專利名稱：一種抗體檢測(cè)試劑盒(OmpC-IgA)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)抗大腸桿菌外膜孔道蛋白C IgA抗體的免疫分析檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
大腸桿菌是人體腸道內(nèi)的正常細(xì)菌之一，一般情況下不致病。但在某些特殊情況下，當(dāng)機(jī)體對(duì)大腸桿菌的某種蛋白過(guò)激反應(yīng)時(shí)，可發(fā)生腹痛、腹瀉等腸炎癥狀。研究表明，一種病因復(fù)雜的非特異性炎癥性腸病((Inflammatory Bowel Disease, IBD)與機(jī)體對(duì)大腸桿菌外膜孔道蛋白C的過(guò)激反應(yīng)有關(guān)，大約有50%的IBD患者血清抗OmpC的IgA抗體比正常人高2倍以上，因此，通過(guò)檢測(cè)血清中抗OmpC的IgA可以輔助診斷IBD?，F(xiàn)有檢測(cè)OmpC抗原的雙抗夾心法酶聯(lián)免疫試劑盒，但沒(méi)有檢測(cè)OmpC抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方便、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)OmpC抗體的免疫分析檢測(cè)試劑盒，具體來(lái)說(shuō)是檢測(cè)人抗大腸桿菌OmpC-1gA抗體的免疫分析檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)OmpC-1gA抗體的免疫分析檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括:包被有OmpC的微孔板、酶標(biāo)記抗人I gA抗體、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品、顯色劑、洗滌液。其中包被微孔板的OmpC是用重組的蛋白或者從大腸桿菌純化所得的蛋白。所述的酶標(biāo)記抗人IgA抗體采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到，標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶，所述偶聯(lián)方法為戊二醛法。用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。所述的洗滌液為0.05% -0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1:1)，顯色劑A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。所述的樣品稀釋液為含0.1%吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液，所述的抗體稀釋也為含0.1 %吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液。本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測(cè)血清中抗OmpC-1gA含量的方法，包括步驟:(I)用權(quán)利要求1-8任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，向OmpC包被的酶標(biāo)板孔中加入對(duì)照品或待測(cè)樣品溶液，再加入酶標(biāo)記的抗人IgA抗體，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑、終止液，用酶標(biāo)儀或化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定吸光度值；(2)分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為:將OmpC包被在固相載體上，加入待檢測(cè)樣品或?qū)φ掌?，樣品或?qū)φ掌分械目筄mpC抗體就跟固相載體上的OmpC蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，用洗滌液去除無(wú)關(guān)的成分，然后加入酶標(biāo)記的抗人IgA抗體，酶標(biāo)抗體與微孔板上的抗原-抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，通過(guò)洗滌出去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中含抗OmpC-1gA抗體的量呈正相關(guān)，與陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)所得的值進(jìn)行比較即可得出樣品中是否含有抗OmpC-1gA抗體，以及抗體的含量多少。
具體實(shí)施例方式提供下述實(shí)施例是為了更好地理解本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1大腸桿菌OmpC制備試劑及儀器I)試劑大腸桿菌宿主菌DH5 a、BL21 (DE3)，克隆載體pCR2.lT-vector，表達(dá)質(zhì)粒pET28a (+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA連接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性內(nèi)切酶BamH
I,Hind III 和 EcoR 1.BamH I, DL2000DNA Marker、T4DNA 連接酶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，DNA膠回收試劑盒，IPTG等2)儀器普通搖床SCS-24 ;隔水式恒溫電熱培養(yǎng)箱；Biophotometer分光光度計(jì)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)Centrifuge 5810R、臺(tái)式離心機(jī)MiniSpin ;高速冷凍離心機(jī)；蛋白質(zhì)電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)；PCR儀；超聲裂解儀；恒溫金屬?。籋IS蛋白純化柱等。3)實(shí)驗(yàn)方法載體構(gòu)建設(shè)計(jì)引物ATTG GATC CGCT CCGAAAGA 和 TCTC GAGT TAAG CCTG CGGCT 從模板 DNA中PCR擴(kuò)增出OmpC片段，膠回收試劑盒回收片段后連接到pCR2.1克隆載體進(jìn)行測(cè)序鑒定。將鑒定正確的序列克隆至表達(dá)載體pET28a(+)中，酶切位點(diǎn)為EcoR 1.BamH I，同時(shí)載體上有6XHIS標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化。表達(dá)將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，通過(guò)抗性篩選陽(yáng)性表達(dá)菌株。將篩選出來(lái)的陽(yáng)性菌液按1: 1000的比例接種加有Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，每個(gè)菌接種兩管，一管用于誘導(dǎo)，另一管用于非誘導(dǎo)對(duì)照，同時(shí)要接種一管空質(zhì)粒菌作對(duì)照。37°C過(guò)夜培養(yǎng)至0D600值約為0.4-0.6時(shí)，誘導(dǎo)管和空質(zhì)粒對(duì)照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導(dǎo)對(duì)照不加，最終選擇表達(dá)能力高的兩個(gè)菌，用于大量的蛋白的表達(dá)。并按照常規(guī)的SDS-PAGE方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。純化將表達(dá)的產(chǎn)物用HIS蛋白純化柱純化蛋白，經(jīng)測(cè)定純化后的蛋白濃度為403mg/L。實(shí)施例2酶標(biāo)抗人IgA抗體制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗抗體:將抗人IgA抗體與辣根過(guò)氧化物酶通過(guò)戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)記抗人IgA抗體。方法是將IOmgHRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH6.80.mo I/LPBS 中，將IOmg HRP溶于0.2mol/LpH5.6醋酸鹽緩沖液Iml中，溶解混勻，后加入0.1mol/L Na104溶液1ml，混勻，置冰箱20min，取出加入0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml,室溫放置30min后,加入含5mg抗人IgA抗體的水溶液(或PBS) Iml,混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH值9.6碳酸鈉緩沖液緩慢攪拌透析6h (或過(guò)夜)使之結(jié)合，然后取出加NaBH4溶液(5mg/ml) 0.2ml，置冰箱2h。將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放置30min，離心，取上清，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH值7.4PBS中，并對(duì)之透析過(guò)夜。次日再離心除去不溶物，即得酶抗體結(jié)合物。用002mol/L、pH值7.4PBS加至5ml，進(jìn)行測(cè)定后，冷凍干燥或低溫保存。加60%甘油PBS，分裝保存?zhèn)溆谩?shí)施例3微孔板包被包被緩沖液:pH9.60.5mol/L的碳酸氫鈉緩沖液封閉液:I % BSA (牛血清白蛋白)的PBS溶液用包被緩沖液將OmpC稀釋，每孔加入100ul，37°C溫育2h或4°C過(guò)夜；傾去包被液，用洗滌液洗滌5次，每次Imin ;拍干，然后在每孔中加入200ul封閉液，37°C溫育2h ;傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例4免疫分析檢測(cè)方法建立4.1確定最佳酶標(biāo)抗人IgA抗體反應(yīng)濃度(I)用100ng/ml人IgA進(jìn)行包被，洗滌(2)將酶標(biāo)抗人IgA抗體用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫，洗漆。(3)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀讀取吸光度(450nm)。取OD值為1.0時(shí)的酶標(biāo)抗人IgA抗體的工作濃度為最佳濃度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表1.
表I
權(quán)利要求
1.種檢測(cè)大腸桿菌OmpC IgA抗體的檢測(cè)試劑盒,其中包括:包被有OmpC的微孔板、酶標(biāo)記抗人IgA抗體、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品、底物顯色劑、洗滌液、反應(yīng)終止液、樣品稀釋液。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述OmpC是從大腸桿菌純化，或通過(guò)基因工程方法獲得的重組蛋白。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)記抗人IgA抗體所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陰性對(duì)照品是OmpC-1gA陰性人血清經(jīng)56°C I小時(shí)滅活，除菌過(guò)濾所得。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性對(duì)照品是OmpC-1gA陽(yáng)性人血清經(jīng)56°C I小時(shí)滅活，除菌過(guò)濾，用10% (v/v)胎牛血清、0.1% (v/v)Proclin300,pH7.5的磷酸鹽緩沖液1: 100稀釋。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的顯色劑含過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲或類似物以及鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。
7.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述的洗滌液為含0.05% -0.5%吐溫-20磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液。
8.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述的樣品稀釋液為含0.1%吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液。
9.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)樣品中抗大腸桿菌OmpC-1gA的酶聯(lián)免疫試劑盒，在檢測(cè)抗大腸桿菌OmpC-1gA的酶聯(lián)免疫中的應(yīng)用，其步驟是: (1)用權(quán)利要求1-8任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，向OmpC包被的酶標(biāo)板孔中加入對(duì)照品或待測(cè)樣品溶液，再加入酶標(biāo)記的抗人IgA抗體，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑、終止液，用酶標(biāo)儀或化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定吸光度值； (2)分析檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)大腸桿菌外膜孔道蛋白C(OmpC)的IgA抗體的檢測(cè)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于免疫分析檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的OmpC抗體試劑盒包括OmpC包被的微孔板、酶標(biāo)記的抗人IgA抗體。本發(fā)明的檢測(cè)試劑具有高準(zhǔn)確性、高特異性和高靈敏度等特點(diǎn)，可用于檢測(cè)人體組織抗OmpC IgA抗體，在某些自體免疫性疾病診斷中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/535GK103091500SQ201310062278
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者朱凡, 唐太清, 陳菲, 霍如松 申請(qǐng)人:蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司