的存儲介質(zhì)在其上存儲有指令，在計算機的一個或多個處理器執(zhí)行這些指令時會使計算機:分析具有第二體積分布的第二多個液滴，以確定第二多個液滴中的含有可檢測試劑的液滴數(shù)量，其中第一多個液滴包含第二多個液滴，并且第二體積分布比第一體積分布更窄；并且使用第二多個液滴中的液滴的數(shù)量、第二多個液滴中一些或所有液滴的體積以及第二多個液滴中的含有一種或多種可檢測試劑的液滴數(shù)量來確定樣品中可檢測試劑的濃度。
[0098]在又一個方面中，提供了用于進(jìn)行體積分析并且從分析的體積中檢測和計算信息的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括一個或多個處理器，以及包含可由一個或多個處理器執(zhí)行的指令的存儲裝置。當(dāng)這些指令被一個或多個處理器執(zhí)行時，該系統(tǒng)至少接收用戶輸入來進(jìn)行體積分析(例如，多個液滴)。該系統(tǒng)可配置成進(jìn)行本發(fā)明方法的多個方面，例如計算體積數(shù)量(例如，液滴)、確定一種體積分布中的多個液滴的體積，并使用含有一種或多種可檢測制劑的液滴數(shù)量確定樣品中可檢測試劑的濃度。該系統(tǒng)還為用戶提供數(shù)據(jù)。提供給用戶的數(shù)據(jù)可以包括樣品中可檢測試劑的濃度或樣品的濃度。
[0099]圖3是計算機系統(tǒng)100的簡化的方框圖，該計算機系統(tǒng)100可用于本文所述的方法、介質(zhì)和系統(tǒng)中。在各種實施方案中，計算機系統(tǒng)100可用于實施以上說明和描述的任何系統(tǒng)或方法。如圖3所示，計算機系統(tǒng)100包括處理器102，通過總線子系統(tǒng)104與多個外圍子系統(tǒng)聯(lián)系。這些外圍子系統(tǒng)包括存儲子系統(tǒng)106、用戶界面輸入裝置112、用戶界面輸出裝置114以及網(wǎng)絡(luò)界面子系統(tǒng)116，所述存儲子系統(tǒng)106包括存儲器子系統(tǒng)108和文件存儲子系統(tǒng)110。
[0100]總線子系統(tǒng)104提供一種機制，使計算機系統(tǒng)100的各種組件和子系統(tǒng)能夠如預(yù)期一樣相互聯(lián)系。盡管總線子系統(tǒng)104作為單個總線示意性地顯示，但總線子系統(tǒng)的供選擇的實施方案也可使用多個總線。
[0101]網(wǎng)絡(luò)界面子系統(tǒng)116提供與其它計算機系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)的界面。網(wǎng)絡(luò)界面子系統(tǒng)116充當(dāng)從其它系統(tǒng)接受數(shù)據(jù)以及從計算機系統(tǒng)100輸出數(shù)據(jù)到其它系統(tǒng)的界面。例如，網(wǎng)絡(luò)界面子系統(tǒng)116可以使用戶計算機連接到互聯(lián)網(wǎng)并通過互聯(lián)網(wǎng)促進(jìn)通信。
[0102]用戶界面輸入裝置112可以包括鍵盤、定位設(shè)備如鼠標(biāo)、跟蹤球、觸摸板或圖形輸入板、掃描儀、條形碼掃描儀、納入顯示器的觸摸屏、音頻輸入裝置如聲音識別系統(tǒng)、麥克風(fēng)和其它類型的輸入裝置。一般地，術(shù)語“輸入裝置”的使用意在包括向計算機系統(tǒng)100輸入信息的所有可能類型的裝置和機制。
[0103]用戶界面輸出裝置114包括顯示器子系統(tǒng)、打印機、傳真機、或非可視顯示器如音頻輸出裝置等。顯示器子系統(tǒng)可以是陰極射線管(CRT)、平板設(shè)備如液晶顯示器(IXD)或投影設(shè)備。一般地，術(shù)語“輸出裝置”的使用意在包括用于從計算機系統(tǒng)100輸出信息的所有可能的類型的裝置和機制。使用一個或多個用戶界面輸出裝置114，計算機系統(tǒng)100可以輸
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[0104]存儲子系統(tǒng)106提供一個計算機可讀取的存儲介質(zhì)，用于存儲基本的編程和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。當(dāng)被處理器執(zhí)行時，軟件(程序、代碼模塊、指令)提供了本文所述的方法和系統(tǒng)的功能，可以存儲在存儲子系統(tǒng)106中。這些軟件模塊或指令可以由一個(或多個)處理器102執(zhí)行。存儲子系統(tǒng)106也可以提供一個存儲庫，用于存儲根據(jù)本發(fā)明使用的數(shù)據(jù)。存儲子系統(tǒng)106可以包括存儲器子系統(tǒng)108和文件/磁盤存儲子系統(tǒng)110。
[0105]存儲器子系統(tǒng)108可以包括多個存儲器，包括用于存儲程序執(zhí)行過程中的指令和數(shù)據(jù)的主隨機存取存儲器(RAM)118，以及用于存儲固定指令的只讀存儲器(R0M)120。文件存儲子系統(tǒng)110提供程序和數(shù)據(jù)文件的非短暫性持久(非易失)存儲，可以包括硬盤驅(qū)動器、軟盤驅(qū)動器及相關(guān)的可移動介質(zhì)、光盤只讀存儲器(CD-ROM)驅(qū)動器、光驅(qū)、可移動介質(zhì)盒以及其它類似的存儲介質(zhì)。
[0106]計算機系統(tǒng)100可以有多種類型，包括個人計算機、便攜式計算機、工作站、網(wǎng)絡(luò)計算機、主機、一體機、服務(wù)器或任何其它數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。由于計算機和網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì)不斷變化，圖3中對計算機系統(tǒng)100的描述只作為用于說明計算機系統(tǒng)的實施方案的一個具體示例。具有比圖3所描繪的系統(tǒng)更多或更少的組件的許多其它配置也是可以的。
[0107]鑒于本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的裝置、設(shè)備、系統(tǒng)和組件的具體尺寸可以根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用而容易地改變。此外，應(yīng)懂得的是，本文所述的實施例和實施方案僅出于說明性目的，可向本領(lǐng)域技術(shù)人員建議各種改變或變化，并且這些改變或變化都在本申請的精神和范圍內(nèi)以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文所述實施方案的眾多不同組合是可能的，并且這些組合方式.被視為本發(fā)明的一部分。另外，本文中與任何一個實施方案結(jié)合討論的所有特征都可以容易地調(diào)整以用于本文的其它實施方案中。在不同實施方案中針對類似特征使用的不同術(shù)語或標(biāo)記符號不一定意味著與明確規(guī)定的不同。因此，意在僅參照所附權(quán)利要求描述本發(fā)明，并不限于本文所公開的實施方案。
[0108]IV.實施例
[0109]實施例1
[0110]實施例的理論框架
[0111]該實施例描述了一個非限定性的理論框架，所述理論框架可以用來描述本文所公開的本發(fā)明的特定方面。應(yīng)當(dāng)理解的是，該實施例中描述的方法是采用本發(fā)明確定樣品濃度的眾多方法之一。在這一理論框架下，假設(shè)靶分子以單位為摩爾/體積的濃度Cs存在于樣品中。樣品分布為不同體積的數(shù)字化體積；靶分子按照泊松統(tǒng)計分布為液滴。對于數(shù)字陣列中的每個液滴，如方程式I中所示，靶標(biāo)的平均數(shù)取決于其體積Vi，和初始樣品濃度Cs:
[0112]P{n,Cs-Vi)=(('、七)exp(-Cv// ) (I)

n\
[0113]是對于溶液中靶分子的給定濃度Cs，在體積Vi的液滴中找到η個分子的概率。擴增反應(yīng)會導(dǎo)致包含一個或多個分子的液滴與空液滴區(qū)別開來，例如通過其熒光強度。在該方法中，我們只知道液滴是空的還是已被占據(jù)。有關(guān)的概率如方程式2所示:
【權(quán)利要求】
1.一種采用數(shù)字化測量確定樣品濃度的方法，所述方法包括: 生成具有第一體積分布的第一多個液滴，其中所述第一多個液滴中的至少一個液滴包含來自于所述樣品的成分； 對具有第二體積分布的第二多個液滴進(jìn)行分析，以確定第二多個液滴中的單個液滴的體積以及第二多個液滴中包含可檢測試劑的液滴的數(shù)量，其中所述第一體積分布與第二體積分布是相同的或不同的；以及 使用第二多個液滴中的單個液滴體積和第二多個液滴中包含可檢測試劑的液滴數(shù)量確定所述樣品的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一和第二體積分布為連續(xù)的體積分布。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二體積分布在產(chǎn)生步驟之前是未限定的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過合并不互溶流體而在乳液中產(chǎn)生所述第一多個液滴。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述不互溶流體包括水和油。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述乳液包括表面活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多個液滴的第二體積分布包括以下體積范圍:約100納升(nL)到約I毫微微升(fL)、約IOnL到約10fL、約InL到約100fL、約IOOnL到約I皮升(pL)、約IOnL到約10pL、約InL到約lpL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可檢測試劑是熒光的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可檢測試劑與核酸分子、肽、蛋白或其組合關(guān)聯(lián)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)或其組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可檢測試劑的濃度在至少三個數(shù)量級的動態(tài)范圍內(nèi)確定。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可檢測試劑的濃度在至少六個數(shù)量級的動態(tài)范圍內(nèi)確定。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一體積分布中的體積變化超過兩倍。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一體積分布中的體積變化超過10倍或超過100倍。
15.一種采用數(shù)字化測量確定樣品濃度的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括: 包含具有第一體積分布的第一多個液滴的樣品容器； 用于檢測在第一多個液滴中的至少一個液滴內(nèi)含有的可檢測試劑的探測劑；以及 包括存儲有可執(zhí)行指令的存儲裝置的計算機，所述指令由處理器執(zhí)行時，可以使處理器: 分析具有第二體積分布的第二多個液滴，以確定第二多個液滴中的單個液體體積以及第二多個液滴中含有可檢測試劑的液滴數(shù)量，其中所述第一體積分布與第二體積分布是相同的或不同的；以及 使用第二多個液滴中的單個液滴體積和第二多個液滴中包含可檢測試劑的液滴數(shù)量來確定所述樣品的濃度。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述第一和第二體積分布為連續(xù)的體積分布。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述第二體積分布在產(chǎn)生步驟之前是未限定的。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中通過合并不互溶流體而在乳液中產(chǎn)生所述第一多個液滴。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，其中所述不互溶流體包括水和油。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述可檢測試劑是熒光的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述可檢測試劑與核酸分子、肽、蛋白或其組合關(guān)聯(lián)。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述第一多個液滴中的至少一個液滴包括來自聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、環(huán)介導(dǎo)擴增(LAMP)或其組合的擴增產(chǎn)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述可檢測試劑的濃度在至少三個數(shù)量級的動態(tài)范圍內(nèi)確定。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述可檢測試劑的濃度在至少六個數(shù)量級的動態(tài)范圍內(nèi)確定。
25.根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述第一體積分布的體積變化超過兩倍。
26.根據(jù)權(quán)利要 求15所述的系統(tǒng)，其中所述第一體積分布的體積變化超過10倍或超過100 倍。
27.一種用于進(jìn)行樣品的數(shù)字環(huán)介導(dǎo)擴增的方法，所述方法包括: 在微流體裝置上產(chǎn)生所述樣品的多個液滴，其中所述多個液滴中的至少一個液滴含有核酸分子；以及 在所述至少一個液滴中進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)擴增，以產(chǎn)生所述核酸分子的擴增產(chǎn)物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，還包括擴增產(chǎn)物的檢測。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，還包括: 確定多個液滴中包含擴增產(chǎn)物的液滴數(shù)量；以及 使用多個液滴中單個液滴的體積和多個液滴中含有核酸分子的液滴數(shù)量計算所述樣品中核酸分子的濃度。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述微流體裝置包括配置用于形成多個液滴的多個室。
【文檔編號】G01N33/68GK103429997SQ201280012684
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月20日
【發(fā)明者】D·T·趙, B·S·藤本, A·R·甘森, G·S·言, R·M·洛倫茲 申請人:華盛頓大學(xué)商業(yè)中心