專利名稱：一種基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非標(biāo)記可視化檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別是涉及一種基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的飛速發(fā)展，近年來生物分析的一個(gè)重要發(fā)展方向是開發(fā)低成本的實(shí)時(shí)在線檢測(cè)方法?？梢暬瘷z測(cè)無需高精的儀器而直接將化學(xué)物質(zhì)的信息轉(zhuǎn)化為視覺可觀察的信號(hào)，是最為簡(jiǎn)單直觀的檢測(cè)方法之一。目前常用的可視化檢測(cè)方法主要是基于染料、酶及納米金等所引起的顏色變化來實(shí)現(xiàn)。在所有用于可視化檢測(cè)的材料中，膠體晶體由于其獨(dú)特的光學(xué)特性而受到了廣泛關(guān)注，任何能夠引起材料折射率或晶格常數(shù)變化的因素都能導(dǎo)致膠體晶體反射峰或顏色的變化。1998年Asher小組首次將膠體晶體與刺激響應(yīng)性水凝膠相結(jié)合制備得到的智能膠體晶體凝膠，是目前最具潛力的一類可視化檢測(cè)材料。許多膠體晶體凝膠可視化傳感器(如PH，離子，溫度，濕度及生物分子等)都被成功應(yīng)用。經(jīng)過十多年的長(zhǎng)足發(fā)展，膠體晶體凝膠可視化傳感器已取得了巨大的成就，然而，膠體晶體結(jié)構(gòu)色及反射峰強(qiáng)烈的角度依賴性是目前其在可視化檢測(cè)發(fā)展中的瓶頸之一。為了解決膠體晶體觀察視角的依賴性，圍繞可用于可視化檢測(cè)的角度無偏的膠體晶體展開了大量的研究工作。如Lee等制備了 Fe304@Si02的短程有序的準(zhǔn)無定形膠體晶體材料，并實(shí)現(xiàn)了其在可見波段區(qū)角度無偏的全彩調(diào)節(jié)。Watanabe課題組受自然界中許多生物的納米結(jié)構(gòu)啟發(fā)，同樣制備了一種角度無偏的具有短程有序結(jié)構(gòu)的膠體晶體。雖然上述材料解決了膠體晶體的視角問題，但是這些材料都采用了犧牲有序性來獲得其角度無偏性。在實(shí)際應(yīng)用中，膠體晶體有序性的降低會(huì)導(dǎo)致反射峰的變寬以及顏色鮮亮度的下降，而這些都不利于可視化檢測(cè)的開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是以膠體晶體為載體的非標(biāo)記可視化檢測(cè)的角度依賴性缺點(diǎn)，提供一種以角度無偏的膠體晶體凝膠為載體的非標(biāo)記可視化檢測(cè)方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，包括以下步驟:
首先，角度無偏的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟:
將膠體晶體微球加入水凝膠前聚體溶液中，加入引發(fā)劑，灌入模具，將膠體晶體微球鋪成均勻的薄膜，經(jīng)紫外光照射聚合或烘箱內(nèi)通過熱固化法對(duì)水凝膠前聚體溶液進(jìn)行固化，即得蛋白石結(jié)構(gòu)的膠體晶體水凝膠薄膜，將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于HF酸溶液中去除膠體晶體微球模版，2h后取出用純水洗滌后保存與純水中；其次，分子識(shí)別單元修飾的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟:
通過化學(xué)鍵偶聯(lián)方法將分子識(shí)別單元偶聯(lián)在所述膠體晶體水凝膠薄膜上，制成分子識(shí)別單元修飾的膠體晶體凝膠薄膜，將制備好的薄膜用磷酸緩沖液洗滌之后，測(cè)定膠體晶體凝膠薄膜的反射光譜；
再次，檢測(cè)步驟:
將得到的檢測(cè)用的膠體晶體凝膠薄膜在緩沖溶液中與待測(cè)樣品混合進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完畢，洗滌后比較反應(yīng)前后膠體晶體水凝膠薄膜的顏色或通過測(cè)定膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，確定待測(cè)物質(zhì)的含量。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述膠體晶體凝膠薄膜為載體，所述膠體晶體凝膠薄膜由光學(xué)各項(xiàng)同性的膠體晶體微球構(gòu)成。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分子識(shí)別單元是抗原抗體、核酸適體、RNA適體或酶中的一種。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分子識(shí)別單元是抗原抗體、核酸適體、RNA適體或酶中的一種。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的膠體晶體微球以二氧化硅納米或聚苯乙烯納米粒子為材料制成。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的水凝膠前聚體為丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、醋酸丁酸纖維素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一種或多種。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述化學(xué)鍵偶聯(lián)方法是氨基與氨基的反應(yīng)、氨基與羧基的反應(yīng)或羧基與羥基的反應(yīng)中的一種或多種組合。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的待測(cè)物質(zhì)為離子、藥物分子、毒品分子、添加齊U、小分子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、蛋白質(zhì)、酶、抗原抗體、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、腫瘤標(biāo)志物或各種生物分子中的一種。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的方法以角度無偏的膠體晶體凝膠為載體來實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記可視化檢測(cè)，該凝膠膜從各個(gè)方向觀察顏色相同，不受操作人觀察視角的限制，極大地減小了操作者的操作誤差。


圖1是本發(fā)明以角度無偏的膠體晶體凝膠制備過程示意圖 附圖中各部件的標(biāo)記如下:1、膠體晶體微球。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案
在一個(gè)實(shí)施例中，提供一種基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，包括以下步驟:
首先，角度無偏的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟:
將膠體晶體微球I加入水凝膠前聚體溶液中，加入引發(fā)劑，灌入模具，將膠體晶體微球I鋪成均勻的薄膜，經(jīng)紫外光照射聚合或烘箱內(nèi)通過熱固化法對(duì)水凝膠前聚體溶液進(jìn)行固化，即得蛋白石結(jié)構(gòu)的膠體晶體水凝膠薄膜，將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于HF酸溶液中去除膠體晶體微球I模版，2h后取出用純水洗滌后保存與純水中；
其次，分子識(shí)別單元修飾的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟:
通過化學(xué)鍵偶聯(lián)方法將分子識(shí)別單元偶聯(lián)在所述膠體晶體水凝膠薄膜上，制成分子識(shí)別單元修飾的膠體晶體凝膠薄膜，將制備好的薄膜用磷酸緩沖液洗滌之后，測(cè)定膠體晶體凝膠薄膜的反射光譜；
再次，檢測(cè)步驟:
將得到的檢測(cè)用的膠體晶體凝膠薄膜在緩沖溶液中與待測(cè)樣品混合進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完畢，洗滌后比較反應(yīng)前后膠體晶體水凝膠薄膜的顏色或通過測(cè)定膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，確定待測(cè)物質(zhì)的含量。優(yōu)選的，所述膠體晶體凝膠薄膜為載體，所述膠體晶體凝膠薄膜由光學(xué)各項(xiàng)同性的膠體晶體微球I構(gòu)成。優(yōu)選的，所述分子識(shí)別單元是抗原抗體、核酸適體、RNA適體或酶中的一種。優(yōu)選的，所述分子識(shí)別單元是抗原抗體、核酸適體、RNA適體或酶中的一種。優(yōu)選的，所述的膠體晶體微球I以二氧化硅納米或聚苯乙烯納米粒子為材料制成。優(yōu)選的，所述的水凝膠前聚體為丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、醋酸丁酸纖維素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述化學(xué)鍵偶聯(lián)方法是氨基與氨基的反應(yīng)、氨基與羧基的反應(yīng)或羧基與羥基的反應(yīng)中的一種或多種組合。優(yōu)選的，所述的待測(cè)物質(zhì)為離子、藥物分子、毒品分子、添加劑、小分子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、蛋白質(zhì)、酶、抗原抗體、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、腫瘤標(biāo)志物或各種生物分子中的一種。實(shí)施例1 角度無偏的膠體晶體凝膠檢測(cè)環(huán)境水樣中的重金屬離子Hg2+
I制備膠體晶體凝膠微球
將單分散的280 nm的二氧化娃納米粒子進(jìn)行離心純化,調(diào)節(jié)納米粒子溶液中膠體納米粒子的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為20%，超聲分散后作為微流控中的水相。外相采用為含有表面活性劑的正十六烷。收集產(chǎn)生的液滴，待其加熱固化后，放入馬弗爐內(nèi)進(jìn)行800°C煅燒以提高微球的穩(wěn)定性。2制備角度無偏的膠體晶體凝膠
角度無偏的膠體晶體凝膠以上述制備的膠體晶體微球I為模版，通過模版復(fù)制的方法來獲得。將膠體晶體微球I加入含有光引發(fā)劑1173(0.1%，質(zhì)量體積比)的丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的混合溶液中(29:1，摩爾比)，充分浸泡后，灌入模具，經(jīng)高壓汞燈照射15min后得膠體晶體凝膠。將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于4%的HF溶液中2 h，獲得反蛋白石結(jié)構(gòu)的膠體晶體凝膠。3分子識(shí)別單元的修飾
將第一步所制備的膠體晶體凝膠膜在0.1 M的NaOH (10% N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺)溶液中還原Ih后，用2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液洗滌，在MES緩沖液中加入1_乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化還原膜后，加入兩端帶氨基修飾的汞離子的適體偶聯(lián)制成適體修飾的膠體晶體凝膠，用磷酸鹽緩沖液洗滌之后，測(cè)定膠體晶體凝膠的反射光譜。4 Hg2+檢測(cè)
將制備得到的膠體晶體凝膠用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液洗滌后，在0.5 ml的Tris緩沖液中與待測(cè)水樣混合，35°C反應(yīng)I h。反應(yīng)完畢后，用Tris緩沖液洗滌，根據(jù)反應(yīng)前后膠體晶體水凝膠薄膜的顏色或通過測(cè)定膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，確定環(huán)境水樣中萊離子的含量。實(shí)施例2使用角度無偏的膠體晶體凝膠檢測(cè)艾滋病病毒(HIV)
I制備膠體晶體凝膠微球
將單分散的200 nm的二氧化娃納米粒子進(jìn)行離心純化,調(diào)節(jié)納米粒子溶液中膠體納米粒子的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為35%，超聲分散后作為微流控中的水相。外相采用為含有表面活性劑的硅油。收集產(chǎn)生的液滴，待其加熱固化后，放入馬弗爐內(nèi)進(jìn)行800°C煅燒以提高微球的穩(wěn)定性。2制備角度無偏的膠體晶體凝膠
角度無偏的膠體晶體凝膠以上述制備的膠體晶體微球I為模版，通過模版復(fù)制的方法來獲得。將膠體晶體微球I加入含有光引發(fā)劑HMPP (0.1%，質(zhì)量體積比)的15%的聚乙二醇雙丙烯酸酯溶液中，充分浸泡后，灌入模具，經(jīng)高壓汞燈照射I min后得膠體晶體凝膠。將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于4%的HF溶液中4 h，獲得反蛋白石結(jié)構(gòu)的膠體晶體凝膠。3分子識(shí)別單元的修飾
將第一步所制備的膠體晶體凝膠膜在0.1 M的NaOH (10% N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺)溶液中還原Ih后，用2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液洗滌，在MES緩沖液中加入1_乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化還原膜后，加入HIV抗體偶聯(lián)制成抗體修飾的膠體晶體凝膠，用磷酸鹽緩沖液洗滌之后，測(cè)定膠體晶體凝膠的反射光譜。4 HIV 檢測(cè)
將制備得到的膠體晶體凝膠用磷酸鹽緩沖液洗滌后，在0.5 ml的磷酸鹽緩沖液中與待測(cè)血樣混合，35°C反應(yīng)I h。反應(yīng)完畢后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，根據(jù)反應(yīng)前后膠體晶體凝膠的顏色或通過測(cè)定膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，確定HIV的含量。實(shí)施例3使用角度無偏的膠體晶體凝膠檢測(cè)尿素 I制備膠體晶體凝膠微球
將單分散的180 nm的二氧化娃納米粒子進(jìn)行離心純化,調(diào)節(jié)納米粒子溶液中膠體納米粒子的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為30%，超聲分散后作為微流控中的水相。外相采用為含有表面活性劑的正十六烷。收集產(chǎn)生的液滴，待其加熱固化后，放入馬弗爐內(nèi)進(jìn)行800°C煅燒以提高微球的穩(wěn)定性。2制備角度無偏的膠體晶體凝膠
角度無偏的膠體晶體凝膠以上述制備的膠體晶體微球I為模版，通過模版復(fù)制的方法來獲得。將膠體晶體微球I加入含有光引發(fā)劑HMPP(0.1%，質(zhì)量體積比)的聚乙二醇雙丙烯酸酯與丙烯酸的溶液中，充分浸泡后，灌入模具，經(jīng)高壓汞燈照射8 min后得膠體晶體凝膠。將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于2%的HF溶液中2 h，獲得反蛋白石結(jié)構(gòu)的膠體晶體凝膠。3分子識(shí)別單元的修飾
將第一步所制備的膠體晶體凝膠膜在0.1 M的NaOH (10% N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺)溶液中還原Ih后，用2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液洗滌，在MES緩沖液中加入1_乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化還原膜后，加入尿素酶偶聯(lián)制成尿素酶修飾的膠體晶體凝膠，用磷酸鹽緩沖液洗滌之后，測(cè)定膠體晶體凝膠的反射光譜。4尿素的檢測(cè)
將制備得到的膠體晶體凝膠用磷酸鹽緩沖液洗滌后，在0.5 ml的磷酸鹽緩沖液中與待測(cè)尿樣混合，35°C反應(yīng)0.5 h。反應(yīng)完畢后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，根據(jù)反應(yīng)前后膠體晶體凝膠的顏色或通過測(cè)定膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，確定尿素的含量。實(shí)施例4使用角度無偏的膠體晶體凝膠檢測(cè)環(huán)境溫度 I制備膠體晶體凝膠微球
將單分散的160 nm的聚苯乙烯納米粒子進(jìn)行離心純化,調(diào)節(jié)納米粒子溶液中膠體納米粒子的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為50%，超聲分散后作為微流控中的水相。外相采用為含有表面活性劑的正十六烷。收集產(chǎn)生的液滴，待其加熱固化后，放入馬弗爐內(nèi)進(jìn)行800°C煅燒以提高微球的穩(wěn)定性。2制備角度無偏的膠體晶體凝膠
角度無偏的膠體晶體凝膠以上述制備的膠體晶體微球I為模版，通過模版復(fù)制的方法來獲得。將膠體晶體微球I加入含有熱引發(fā)劑過硫酸銨及N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺(0.1%，質(zhì)量體積比)的N-異丙基丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的混合溶液中(29:1，摩爾比)，充分浸泡后，灌入模具，經(jīng)室溫聚合30 min后得膠體晶體凝膠。將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落。4溫度的檢測(cè)
將制備得到的膠體晶體凝膠置于待測(cè)溫度的環(huán)境中，根據(jù)膠體晶體凝膠的顏色或通過測(cè)定膠體晶體水凝膠的反射光譜，確定溫度。本發(fā)明通過單分散的膠體晶體微球的球形對(duì)稱結(jié)構(gòu)，該凝膠膜從各個(gè)方向觀察顏色相同，不受操作人觀察視角的限制，極大地減小了操作者的操作誤差。效果。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 首先，角度無偏的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟: 將膠體晶體微球加入水凝膠前聚體溶液中，加入引發(fā)劑，灌入模具，將膠體晶體微球鋪成均勻的薄膜，經(jīng)紫外光照射聚合或烘箱內(nèi)通過熱固化法對(duì)水凝膠前聚體溶液進(jìn)行固化，即得蛋白石結(jié)構(gòu)的膠體晶體水凝膠薄膜，將所得到的膠體晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于HF酸溶液中去除膠體晶體微球模版，2h后取出用純水洗滌后保存與純水中； 其次，分子識(shí)別單元修飾的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟: 通過化學(xué)鍵偶聯(lián)方法將分子識(shí)別單元偶聯(lián)在所述膠體晶體水凝膠薄膜上，制成分子識(shí)別單元修飾的膠體晶體凝膠薄膜，將制備好的薄膜用磷酸緩沖液洗滌之后，測(cè)定膠體晶體凝膠薄膜的反射光譜； 再次，檢測(cè)步驟: 將得到的檢測(cè)用的膠體晶體凝膠薄膜在緩沖溶液中與待測(cè)樣品混合進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完畢，洗滌后比較反應(yīng)前后膠體晶體水凝膠薄膜的顏色或通過測(cè)定膠體晶體水凝膠薄膜的反射光譜，確定待測(cè)物質(zhì)的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，其特征在于，所述膠體晶體凝膠薄膜為載體，所述膠體晶體凝膠薄膜由光學(xué)各項(xiàng)同性的膠體晶體微球構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，其特征在于，所述分子識(shí)別單元是抗原抗體、核酸適體、RNA適體或酶中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，其特征在于，所述的膠體晶體微球以二氧化硅納米或聚苯乙烯納米粒子為材料制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，其特征在于，所述的水凝膠前聚體為丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、醋酸丁酸纖維素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，其特征在于，所述化學(xué)鍵偶聯(lián)方法是氨基與氨基的反應(yīng)、氨基與羧基的反應(yīng)或羧基與羥基的反應(yīng)中的一種或多種組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，其特征在于，所述的待測(cè)物質(zhì)為離子、藥物分子、毒品分子、添加劑、小分子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、蛋白質(zhì)、酶、抗原抗體、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、腫瘤標(biāo)志物或各種生物分子中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于膠體晶體凝膠的角度無偏的可視化檢測(cè)方法，包括以下步驟角度無偏的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟；分子識(shí)別單元修飾的膠體晶體凝膠薄膜的制備步驟；檢測(cè)步驟；通過上述方法，本發(fā)明的檢測(cè)方法具有靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/78GK103175957SQ20131006551
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者顧忠澤, 葉寶芬, 趙遠(yuǎn)錦, 顧洪成, 莫丹, 曾勝瀾, 管銳 申請(qǐng)人:東南大學(xué)