專利名稱：一種大鼠cyp450酶質譜絕對定量方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白質組學的技術領域，涉及一種同時測定大鼠5種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法。
背景技術：
藥物進入體內后可經過代謝過程以一種或多種有活性或無活性的代謝產物形式排出體外。由于遺傳多態(tài)性及表觀遺傳的因素，使得作用于藥物代謝過程的酶有明顯的種族差異和個體差異。因此，藥物代謝酶的定性和定量分析對于藥物開發(fā)，評價藥物的代謝過程以及研究藥物-藥物相互作用具有重要的參考價值和意義。目前，用于酶定量分析的方法主要包括探針藥物法、Western bLotting法、2-D電泳法和mRNA檢測法，但這些方法都存在著一定的不足。例如，CYP450酶家族屬于同工酶，其底物常常具有交叉現象，很難找到CYP450酶絕對專一的探針藥物，至今只有極少數CYP450酶底物的專一性得到了全面的驗證；CYP450酶特別是亞家族內同工酶序列存在高度同源性，這為Western bLotting法中所需特異性抗體的制備和純化提出了很高的要求；2_D電泳法，操作連續(xù)性強，勞動密集，而且不能用于CYP450膜結合蛋白的分析；由于蛋白質的表達受到多種機制的調控，利用mRNA表達的水平代表其對應的蛋白含量并不十分可靠。這些方法的最大的不足是專屬性差，無法區(qū)分同源性很高的如CYP2B1和CYP2B2等CYP450酶亞型；并且定量時僅能給出相對含量的信息，而酶的絕對含量對于評價其生物學意義是十分重要的。因此，建立一種藥物代謝酶亞型絕對定量方法是十分必要的。與本發(fā)明相近的現有技術是CN102175804的發(fā)明專利申請。涉及的是測定人的CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法；在蛋白樣品預處理中沒有進行固相萃取和濃縮復溶，影響檢測的定量準確性。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是，建立一種可以同時測定大鼠的5種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法。涉及的CYP450酶亞型是CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2。本發(fā)明采取的技術方案是，選取經胰酶水解CYP450酶獲得的特異性肽段，其中特異性是指肽段只由其相對應的CYP450酶經胰酶水解產生，其他蛋白質經胰酶水解并不能產生該肽段?；谝合嗌V-串聯質譜(LC/MS/MS)技術，利用多重反應監(jiān)測(MRM)模式對特異性肽段進行掃描分析，建立特異性肽段穩(wěn)定、可靠的LC/MS/MS定量方法。所測得特異性肽段濃度經由蛋白濃度校正獲得CYP450酶亞型絕對含量。采取上述方法即可實現利用正常肽段定量CYP450酶亞型水平。正常肽段即是待測肽段。本發(fā)明的具體技術方案如下所述。一種大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法，涉及5種CYP450酶亞型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2 ;過程有蛋白樣品預處理，標準曲線制備，最后進行蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定；
所述的蛋白樣品預處理，有如下5步驟，( I)蛋白樣品的還原，于聚乙烯管中加入100 μ L大鼠肝微粒體樣品；加入50mg固體變性劑，渦流溶解混勻,所述的固體變性劑,是尿素；加入10 μ L pH緩沖液，渦流混勻，所述的pH緩沖液，是500mM的碳酸氫氨溶液；加入4 μ L還原劑，渦流混勻，所述的還原劑，是300mM的二硫蘇糖醇溶液；37°C孵育I小時，得到反應液；(2)半胱氨酸的封閉，于反應液中加入12 μ L半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育40min ;所述的半胱氨酸封閉劑，是300mM的碘乙酰胺溶液；(3)肝微粒體樣品的胰酶消化，經半胱氨酸封閉的反應液中加入400 μ L消化緩沖液，再加入20 μ L胰酶溶液，渦流混合，37°C孵育12 16h得到肝微粒體樣品反應液，后13000g離心5min得肝微粒體樣品酶解反應上清溶液；所述的消化緩沖液，是50mM的碳酸氫氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液；(4)肝微粒體樣品酶解反應液的固相萃取，于固相萃取柱中加入ImL甲醇溶液，至液體自然流完；于固相萃取柱中加入ImL洗脫溶液，至液體自然流完；于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液體自然流完，兩遍洗；取肝微粒體樣品酶解反應上清溶液，至液體自然流完；于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液體自然流完，三遍洗；于固相萃取柱中加入ImL洗脫溶液，至液體自然流完，得肝微粒體樣品洗脫液，置于聚乙烯管中；所述的洗脫溶液，是按體積比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按體積比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；(5)肝微粒體樣品洗脫液的濃縮、復溶，將肝微粒體樣品洗脫液真空離心蒸干，加入100 μ L去離子水，渦流混勻，得到肝微粒體樣品復溶液；所述的標準曲線制備，是利用去離子水將特異性肽段標準品溶解至5 μ g/ μ L，得到特異性肽段儲備液；利用去離子水將特異性肽段儲備液分別稀釋至50、100、300、1000、3000、IOOOOpg/μ L ；取20 μ L進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，以特異性肽段濃度為橫坐標，特異性肽段峰面積為縱坐標，用加權W=l/x2最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為標準曲線；所述的蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定，是取肝微粒體樣品復溶液20 μ L進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，將肽段峰面積代入標準曲線，求得肽段濃度，此肽段濃度即為對應CYP450酶亞型濃度；經樣品蛋白濃度校正，即將CYP450酶亞型濃度除以蛋白濃度，得到蛋白樣品中CYP450酶亞型含量；
在標準曲線制備及蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定過程中，色譜條件為:LC_20ADXR SHIMADZU型液相色譜系統；色譜柱:p印tide C18柱，50mmX2.1mm 1.D., 5 μ m粒徑；流動相:甲酸體積百分數占0.1%的水和甲酸體積百分數占0.1%的乙腈，梯度洗脫；柱溫40°C ;流速0.5mL/min ;進樣量20 μ L ;所述的梯度洗脫程序，過程如下表所示:
權利要求
1.一種大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法，涉及5種CYP450酶亞型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2 ;過程有蛋白樣品預處理，標準曲線制備，最后進行蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定； 所述的蛋白樣品預處理，有如下5步驟， (1)蛋白樣品的還原， 于聚乙烯管中加入100 μ L大鼠肝微粒體樣品； 加入50mg固體變性劑，渦流溶解混勻，所述的固體變性劑，是尿素； 加入10 μ L pH緩沖液，渦流混勻，所述的pH緩沖液，是500mM的碳酸氫氨溶液； 加入4μ L還原劑,潤流混勻,所述的還原劑,是300mM的二硫蘇糖醇溶液； 37°C孵育I小時，得到反應液； (2)半胱氨酸的封閉， 于反應液中加入12 μ L半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育40min ;所述的半胱氨酸封閉劑，是300mM的碘乙酰胺溶液； (3)肝微粒體樣品的胰酶消化， 經半胱氨酸封閉的反應液中加入400 μ L消化緩沖液,再加入20 μ L胰酶溶液,渦流混合，37°C孵育12 16h得到肝微粒體樣品反應液，后13000g離心5min得肝微粒體樣品酶解反應上清溶液；所述的消化緩沖液，是50mM的碳酸氫氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液； (4)肝微粒體樣品酶解反應液的固相萃取， 于固相萃取柱中加入ImL甲醇溶液，至液體自然流完； 于固相萃取柱中加入ImL洗脫溶液，至液體自然流完； 于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液體自然流完，兩遍洗； 取肝微粒體樣品酶解反應上清溶液，至液體自然流完； 于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液體自然流完，三遍洗； 于固相萃取柱中加入ImL洗脫溶液，至液體自然流完，得肝微粒體樣品洗脫液，置于聚乙烯管中； 所述的洗脫溶液，是按體積比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按體積比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液； (5)肝微粒體樣品洗脫液的濃縮、復溶， 將肝微粒體樣品洗脫液真空離心蒸干，加入100 μ L去離子水，渦流混勻，得到肝微粒體樣品復溶液； 所述的標準曲線制備，是 利用去離子水將特異性肽段標準品溶解至5 μ g/μ L，得到特異性肽段儲備液； 利用去離子水將特異性肽段儲備液分別稀釋至50、100、300、1000、3000、IOOOOpg/μ L ； 取20 μ L進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，以特異性肽段濃度為橫坐標，特異性肽段峰面積為縱坐標，用加權W=l/x2最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為標準曲線； 所述的蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定，是取肝微粒體樣品復溶液20 μ L進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，將肽段峰面積代入標準曲線，求得肽段濃度，此肽段濃度即為對應CYP450酶亞型濃度；經樣品蛋白濃度校正，即將CYP450酶亞型濃度除以蛋白濃度，得到蛋白樣品中CYP450酶亞型含量； 在標準曲線制備及蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定過程中， 色譜條件為:LC-20ADXR SHIMADZU型液相色譜系統；色譜柱:p印tide C18柱，50mmX2.1mm 1.D., 5 μ m粒徑；流動相:甲酸體積百分數占0.1%的水和甲酸體積百分數占·0.1%的乙腈，梯度洗脫；柱溫40°C ;流速0.5mL/min ;進樣量20 μ L ;所述的梯度洗脫程序，過程如下表所示:
2.根據權利要求1所述的大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法，其特征在于，樣品測定期間利用質量控制樣品對方法進行驗證；所述的質量控制樣品按照如下步驟制備: ①利用去離子水將特異性肽段標準品溶解至5μ g/μ L，得到特異性肽段儲備液； ②利用去離子水將特異性肽段儲備液分別稀釋至100、1000、3000pg/l.!L ； ③標準肽段每濃度取三個樣本，根據標準曲線，得出標準肽段濃度，計算質量控制樣品準確度。
全文摘要
本發(fā)明的大鼠CYP450酶亞型質譜絕對定量方法，屬于蛋白質組學技術領域。本發(fā)明基于LC/MS/MS技術，利用CYP450酶經胰酶水解產生的特異性肽段對酶進行定量的策略，實現了同時對大鼠肝微粒體等體系中5種CYP450酶亞型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2的絕對定量。本發(fā)明主要包括如下步驟蛋白樣品的預處理、標準曲線的制備、質控樣品的制備以及蛋白樣品的測定。本發(fā)明的方法線性關系良好、準確度高、重現性好而且靈敏、精密、可靠，可用于新藥開發(fā)、藥物代謝研究及藥物相互作用的評價。
文檔編號G01N30/88GK103149315SQ20131006172
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優(yōu)先權日2013年2月27日
發(fā)明者胡良海, 劉喜東, 孫嚴彤, 楊艷, 顧景凱 申請人:吉林大學