一種快速檢測大腸桿菌o157：h7的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體采用Fe304/RU(bqy)32+納米微球集成免疫磁珠捕獲技術(shù)和免疫層析快速檢測大腸桿菌0157: H7。
技術(shù)背景
[0002]近年來，隨著人民生活水平的提高，食品安全已經(jīng)成為當今世界性公共衛(wèi)生熱點。食源性致病菌是構(gòu)成食品安全的重大隱患，大腸桿菌0157:H7是目前世界上公認的三大最主要的食源性致病菌之一，它的感染劑量非常低，最少10個活菌就可能感染致病。感染大腸桿菌0157:H7的臨床癥狀包括腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征和血栓形成的血小板減少性紫癜等，從接觸該菌到發(fā)病平均周期為3天，潛伏期短則I天，最長能達到8天以上。大腸桿菌0157:H7主要通過污染肉類，蔬菜和水果以及飲水等途徑感染人類引發(fā)相應的食源性疾病，嚴重危害人體健康。
[0003]目前檢測大腸桿菌0157:H7的金標準是傳統(tǒng)分離鑒定法，該方法需經(jīng)過預增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生理生化鑒定及血清型鑒定等步驟，整個過程繁瑣耗時(3-7天)；PCR方法、電化學方法以及生物傳感器法對大腸桿菌0157:H7檢測靈敏度高，然而它們需要較長的檢測時間、昂貴的儀器以及專業(yè)的技術(shù)人員。因此，建立快速、簡單、靈敏的檢測方法對食源性致病菌的檢測具有重要意義。
[0004]膠體金免疫層析試紙條以其操作簡單、快速(10-15min)、準確等特點成為基層篩選的重要工具，然而由于膠體金的光學信號有限，膠體金免疫層析試紙條的靈敏度不高，對大腸桿菌0157:H7的檢測限通常不高于105CFU/mL，這個缺陷限制了其在食品和農(nóng)產(chǎn)品檢測中的應用。因此，提高試紙條的靈敏度將為大腸桿菌0157:H7的檢測提供簡單、高效的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的大腸桿菌0157:H7定性、定量檢測技術(shù)。
[0006]本發(fā)明具體方案如下:
[0007]一種快速檢測大腸桿菌0157:H7的方法，包括以下步驟:
[0008]I)納米微球的制備:
[0009]a.添加0.4-0.8mmolFeCl3.6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2.4Η20到10mL的去離子水中，向溶液中通入氮氣并加熱到80-120°C，然后將3-7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反應2h ；用永磁鐵從反應溶液中分離出黑色的固體物質(zhì)用高純水清洗3?5次，得Fe3O4納米粒子；
[0010]b.取12mg Fe3O4納米粒子用1-1OmL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應12h，在Fe3O4納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子；[0011 ] c.把10_300uL的正娃酸乙酯，20mL無水乙醇，1-1OmL去離子水和ImL 0.5_3mg/L的啡啰啉聯(lián)釕(Ru(bqy )32+)混合，將混合溶液加入0.5mL 二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子，最后加入600-900yL的NH40H，劇烈攪拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，用去離子水清洗備用；
[0012]d.將ImL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用該混合物復溶Fe3O4/Ru(bqy)32+納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80°C300rpm攪拌lh，離心得到娃燒化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球;
[0013]e.將硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸鈉，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g過硫酸鉀溶液的50mL的水溶液，水浴70°C，200r/min下攪拌，反應5h后得羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；
[0014]2)取0.5_2mg羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球加入ImL偶聯(lián)緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，及100-500yg抗大腸桿菌0157:H7單抗，在溫度37°C時，放在10_15rpm的旋轉(zhuǎn)儀上偶聯(lián)60-120min，磁分離3-5min，棄上清；用清洗緩沖液沖洗3-5遍之后，取ImL封閉劑與納米微球混合封閉0.5-lh，得到Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗；
[0015]所述偶聯(lián)緩沖液配制方法如下:將3mL 19.07g/mL的硼砂與7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀釋10倍體積；
[0016]所述清洗緩沖液配制方法如下:稱取0.43g 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的無菌蒸餾水中，調(diào)pH為5.5-6.0；
[0017]所述封閉劑配制方法如下:取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入ImL磷酸鹽(PBS)緩沖液配成封閉劑；
[0018]3)培養(yǎng)大腸桿菌 0157:H7，將菌液調(diào)整濃度為 106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取ImL備用；取待測樣品溶液lmL、各濃度菌液lmL，分別與100-150yg Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗，于溫度37°C，旋轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分離3_5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中得Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌；
[0019]4)免疫層析試紙條的制備:將樣本墊用pH 8.5 0.IM Tris-HCl緩沖液(I %BSA，
0.5%Tween-20)浸泡處理，置于60°C鼓風干燥箱，2h后取出備用；將大腸桿菌0157:H7兔多抗和驢抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，濃度均為l-2mg/mL，噴量均為0.75uL/cm，37°C真空干燥過夜取出置于干燥缸中備用；將過濾墊、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的試紙條，裝卡;將制備好的試紙條裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存?zhèn)溆茫?br>[0020]5)試紙條對樣品的檢測:將收集到的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌稀釋到50-150yg/mL，取10yL滴加到試紙條加樣孔中，10-15min后，用熒光讀取儀記錄T線、C線熒光強度和T/C的值；
[0021]6)定性分析:用肉眼觀察結(jié)果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有大腸桿菌0157:H7，T線不顯色則說明樣品中沒有大腸桿菌0157:H7或是含有大腸桿菌0157:H7的量低于 103CFU/mL;
[0022]7)定量分析:使用熒光讀取儀測量T線、C線的熒光強度，以及T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線，確定普通樣品中的大腸桿菌Ol 57: H7數(shù)量。
[0023]所述步驟l)Fe304/Ru(bqy)32+納米微球粒徑為80_210nm;
[0024]步驟3)所述免疫層析試紙條是在粘性底板上依次粘貼濾紙、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙組成。使用大腸桿菌0157:H7Fe304/RU(bqy)32+納米微球免疫層析試紙條，同時使用熒光讀取儀定量檢測的方法，其特征在于:配制已知系列濃度的大腸桿菌0157:H7溶液，用熒光讀取儀測出其對應的熒光強度，根據(jù)這一系列數(shù)值與對應濃度建立標準曲線，然后將檢測樣品的試紙條放入熒光讀取儀中，根據(jù)熒光讀取儀輸出的數(shù)值，查標準曲線圖即可得出樣本中大腸桿菌0157:H7的含量。
[0025]本發(fā)明有以下優(yōu)點:
[0026]I)本發(fā)明具有操作簡單、檢測時間短(10-15min)等優(yōu)點，適于進行現(xiàn)場檢測；
[0027]2)本發(fā)明技術(shù)方案檢測穩(wěn)定性好，檢測靈敏度高，檢測限能達到103CFU/mL。采用的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，不僅具有磁性納米粒子的超順磁性能，對樣品進行濃縮富集，而且具有Ru(bqy)32+納米微球強的光學信號、Ru(bqy)32+納米微球表面高效偶聯(lián)抗體的性能，從而提高了試紙條的檢測靈敏度。
[0028]3)本發(fā)明無需將大腸桿菌0157: H7從免疫磁珠上洗脫下來的步驟，提高了捕獲效率;免去了將免疫標記物噴在結(jié)合墊上的步驟，免疫學反應更加均一，定量檢測時變異系數(shù)小;減少了工作量和雜菌污染概率。
[0029]4)能同時對目標物大腸桿菌0157: H7進行定性及定量檢測。
[°03°] 5)本發(fā)明的標記物為羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，該標記物主要通過化學偶聯(lián)的方式標記抗體，相比傳統(tǒng)膠體金(物理吸附作用)，能夠捕獲更多抗體，從而提高檢測靈敏度，另外，該標記物羧基修飾的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)能提高材料的穩(wěn)定性，提高保存期為I年，傳統(tǒng)膠體金保存期為6個月。