專利名稱：利用[Co(NH₃)₆]³⁺-DNA共振光散射探針定量檢測蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種共振光散射技術(shù)檢測分析蛋白質(zhì)含量的方法，屬于蛋白質(zhì)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)最重要的物質(zhì)之一，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)種類及其含量的測定對于生化分析和疾病診斷具有十分重要的意義。目前，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測定方法有吸光光度法(包括凱氏定氮法、雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)法)和熒光光度法。其中吸光光度法主要缺點(diǎn)是靈敏度較低，不能用于分析蛋白質(zhì)濃度較低的生物樣品；熒光光度法僅限于具有熒光的體系，使其適用范圍受到限制。還有出現(xiàn)的一些發(fā)明方法，如歐洲專利G01N33/68A12、美國專利US2010047913等，將液相層析和質(zhì)譜聯(lián)用，雖然提高了檢測的靈敏度及準(zhǔn)確性，但是由于設(shè)備昂貴、耗時較長、操作較復(fù)雜，限制了其使用。因此尋找新的蛋白質(zhì)檢測方法具有重要的意義。共振光散射(Resonance Light Scattering, RLS)分析方法是一種能在普通突光分光光度計上進(jìn)行測量的光散射分析技術(shù)，在研究生物大分子識別、組裝和聚集時出現(xiàn)靈敏而豐富的信號，可取得與常用的熒光法同樣高的靈敏度。1993年，Pasternack等首次用共振光散射技術(shù)研究實現(xiàn)了卟啉類化合物在核酸上的聚集。目前這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子的定量檢測，以及用于生物大分子間、生物大分子與其他物質(zhì)之間相互作用機(jī)理的研究?，F(xiàn)有文獻(xiàn)的報道中，大多采用有機(jī)染料探針或金屬離子指示劑對生物大分子蛋白質(zhì)和核酸展開共振光散射光譜分析，還有利用量子點(diǎn)共振光散射來定量檢測蛋白質(zhì)等生物大分子等。但對于簡單金屬絡(luò)合物[Co (NH3)6P+-DNA-蛋白質(zhì)體系的共振光散射研究及其在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測蛋白質(zhì)的方法，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測出實際樣品中的痕量蛋白質(zhì)含量。根據(jù)共振光散射理論，粒子體積的增大和強(qiáng)靜電結(jié)合及大結(jié)合數(shù)所導(dǎo)致的高度的電子離域共軛，都會產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振光散射現(xiàn)象。本發(fā)明中，六氨合鈷離子與DNA分子發(fā)生靜電結(jié)合，同時由于DNA與蛋白質(zhì)分子相互交聯(lián)在一起，形成生物復(fù)合體。最終形成[Co(NH3)6]3+-DNA-蛋白質(zhì)體系，導(dǎo)致蛋白質(zhì)體積急劇增大，相應(yīng)的共振光散射信號較之蛋白質(zhì)、[Co(NH3)6]3+-蛋白質(zhì)、DNA-蛋白質(zhì)體系都得以強(qiáng)烈的增強(qiáng)。本發(fā)明利用上述特性和原理，在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，共振光散射的信號增強(qiáng)與蛋白質(zhì)的濃度具有線性關(guān)系，從而能夠檢測出含很低濃度的蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣品。技術(shù)方案包括如下步驟:
1.依次力卩 A 0.7mL10 u g/mL 的小牛胸腺 DNA(ctDNA)溶液，1.5mL 的Britton-Robinson (BR)緩沖溶液(pH3.78) ,0.1mL 的 lmmol/L[Co (NH3)6] Cl3 溶液，每加一種試劑都將體系用旋渦混合器混合。最后在上述混合溶液中，分別加入I組蛋白質(zhì)含量為0 2.0ii g/mL已知濃度且濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液，以及待測的未知濃度的實驗組蛋白質(zhì)溶液。最后分別將各個混合溶液搖勻，再用二次蒸餾水稀釋至10mL。
2.將上述步驟I所得的各種混合溶液，于混合搖勻后放置I小時，在熒光分光光度計上進(jìn)行同步掃描(Xex= X em),獲得200.0nm 700.0nm之間的RLS光譜，并在346.0nm處測定RLS強(qiáng)度。設(shè)定掃描的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，負(fù)高壓為400V。3.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液的已知蛋白質(zhì)濃度(C)與其增強(qiáng)的共振光散射強(qiáng)度(Al)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到測量蛋白質(zhì)的線性范圍、線性回歸方程Al = aC+b，以及線性相關(guān)系數(shù)。4.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和實驗組蛋白質(zhì)溶液增強(qiáng)的共振光散射強(qiáng)度，計算實驗組蛋白質(zhì)溶液濃度。本發(fā)明的有益效果是:利用[Co(NH3)6]3+-DNA-蛋白質(zhì)體系產(chǎn)生共振光散射信號的強(qiáng)烈增強(qiáng)現(xiàn)象，用于定量檢測不同樣品中痕量蛋白質(zhì)的含量，具有靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、經(jīng)濟(jì)實用等特點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)痕量定量檢測領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)質(zhì)量檢測、食品營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)檢測、臨床醫(yī)學(xué)、疾病診斷等領(lǐng)域具有應(yīng)用價值。


圖1為不同蛋白質(zhì)體系的共振光散射光譜2為檢測牛血清白蛋白(BSA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實施例方式實施例1:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線1.DNA貯備液:準(zhǔn)確稱量小牛胸腺DNA (ctDNA，Sigma D-1501)，直接溶于二次蒸餾水中配制成IOii g/mL的溶液，于0 4°C冰箱中保存；BSA貯備液:準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白(BSA)，直接溶于二次蒸餾水中配成100 u g/mL的溶液，于0 4°C冰箱中保存；配制pHl.8 11.9的一系列Britton-Robinson(BR)緩沖溶液；以CoCl2 6H20為原料，制得[Co (NH3)6] Cl3晶體，直接溶解于二次蒸餾水中，配制成Krtiol/L的儲備液。2.分別在IOmL比色管中，依次加入0.7mL10 u g/mL的ctDNA貯備液，1.5mL的BR緩沖溶液(PH3.78),0.lmLlmmol/L 的[Co (NH3) 6] Cl3 溶液，以及分別加入 0.005mL、0.008mL、
0.01mL、0.03mL、0.05mL、0.08mL、0.10mL、0.12mL、0.15mL、0.2OmL 的 100 u g/mL BSA 忙備液作為標(biāo)準(zhǔn)組溶液。每加一種試劑都將體系用旋渦混合器混合，最后將試液用二次蒸餾水稀釋至刻度。3.將上述步驟2所得的BSA標(biāo)準(zhǔn)組溶液，于混合搖勻后放置I小時，在熒光分光光度計上進(jìn)行同步掃描(入ex = X em),獲得200.0nm 700.0nm之間的RLS光譜，并在346.0nm處測定RLS強(qiáng)度。設(shè)定掃描的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，負(fù)高壓為400V。4.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液的已知蛋白質(zhì)濃度(C)與其增強(qiáng)的共振光散射強(qiáng)度(Al)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。BSA的濃度在0.05 ii g/mL 1.20 y g/mL的范圍內(nèi)，與增強(qiáng)的RLS信號之間有良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為At = 88.80C-1.30，線性相關(guān)系數(shù)為0.991，表明該方法具有很高的靈敏度。實施例2:多種蛋白質(zhì)的響應(yīng)差別1.分別在IOmL比色管中，依次加入0.7mL10 μ g/mL的ctDNA溶液，L 5mL的BR緩沖溶液(ρΗ3.78)，0.lmLlmmol/L 的[Co (NH3) 6] Cl3 溶液，以及分別加入 0.1mL 的 100 μ g/mL的牛血清白蛋白溶液、人血清白蛋白溶液、胰島素溶液、明膠溶液、雞蛋白溶液、Y -球蛋白溶液。每加一種試劑都將體系用旋渦混合器混合，最后將試液用二次蒸餾水稀釋至刻度。2.將上述步驟I所得濃度為1.0 μ g/mL的不同種類的蛋白質(zhì)溶液，混合搖勻后各放置I小時，并在熒光分光光度計上分別進(jìn)行同步掃描(Aex= λ em)，獲得200.0nm 700.0nm之間的RLS光譜，并 在346.0nm處測定RLS強(qiáng)度，如表I所示。設(shè)定掃描的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0nm,負(fù)高壓為400V。3.由表I可知，各蛋白質(zhì)響應(yīng)信號的大小基本符合它們分子量大小的順序，也就是說該分析方法的響應(yīng)信號主要取決于蛋白質(zhì)體積的大小，這與共振光散射理論是相符合的。表I不同蛋白質(zhì)的共振光散射響應(yīng)值
權(quán)利要求
1.一種利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針定量檢測蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)依次加入小牛胸腺CtDNA溶液、Britton-Robinson(BR)緩沖溶液、[Co (NH3) 6] Cl3溶液，最后分別加入I組已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液，和待測的未知濃度的實驗組蛋白質(zhì)溶液，各個混合溶液搖勻稀釋； (2)步驟(I)所得的各混合溶液分別放置I小時后，在200.0nm 700.0nm下進(jìn)行同步熒光掃描，獲得其共振光散射光譜，并在346.0nm處測定共振光散射強(qiáng)度； (3)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液的濃度(C)與其增強(qiáng)的共振光散射強(qiáng)度(Al)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到Al與C之間的線性回歸方程，以及該方法測量蛋白質(zhì)的線性范圍； (4)根據(jù)測量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和實驗組蛋白質(zhì)溶液增強(qiáng)的共振光散射強(qiáng)度，計算實驗組蛋白質(zhì)溶液的濃度。
2.權(quán)利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，混合試劑的用量比為DNA: BR緩沖液:[Co (NH3)6] Cl3 =(7 u g ； 1.5mL: 10 4mmo 1) /1 OmT,。
3.權(quán)利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，采用pH為3.78的Britton-Robinson緩沖溶液控制待測溶液的酸度。
4.權(quán)利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，所加入幾種試劑的次序，以及每加入一種試劑都將體系旋渦混合均勻。
5.權(quán)利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，驗證了該發(fā)明方法可以應(yīng)用于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰島素、明膠、雞蛋白、Y-球蛋白，以及人血清樣本中總蛋白含量的檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用[Co(NH3)6]3+-DNA(脫氧核糖核酸)共振光散射(RLS)探針定量檢測蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明利用[Co(NH3)6]3+-DNA復(fù)合物與蛋白質(zhì)之間強(qiáng)的靜電作用，引起蛋白質(zhì)的共振光散射信號的強(qiáng)烈增強(qiáng)，來檢測標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)。在波長346.0nm處增強(qiáng)的共振光散射強(qiáng)度與BSA的濃度在0.05～1.2μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。本發(fā)明應(yīng)用于人血清白蛋白等多種蛋白質(zhì)的共振光散射響應(yīng)值差別的比較，以及實際人血清樣品中總蛋白含量的測定，均取得好的效果。方法靈敏度較高，準(zhǔn)確可靠，檢測體系簡單，為定量檢測痕量蛋白質(zhì)建立了一種實用的新方法。
文檔編號G01N21/51GK103149179SQ201310031130
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者李艷坤 申請人:華北電力大學(xué)(保定)