使用近紅外熒光團檢測被分析物的制作方法
【專利摘要】本申請公開了用于選擇性檢測被分析物的化合物的實施方式，以及使用所述化合物檢測被分析物的方法和試劑盒。所述化合物是包含至少一個以下通用結構的熒光團的橋接的紫精結合物，R1/R2、R2/R3、R3/R4、R5/R6、R6/R7和/或R7/R8中的至少一組一起形成取代或未取代的環(huán)烷基或芳基。
【專利說明】使用近紅外熒光團檢測被分析物
[0001]與相關申請的交叉參考
[0002]本申請要求2011年7月6日提交的美國臨時申請?zhí)?1/505，029和2011年6月29日提交的美國臨時申請?zhí)?1/502，795的全文，每個所述臨時申請以其全文通過參考并入本文。
【技術領域】
[0003]本申請公開了用于檢測被分析物的包含近紅外熒光團的化合物、方法和試劑盒的實施方式。
[0004]政府支持聲明[0005]本申請利用國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的R01EB002044號政府支持做出。美國政府在本發(fā)明中享有一定權利。
【背景技術】
[0006]簡化的診斷測試的障礙在于當前的臨床化學技術需要顯著的樣品制備和處理來分析復雜的生物樣品。樣品制備是診斷學中的主要瓶頸。能夠在無需樣品處理或分離步驟的條件下直接在被分析物介質(例如血、尿)中發(fā)揮作用的用于特定生物標志物的指示劑熒光團將需要較少的操作，從而產(chǎn)生更快速的結果并減少由樣品處理造成的潛在健康危害。然而，開發(fā)這樣的熒光團取得的進展令人吃驚地少。這至少部分是由長波長探針的相對缺乏造成的。
[0007]常規(guī)使用的近紅外(NIR)活性染料或熒光團的類型相對少，并且目前僅有一種NIR染料被批準用于臨床使用。NIR染料的優(yōu)點包括來自于生物樣品的干擾性吸收和熒光極小、廉價的激光二極管激發(fā)、以及散射小和組織穿透深度增強。然而，僅有相對少類型的這種染料可以容易地獲得。它們包括酞菁、花青染料和方酸染料。每種染料類型具有固有的強度和限制。例如，幾乎所有已確立的長波長熒光團類型都具有非常小的斯托克斯位移(即發(fā)射-激發(fā)波長差)，例如 IOnm (Miller, Springer Ser.Fluoresc., 2008, 5, 147-162)。如果與相對寬譜帶的光源例如LED聯(lián)合使用，可能存在顯著的散射光背景信號，產(chǎn)生不良的信噪比。
[0008]以前的研究調查了用于生物診斷和成像應用的紅移性氧雜蒽染料。長波長的基于氧雜蒽的染料已被用于細胞成像應用中。然而，它們的光譜性質未落于便于檢測血液中的被分析物的700-800nm的有用的NIR “血液窗口”的范圍內。羅丹明是“紅色”或長波長氧雜蒽染料。一種值得注意的長波長氧雜蒽染料是羅丹明800，其在取決于溶劑而比700nm高或低數(shù)納米的紅光與NIR的交界處發(fā)射。然而，它的缺點在于有限的水溶性和二聚體形成，以及16nm的小的斯托克斯位移(Sauer等,J.Fluoresc., 1995, 5, 247-261),這使血液中的分析復雜化。另一種新發(fā)明包括“JA”染料，其通過向含氮環(huán)添加雙鍵而使光譜向更長波長遷移(Sauer等,美國專利號5，750，409)。Arden-Jacob和合作者開發(fā)了一系列改進的用于紅光區(qū)域中的生物診斷的熒光團。然而，這些染料顯示出相當小的斯托克斯位移，并且在NIR中不吸收或發(fā)射(美國專利號5，750，409)。
[0009]成環(huán)是用于產(chǎn)生較長波長熒光團的另一種方法。[c]型成環(huán)的氧雜蒽包括由Haugland開發(fā)的半蔡并突光素(seminaphthof luorescein) (SNAFL)和半蔡并羅丹突光素(seminaphthorhodafluor) (SNARF)化合物(Whitaker 等，Anal.Biochem.，1991，194，330-344)，其已被用作比率pH傳感器、金屬離子傳感器和成像探針。(Chang 等，PNAS, 2004，101，1129-1134 ；Nolan 等，J.Am.Chem.Soc.，2007，129，5910-5918.)
[0010]生物學重要的硫醇的檢測已成為許多研究的焦點。不同的天然存在的硫醇可能具有類似結構，但可能具有相當不同的生理性質。對這些硫醇所觀察到的生理效應和關聯(lián)性引起公共健康關注。具有或多或少類似的結構但具有完全不同的生理性質的低分子量硫醇的實例包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hey)、谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸和青霉胺。
[0011]谷胱甘肽是醫(yī)學專業(yè)人員特別感興趣的。谷胱甘肽水平是氧化應激的指示。此外，低谷胱甘肽水平可能與例如線粒體疾病、自閉癥和汞中毒相關。
[0012]硫醇容易被氧化，并且通常是無色的并且在可見光波長處無熒光。大多數(shù)報道的用于檢測硫醇的方法都基于非特異性氧化還原化學、免疫測定法或者基于用發(fā)色團或熒光團衍生化。用于檢測硫醇的通用方法不容易區(qū)分結構類似的物質。對用于檢測和定量生物硫醇的改進的方法，存在著顯著需求。
[0013]甲基紫精(MV2+)是4，4’ -聯(lián)吡啶基二價陽離子:
[0014]
【權利要求】
1.式1、式II或式III的化合物，其包含橋接的紫精骨架以及取代基Ra和Rb:
2.權利要求1的化合物，其中Ra和Rb中的至少一個是具有通式(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(X)或(xi)的結構的突光團:
3.權利要求1的化合物，其中R13是所述連接基并且是式-COO-的連接基。
4.權利要求1的化合物，其中Ra和Rb兩者都是熒光團，每個熒光團獨立地具有按照通式(i)選擇的結構。
5.權利要求4的化合物，其中Ra和Rb具有相同的結構。
6.權利要求1的化合物,其中Ra和Rb中的一個是通式(i)的熒光團，并且#和Rb中的另一個是低級烷基腈、低級烷基取代的苯基、烯基、炔基、取代的香豆素、縮醛或羧酸化物基團。
7.權利要求6的化合物，其中所述Ra和Rb中的另一個是
8.權利要求1的化合物，其中X1是氧。
9.權利要求1的化合物，其中R13是-COO-并形成內酯環(huán)，并且R1-R12中的至少一個是所述連接基。
10.權利要求2的化合物，其中R13是-COO-并形成內酯環(huán)，并且R1-R12或R15-R22中的至少一個是所述連接基。
11.權利要求1的化合物，其中所述化合物包含至少一個與可離子化部分相鄰布置的鹵素原子。
12.權利要求1的化合物，其中通式(i)的熒光團在大于或等于700nm的波長處具有發(fā)射光譜最大值。
13.權利要求12的化合物，其中所述發(fā)射光譜最大值出現(xiàn)在大于或等于750nm的波長處。
14.權利要求1的化合物，其中通式(i)的熒光團具有大于或等于80nm的斯托克斯位移。
15.權利要求14的化合物，其中所述斯托克斯位移大于或等于lOOnm。
16.權利要求2的化合物,其中所述突光團具有通式(iii)、(iv)、(ix)或(X)的結構，其中X1是氧并且R18是鹵素、羥基、硫醇、氨基、烷基氨基或烷氧基。
17.權利要求2的化合物，其中所述熒光團具有通式(iv)的結構，其中X1是氧并且R19是羥基、硫醇、氧、亞氨基、亞胺離子、烷基亞氨基、烷基亞胺離子、氨基或烷基氨基。
18.權利要求17的化合物，其中R18是鹵素、羥基、硫醇、氨基、烷基氨基或烷氧基。
19.權利要求2的化合物，其中所述熒光團具有通式(vi)的結構，其中R17是鹵素、羥基、硫醇、氨基、烷基氨基或_NHR%并且R2tl是氧、硫、亞氨基、亞胺離子、烷基亞胺離子或-MlRc。
20.權利要求2的化合物，其中所述熒光團具有通式(iii)的結構，其中X1是氧并且R6和R16是_NHR%或者所述熒光團具有通式(iv)的結構，其中X1是氧并且R16和R21是-NHIT。
21.用于檢測被分析物的方法，所述方法包括:通過將包含被分析物的樣品與權利要求1-20任一項的化合物合并來形成溶液； 允許所述溶液中所述被分析物與所述化合物之間的反應進行有效的時間段，以在所述溶液的吸收光譜、發(fā)射光譜或兩者中產(chǎn)生可檢測的變化，其中所述變化指示存在所述被分析物；以及 檢測所述變化。
22.權利要求21的方法，其中檢測所述變化包括: 將所述溶液暴露于光源下；以及 通過檢測來自于所述化合物的熒光，來檢測所述被分析物。
23.權利要求22的方法，其中所述光源具有190nm至850nm范圍內的波長。
24.權利要求22的方法，其中檢測來自于所述化合物的熒光包括在所述反應已進行所述有效的時間段后，檢測與所述化合物的發(fā)射光譜最大值相對應的波長處的熒光。
25.權利要求24的方法，其中所述化合物在大于或等于700nm的波長處具有發(fā)射光譜最大值。
26.權利要求25的方法， 其中所述化合物在大于或等于750nm的波長處具有發(fā)射光譜最大值。
27.權利要求24的方法，其還包括通過在與所述化合物的發(fā)射光譜最大值相對應的波長處測量來自于所述化合物的熒光的量，對所述被分析物進行定量。
28.權利要求21的方法，其中所述樣品包括生物流體。
29.權利要求28的方法，其中所述生物流體包括血或尿。
30.權利要求21的方法，其中所述被分析物包含半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽或其組合。
31.權利要求21的方法，其中所述被分析物包含半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷、或琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷與琥珀?；佘盏慕M合。
32.權利要求31的方法，其中所述化合物包含至少一個通式(vi)的熒光團，其中 R1、R4> R5和R8獨立地是氣、羥基、硫醇、低級烷基、竣基烷基、氣基、取代的氣基、烷氧基或鹵素； R15-R18獨立地是氫、鹵素、羥基、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基或-NHIT ； R19-R22獨立地是氫、羥基、硫醇、鹵素、氧、亞氨基、亞胺離子、烷基亞氨基、烷基亞胺離子、氨基、烷基氨基或-NHIf;并且 R1、R4、R5、R8-R13, R15、R16、R18、R19、R21或R22中的至少一個是將所述熒光團共價結合到所述紫精骨架的連接基。
33.權利要求32的方法，其中R13是所述連接基并且是式-COO-的連接基。
34.權利要求32的方法，其中所述被分析物是谷胱甘肽，R17是羥基、氨基或烷基氨基，并且R2°是氧、羥基、氨基、烷基氨基、亞氨基或烷基亞胺離子。
35.權利要求32的方法，其中所述被分析物是琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀?；佘栈蚱浣M合，R17和R2°中的至少一個是-NHIT，R13是-C00R14，其中R14是氫或低級烷基，并且R9、R10> Rn或R12中的一個是所述連接基。
36.權利要求31的方法，其中所述被分析物是琥珀?；?5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀?；佘栈蚱浣M合，并且所述化合物包含至少一個通式(iii)的熒光團，其中X1是氧并且R6和R16是_NHR%或者所述化合物包含至少一個通式(iv)的熒光團，其中X1是氧并且R16 和 R21 是-NHR。。
37.權利要求21的方法，其中檢測所述變化包括在所述反應已進行所述有效的時間段后，在一個或多個波長處檢測所述溶液的吸光度的變化。
38.權利要求21的方法，其中檢測所述變化包括將在將所述樣品與所述化合物合并后的第一時間時所述溶液的吸收光譜，與所述反應已進行所述有效的時間段后所述溶液的吸收光譜進行比較。
39.權利要求21的方法，其中檢測所述變化包括將在將所述樣品與所述化合物合并后的第一時間時所述溶液的發(fā)射光譜，與所述反應已進行所述有效的時間段后所述溶液的發(fā)射光譜進行比較。
40.權利要求21的方法，其中檢測所述變化包括將在與所述化合物反應之前所述溶液的顏色，與在與所述化合物反應所述有效的時間段之后所述溶液的顏色進行比較。
41.用于檢測被分析物的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種權利要求1-20任一項的化合物，其中所述化合物在與 包含所述被分析物的樣品合并時，與不包含所述被分析物的樣品中的所述化合物相比，會發(fā)生吸收光譜和/或發(fā)射光譜的變化。
42.權利要求41的試劑盒，其中所述樣品是生物流體。
43.權利要求41的試劑盒，其還包含至少一種緩沖溶液，在所述緩沖溶液中，所述化合物在與包含所述被分析物的樣品合并時，與當與所述緩沖溶液和不包含所述被分析物的樣品合并時的所述化合物相比，會發(fā)生吸收光譜和/或發(fā)射光譜的變化。
44.權利要求41的試劑盒，其中所述被分析物包含谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀?；佘?、或琥珀?；?5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷與琥珀酰基腺苷的組合。
45.權利要求44的試劑盒，其中所述化合物包含至少一個通式(vi)的熒光團,其中 R1、R4> R5和R8獨立地是氣、羥基、硫醇、低級烷基、竣基烷基、氣基、取代的氣基、烷氧基或鹵素； R15-R18獨立地是氫、鹵素、羥基、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基或-NHIT ； R19-R22獨立地是氫、羥基、硫醇、鹵素、氧、亞氨基、亞胺離子、烷基亞氨基、烷基亞胺離子、氨基、烷基氨基或-NHIf;并且 R1、R4、R5、R8-R13, R15、R16、R18、R19、R21或R22中的至少一個是將所述熒光團共價結合到所述紫精骨架的連接基。
46.權利要求44的試劑盒，其中所述化合物包含至少一個通式(iii)的熒光團，其中X1是氧并且R6和R16是_NHR%或者所述化合物包含至少一個通式(iv)的熒光團，其中X1是氧并且R16和R21是-NHRc0
47.權利要求41的試劑盒，其還包含用于評估由所述化合物與所述被分析物之間的反應產(chǎn)生的顏色變化的顏色對比圖。
48.權利要求41的試劑盒，其還包含多個一次性容器，所述化合物與所述被分析物之間的反應可以在所述容器中進行。
49.權利要求48的試劑盒，其中在所述多個一次性容器中預先稱量在與所述被分析物反應時有效地發(fā)生吸收光譜、發(fā)射光譜或兩者的可檢測變化的量的所述化合物。
【文檔編號】G01N33/50GK103748091SQ201280039809
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權日:2011年6月29日
【發(fā)明者】羅伯特·邁克爾·斯特龍金, 馬莎·薩伯瑞恩-巴斯克斯, 若熱·奧馬爾·埃斯科韋多科多瓦, 馬克·艾倫·勞里 申請人:由俄勒岡州高等教育委員會代表的波特蘭州立大學