專利名稱：一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織顯微制片和組織成分的化學(xué)定位技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
胼胝質(zhì)是一種以β_1，3-鍵結(jié)合的葡聚糖，在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其合成與分解直接關(guān)系植物正常的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。此夕卜，當(dāng)植物受到外界不良環(huán)境脅迫或強(qiáng)烈刺激，如病原菌侵染、營(yíng)養(yǎng)脅迫、機(jī)械損傷、高溫等逆境時(shí)，胼胝質(zhì)代謝會(huì)立即反饋并調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的生理活動(dòng)(Wang, McCallum, Fetch等，2012 ;Chapman等,2009 ;Saulnier等,2012)。逆境下,篩管分子內(nèi)會(huì)迅速合成胼胝質(zhì)并沉積到篩板的表面或篩孔內(nèi)堵塞；一旦外界刺激解除，沉積到篩板表面或篩孔內(nèi)的胼胝質(zhì)則會(huì)迅速消失，使篩管恢復(fù)正常的運(yùn)輸功能。因此，胼胝質(zhì)的沉積與消解與植物的抗性有關(guān)，抗性強(qiáng)的植物胼胝質(zhì)形成的少且遲緩(Cheng等，2012)?？傊蓦召|(zhì)代謝是植物領(lǐng)域重要的研究?jī)?nèi)容之一。小麥?zhǔn)莾赡晟魑?，在整個(gè)生活史中要遭受一系列自然逆境與生物逆境。在逆境中，小麥組織，特別是微管束中，誘導(dǎo)合成胼胝質(zhì)，影響植物對(duì)水分、養(yǎng)分的吸收與運(yùn)輸。逆境下，灌漿期小麥由于胼胝質(zhì)堵塞胞間連絲、篩管等而影響植株貯藏物質(zhì)的向籽粒中運(yùn)輸，嚴(yán)重影響灌漿速率，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此，監(jiān)測(cè)逆境中小麥微管束組織中胼胝質(zhì)合成及含量是衡量小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，是育種學(xué)家篩選優(yōu)良小麥品種的一個(gè)重要依據(jù)。目前，對(duì)于胼胝質(zhì)消長(zhǎng)過(guò)程控制機(jī)制仍不明確，加強(qiáng)研究是必要的，其中快速制片及胼胝質(zhì)精準(zhǔn)標(biāo)記定位是關(guān)鍵。常規(guī)植物組織顯微觀察制片一般是制備石蠟切片或冷凍切片。然而，制備石蠟切片，材料前處理程序繁瑣，周期長(zhǎng)，其過(guò)程包括FAA固定、脫水、浸蠟、二甲苯脫蠟等一系列步驟，并且操作中易產(chǎn)生揮發(fā)性有毒氣體，對(duì)人員造成傷害與環(huán)境污染。更重要的是，因其周期長(zhǎng)而延誤對(duì)生長(zhǎng)中的植物生長(zhǎng)狀況作出快速鑒定與補(bǔ)救措施。冷凍切片技術(shù)，雖然在動(dòng)物材料(因其細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁)切片制作上比較成熟，而在植物組織上其技術(shù)難以掌握，并且儀器價(jià)格昂貴、耗材造價(jià)高，更為嚴(yán)重的是，因材料難以固定在底座上，當(dāng)切小麥、水稻等表皮硅質(zhì)層較厚的材料時(shí)易造成顫刀，影響制片效果。因此，針對(duì)生長(zhǎng)中的植物組織進(jìn)行快速制片、快速標(biāo)記、快速檢測(cè)是判斷植物生長(zhǎng)狀況并提出應(yīng)急補(bǔ)救措施的關(guān)鍵。苯胺藍(lán)對(duì)胼胝質(zhì)會(huì)產(chǎn)生專一性反應(yīng)，在紫外光激發(fā)下能誘發(fā)出黃綠色熒光，因而可用來(lái)檢測(cè)胼胝質(zhì)沉積部位與相對(duì)含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明對(duì)小麥葉片組織、莖桿組織進(jìn)行徒手切片法制片，并應(yīng)用水溶性苯胺藍(lán)在堿性條件下對(duì)組織中沉積的胼胝質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)標(biāo)記、精準(zhǔn)定位以及其相對(duì)含量的比較，最大限度降低了操作過(guò)程中產(chǎn)生的誤差。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法，其特征是，包括以下步驟:(I)溶液的配制:固定液的配制:將乙醇與三氯甲烷按3:1 (v/v)混合后作為混合溶劑，以上述混合溶劑為溶劑配制體積分?jǐn)?shù)為0.15%的三氯乙酸溶液；染色負(fù)載緩沖液的配制:配制pH=8.5 9.5的50 150mmol/L的K2HPO4緩沖液或Tris-HCl緩沖液；然后將0.0lg水溶性苯胺藍(lán)溶解于IOOml上述緩沖液中即為染色負(fù)載液；(2)材料處理:取小麥莖、葉等組織，蒸餾水清洗干凈，若立刻進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室操作，則用吸水紙吸干；若不能即刻進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作，則將材料切成3 5mm長(zhǎng)的組織塊，用固定液固定，染色時(shí)將材料取出，依次用50%乙醇、蒸餾水洗凈，然后用吸水紙吸干；(3)徒手切片制作:用鋒利刀片，將小麥莖、葉等組織切割成厚度為20 40μπι切片，置于載玻片上；(4)材料染色:用移液槍(管)吸取100 150 μ L的樣品染色負(fù)載緩沖液滴到置于載玻片的切片上，然后將載玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽氣5min，隨后在25°C條件下避光放置5 lOmin，用移液槍吸掉樣品上的染色負(fù)載緩沖液，之后用移液槍吸取蒸餾水漂洗染色后的切片；(5)將100 μ L50%甘油滴在材料表面，然后用蓋玻片封片；(6)顯微鏡觀察拍照:將經(jīng)過(guò)上述步驟處理的切片放置在落射熒光顯微鏡上，用激光激發(fā)裝置激發(fā)，在顯微鏡下觀察，并用CCD圖像采集系統(tǒng)拍照。優(yōu)選的，所述的鋒利刀片為剃須刀片或手術(shù)刀片。優(yōu)選的，所述的激發(fā)裝置激發(fā)波長(zhǎng)為400 485nm,發(fā)射波長(zhǎng)為490 560nm。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):(I)傳統(tǒng)的石蠟切片對(duì)胼胝質(zhì)的定位標(biāo)記耗時(shí)較長(zhǎng)(2 3周)、冷凍切片法所需設(shè)備條件較高。本發(fā)明中植物組織制片采用徒手切片方法，該法簡(jiǎn)便，易于掌握，快速省時(shí)；如果實(shí)驗(yàn)室取材或室外取材能在30分鐘內(nèi)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作，材料無(wú)需固定即可染色。避免了其他方法中樣品長(zhǎng)時(shí)間處理、染色期間胼胝質(zhì)含量及部位的失真。更重要的是，快速檢測(cè)結(jié)果能夠?qū)ιL(zhǎng)中的小麥生長(zhǎng)狀況作出快速判斷并制定補(bǔ)救措施。(2)采用偏堿性緩沖液配置染色負(fù)載液，消除了水溶性苯胺藍(lán)自身顏色對(duì)切片觀察的干擾，保證定位準(zhǔn)確，相對(duì)含量差異明顯。(3)經(jīng)上述處理并染色后的材料，如不及時(shí)觀察可轉(zhuǎn)入酒精置冰箱或用甘油封片，置冰箱可保存數(shù)周，對(duì)染色后的胼胝質(zhì)無(wú)顯著影響。(4)該方法可操作性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中所用的染料以及其他試劑對(duì)胼胝質(zhì)熒光觀察無(wú)干擾。


圖1為實(shí)施例1中灌漿期小麥葉片組織熒光激發(fā)后在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。
圖2為實(shí)施例2中灌漿期小麥莖組織熒光激發(fā)后在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。圖3為實(shí)施例3中固定液固定后適量施氮條件下的開(kāi)花期小麥莖組織熒光激發(fā)后在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。圖4為實(shí)施例3中固定液固定后低施氮量條件下的開(kāi)花期小麥莖組織熒光激發(fā)后在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為闡明對(duì)本發(fā)明特征的理解，下面結(jié)合一些非限定性的實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。實(shí)施例1一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法，在小麥品種濟(jì)麥22葉片組織中的應(yīng)用，具體操作如下:配制溶液:染色負(fù)載緩沖液的配制:配制lOOmmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8.8);然后將0.0lg水溶性苯胺藍(lán)溶解于IOOml上述緩沖液中即為染色負(fù)載緩沖液。材料處理:取灌漿中期小麥葉片組織，隨即帶回實(shí)驗(yàn)室，用吸水紙吸干。徒手切片制作:用鋒利刀片(手術(shù)刀片)，將小麥葉片組織切割成厚度為20 40 μ m切片，置于載玻片上；材料染色:用移液槍或移液管吸取100 150 μ L的樣品染色負(fù)載緩沖液滴到置于載玻片的切片上，然后將載玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽氣5 8min,以抽去材料表面的氣泡，促使負(fù)載緩沖液快速進(jìn)入材料內(nèi)部，同時(shí)去除氣泡也可以提高觀察效果；隨后在25°C條件下避光放置5 IOmin，用移液槍吸掉樣品上的染色負(fù)載緩沖液，之后用移液槍吸取蒸餾水漂洗染色后的切片；將100 μ L50%甘油滴在切片表面，然后用蓋玻片封片；顯微鏡觀察拍照:將經(jīng)過(guò)上述步驟處理的切片放置在落射熒光顯微鏡上，用激光激發(fā)裝置激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)為400 485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490 560nm，在顯微鏡下觀察，并用CXD圖像采集系統(tǒng)拍照。結(jié)果如附圖1所示，維管束導(dǎo)管壁、表皮組織、厚壁組織細(xì)胞壁上含有較高含量的胼胝質(zhì)(圖中箭頭所指為胼胝質(zhì)產(chǎn)生部位與相對(duì)含量，高亮度部位說(shuō)明胼胝質(zhì)含量高，低亮度部位說(shuō)明胼胝質(zhì)含量相對(duì)較低)(標(biāo)尺=200 μ m)。實(shí)施例2一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法，在小麥品種濟(jì)麥22莖組織中的應(yīng)用，具體操作如下:配制溶液:染色負(fù)載緩沖液的配制:配制150mmol/L的K2HP04緩沖液(pH=9.5);然后將
0.0lg水溶性苯胺藍(lán)溶解于IOOml上述緩沖液中即為染色負(fù)載緩沖液；材料處理:取灌漿中期小麥莖組織，隨即帶回實(shí)驗(yàn)室，用吸水紙吸干。徒手切片制作:用鋒利刀片(手術(shù)刀片)，將小麥葉片組織切割成厚度為20 40 μ m切片，置于載玻片上；
材料染色:用移液槍或移液管吸取100 150 μ L的樣品染色負(fù)載緩沖液滴到置于載玻片的切片上，然后將載玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽氣5 8min,以抽去材料表面的氣泡，促使負(fù)載緩沖液快速進(jìn)入材料內(nèi)部，同時(shí)去除氣泡也可以提高觀察效果；隨后在25°C條件下避光放置5 IOmin，用移液槍吸掉樣品上的染色負(fù)載緩沖液，之后用移液槍吸取蒸餾水漂洗染色后的切片；將100 μ L50%甘油滴在切片表面，然后用蓋玻片封片；顯微鏡觀察拍照:將經(jīng)過(guò)上述步驟處理的切片放置在落射熒光顯微鏡上，用激光激發(fā)裝置激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)為400 485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490 560nm，在顯微鏡下觀察，并用CXD圖像采集系統(tǒng)拍照。結(jié)果如附圖2所示，胼胝質(zhì)主要在維管束木質(zhì)部與韌皮部細(xì)胞壁中合成，在厚壁細(xì)胞中有微量胼胝質(zhì)合成(圖中箭頭所指為胼胝質(zhì)產(chǎn)生部位)(標(biāo)尺=200 μ m)。實(shí)施例3一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法，在固定液固定24小時(shí)、保護(hù)性耕作條件下(上季作物玉米收獲后其秸桿直接粉碎還田，小麥用免耕機(jī)播種)、不同施氮量下開(kāi)花期濟(jì)麥22莖組織中的應(yīng)用，具體操作如下:配制溶液:固定液的配制:將乙醇與三氯甲烷按3:1 (v/v)混合后作為混合溶劑，以上述混合溶劑為溶劑配制體積分?jǐn)?shù)為0.15%的三氯乙酸溶液；染色負(fù)載緩沖液的配制:配制67mmol/L的K2HPO4緩沖液(pH=9.0);然后將0.0lg水溶性苯胺藍(lán)溶解于IOOml上述緩沖液中即為染色負(fù)載緩沖液；材料處理:取灌漿中期小麥莖組織，隨即帶回實(shí)驗(yàn)室，用吸水紙吸干。徒手切片制作:用鋒利刀片(手術(shù)刀片)，將小麥葉片組織切割成厚度為20 40 μ m切片，置于載玻片上；材料染色:用移液槍或者移液管吸取100 150 μ L的樣品染色負(fù)載緩沖液滴到置于載玻片的切片上，然后將載玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽氣5 8min，以抽去材料表面的氣泡，促使負(fù)載緩沖液快速進(jìn)入材料內(nèi)部，同時(shí)去除氣泡也可以提高觀察效果；隨后在25°C條件下避光放置5 lOmin，用移液槍吸掉樣品上的染色負(fù)載緩沖液，之后用移液槍吸取蒸餾水漂洗染色后的切片；將100 μ L50%甘油滴在切片表面，然后用蓋玻片封片；顯微鏡觀察拍照:將經(jīng)過(guò)上述步驟處理的切片放置在落射熒光顯微鏡上，用激光激發(fā)裝置激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)為400 485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490 560nm，在顯微鏡下觀察，并用CXD圖像采集系統(tǒng)拍照。結(jié)果如附圖3和附圖4所示，胼胝質(zhì)主要在維管束木質(zhì)部與韌皮部細(xì)胞壁中合成，在厚壁細(xì)胞中有微量胼胝質(zhì)合成(圖中箭頭所指為胼胝質(zhì)產(chǎn)生部位)，同時(shí)，熒光標(biāo)記顯示，如圖3所示，適量氮條件下，胼胝質(zhì)含量較低，如圖4所示，低施氮量下小麥莖維管束中胼胝質(zhì)沉積較多(標(biāo)尺=200 μ m)。上面雖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)的說(shuō)明，但是，所述技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下，在權(quán)利要求保護(hù)的范圍內(nèi)，還可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行改變。
權(quán)利要求
1.一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法，其特征是，包括以下步驟: (1)溶液的配制: 固定液的配制:將乙醇與三氯甲烷按體積比為3:1混合后作為混合溶劑，以上述混合溶劑為溶劑配制體積分?jǐn)?shù)為0.15%的三氯乙酸溶液； 染色負(fù)載緩沖液的配制:配制pH=8.5 9.5的50 150mmol/L的K2HPO4緩沖液或Tris-HCl緩沖液；然后將0.0lg水溶性苯胺藍(lán)溶解于IOOml上述緩沖液中，即為染色負(fù)載緩沖液； (2)材料處理:取小麥莖組織或葉組織，蒸餾水清洗干凈， 若立刻進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室操作，則用吸水紙吸干； 若不能即刻進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作，則將小麥莖組織或葉組織切成3 5mm長(zhǎng)的組織塊，用固定液固定，染色時(shí)將材料取出，依次用50%乙醇、蒸餾水洗凈，然后用吸水紙吸干； (3)徒手切片制作:用鋒利刀片，將經(jīng)過(guò)步驟(2)處理的小麥莖組織或葉組織切割成厚度為20 40 μ m切片，置于載玻片上； (4)材料染色:用移液槍或者移液管吸取100 150μ L的樣品染色負(fù)載緩沖液滴到置于載玻片的切片上，然后將載玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽氣5 8min，隨后在25°C條件下避光放置5 lOmin，用移液槍吸掉樣品上的染色負(fù)載緩沖液，之后用移液槍吸取蒸餾水漂洗染色后的切片； (5)將100μ L50%甘油滴在切片表面，然后用蓋玻片封片； (6)顯微鏡觀察拍照:將經(jīng)過(guò)步驟(5)處理的切片放置在落射熒光顯微鏡上，用激光激發(fā)裝置激發(fā)，在顯微鏡下觀察，并用CXD圖像采集系統(tǒng)拍照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法，其特征是，所述的鋒利刀片為剃須刀片或手術(shù)刀片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥組織胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)方法，其特征是，所述的激發(fā)裝置激發(fā)波長(zhǎng)為400 485nm,發(fā)射波長(zhǎng)為490 560nm。
全文摘要
一種小麥組織胼胝質(zhì)的染色與觀察方法，屬于植物組織化學(xué)定位技術(shù)領(lǐng)域。主要包括以下步驟(1)配制溶液(2)材料處理；(3)切片制作；(4)材料染色；(5)制片(5)激光激發(fā)裝置激發(fā)，熒光顯微鏡觀察與拍照。本發(fā)明采用徒手切片方法，用胼胝質(zhì)專一性熒光染料—水溶性苯胺藍(lán)在堿性條件下對(duì)徒手制作的小麥組織切片進(jìn)行染色，顯著縮短樣品切片制作、染色與觀察周期，保證胼胝質(zhì)定位準(zhǔn)確。本發(fā)明可操作性強(qiáng)，所制作切片便于觀察，采集圖像清晰。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103149189SQ201310075848
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者孔令安 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所