專利名稱：動(dòng)物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚a的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物中人工合成激素的提取方法，具體涉及從動(dòng)物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A的方法。
背景技術(shù)：
目前，家禽、魚、蝦或蟹的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，雖然動(dòng)物飼養(yǎng)中規(guī)定不得使用促生長(zhǎng)激素，但由于己烯雌酚等人工合成激素的促生長(zhǎng)效果顯著，以及雙酚A的廣泛用途成為人們隨處可接觸到的環(huán)境污染物，動(dòng)物源性食物中可能有這些類雌激素的殘留，人食用后影響身體健康。因此檢測(cè)動(dòng)物組織中己烯雌酚等類雌激素殘留量，保障動(dòng)物源性食品安全就顯得尤為重要。檢測(cè)動(dòng)物組織中己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A等殘留量的方法多種多樣，有酶標(biāo)法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法或拉曼光譜法等。氣相色譜-質(zhì)譜法一般采用乙腈、乙酸乙酯或乙醚等有機(jī)溶劑提取，然后用固相萃取柱凈化，濃縮并衍生化，定容后上機(jī)分析。儀器測(cè)定時(shí)選用HP-5MS柱為色譜分離柱，外標(biāo)法定量。如SN/T 1744-2006《進(jìn)口動(dòng)物飼料中己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚殘留量的檢驗(yàn)方法氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，該方法的樣品提取溶劑用乙醚，MAX固相萃取柱凈化，硅烷化試劑衍生，色譜柱是HP-5MS柱，定量方法為外標(biāo)法；該方法介紹的己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚的檢出限依次為3μ g/kg、5y g/kg、5y g/kg。吳銀良等報(bào)導(dǎo)了“氣相色譜法測(cè)定動(dòng)物組織中三種1，2- 二苯乙烯類藥物的殘留量”(色譜，2006.24 (5)，462-465)，則以乙酸乙酯作為樣品中己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚的提取溶劑，提取液雖經(jīng)10%碳酸鈉除去樣品中帶入的酸性物質(zhì)，再用硅膠固相柱進(jìn)一步凈化，但凈化仍不是十分的徹底。目前氣相色譜-質(zhì)譜法每一樣品需耗一根固相萃取柱，所需成本較高，提取時(shí)凈化效果也不是十分地理想。只能用外標(biāo)法測(cè)定己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚等，檢出限較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供動(dòng)物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A的方法，該方法選用合適的提取試劑和凈化試劑，不需采用固相萃取柱就能達(dá)到凈化的目的，且己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A凈化較徹底。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:動(dòng)物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A的方法，其步驟如下:
a、稱取5.0Og已勻漿的動(dòng)物肌肉試樣置于具塞的第一離心瓶中，加入10 20ml乙腈勻質(zhì)，2000rpm離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到具塞的第二離心瓶中，第一離心瓶中再加入10 20ml乙腈,搖勻后，2000rpm離心5min,上清液合并于第二離心瓶中；
b、第二離心瓶中，加入16ml正己燒和4ml二氯甲燒,搖勻后,2000rpm離心3min,棄去上層正己烷相；這樣大部分非極性物質(zhì)一起被除去；
C、第二離心瓶中再加入IOml 二氯甲燒和5ml正己燒,搖勻后，2000rpm離心3min,將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到梨形瓶中，40°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到含己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A提取物。第二離心瓶中液體分三層，上層為正己烷相，中間層為乙腈-二氯甲烷相，下層為水相，己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A等人工合成激素大多溶于乙腈-二氯甲烷相中，極少部份溶于正己烷相，乙腈-二氯甲烷相和正己烷相都為有機(jī)相，極性成分溶于水相中，就分離了極性物質(zhì)，凈化了人工合成激素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:動(dòng)物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A的方法，通過乙腈提取，體積比4:1的正己烷與二氯甲烷溶劑分離非極性物質(zhì)，體積比1:2的正己烷與二氯甲烷溶劑進(jìn)一步將人工合成激素溶于有機(jī)相中，分離水相中極性物質(zhì)，不需要固相萃取柱凈化，降低了提取成本，己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A提取物的純度高，無機(jī)、有機(jī)雜質(zhì)少，可以用內(nèi)標(biāo)的氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)，檢出限低，每種人工合成激素檢測(cè)限為0.05μ g/kg以下，定量檢測(cè)誤差少。因此該方法選用合適的提取試劑和凈化試劑，不需采用固相萃取柱就能達(dá)到凈化的目的，且己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A凈化較徹底。具體實(shí)施方法
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1
取未含人工合成激素的奸肉5.0Og 二份方試樣，切碎，均質(zhì)后，一份試樣分別加入
0.0005 μ g的己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和雙酚A，另一份試樣分別加入0.0002 μ g的己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和雙酚A，然后將試樣于具塞的第一離心瓶中，加入10 20ml乙腈勻質(zhì)，2000rpm離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到具塞的第二離心瓶中，第一離心瓶中再加入10 20ml乙腈,搖勻后,2000rpm離心5min,上清液合并于第二離心瓶中，棄去固體試樣；第二離心瓶中，先加 入16ml正己燒和4ml 二氯甲燒,搖勻后,2000rpm離心3min,棄去上層正己烷相，這樣大部分非極性物質(zhì)一起被除去；第二離心瓶中，再加入IOml 二氯甲烷和5ml正己烷，搖勻后，2000rpm離心3min，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到梨形瓶中，這樣大部分非極性物質(zhì)一起被除去，梨形瓶40°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，梨形瓶?jī)?nèi)就得到含己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和雙酚A提取物。檢測(cè)時(shí):在梨形瓶中加入4ml(分2次)二氯甲烷，注意淋洗瓶壁讓提取物溶解，并轉(zhuǎn)移到IOml玻璃離心管(A)中，A管中加入4ml 4%NaOH,4ml正己烷，緩慢上下顛倒搖動(dòng)試管，使二氯甲烷全部轉(zhuǎn)移到上層，2000rpm離心3min，棄去上層有機(jī)相，然后用6mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH至6.2,加4ml乙醚搖勻，2000rpm離心3min,將上層乙醚用無水硫酸鈉脫水后轉(zhuǎn)移到另一離心管(B)中，A管內(nèi)再用4ml乙醚重復(fù)提取I次，上層乙醚用無水硫酸鈉脫水后轉(zhuǎn)移到B管；B管中加入100 μ I (100ng/ml)BPA-D16內(nèi)標(biāo)溶液，65°C下氮?dú)獯蹈?；再加?00 μ I硅烷化衍生劑(BSTFA:TMCS=99:1)，65°C下衍生30min ;氮?dú)獯等パ苌鷦?，?00 μ I正庚烷，搖勻。選擇DB-17MS柱以一定的儀器條件進(jìn)行GC-MS測(cè)定。測(cè)得回收率:己烯雌酚81.29Γ99.9%、雙烯雌酚82.4% 116%、己烷雌酚93.5% 118%、雙酚Α76.8% 111% ;精密度(RSD):3.48% 11.9%，說明檢測(cè)限可以為0.05 μ g/kg左右。實(shí)施例2
取切碎、勻漿后鯉魚肌肉5g，不加烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和雙酚A，提取方法和測(cè)試方法同實(shí)施例1，最后測(cè)得鯉魚肌肉中含己烯雌酚0.008 μ g，雙烯雌酚0.011 μ g，肉中己烯雌酚含量約為2 μ g/kg,雙烯雌酚約為2.7 μ g/kg。
實(shí)施例3
取切碎、勻漿后豬肉的肌肉5g，不加烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和雙酚A，提取方法和測(cè)試方法同實(shí)施例1，最后測(cè)得肌肉中含己烷雌酚0.02yg，雙酚A 0.032yg，肉中己烯雌酚含量約為5 μ g/kg,雙酚A約為8 μ g/kg。實(shí)施例4
取切碎、勻漿后雞脯肉5g，不加烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和雙酚A，提取方法和測(cè)試方法同實(shí)施例1，最后測(cè)得肉中含己烯雌酚0.026 μ g，己烷雌酚0.01 μ g，雙酚A 0.015 μ g。
權(quán)利要求
1.動(dòng)物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A的方法，其特征在于步驟如下: a、稱取5.0Og已勻漿的動(dòng)物肌肉試樣置于具塞的第一離心瓶中，加入10 20ml乙腈勻質(zhì)，2000rpm離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到具塞的第二離心瓶中，第一離心瓶中再加入10 20ml乙腈,搖勻后，2000rpm離心5min,上清液合并于第二離心瓶中； b、第二離心瓶中，加入16ml正己燒和4ml二氯甲燒,搖勻后,2000rpm離心3min,棄去上層正己烷相； C、第二離心瓶中再加入IOml 二氯甲燒和5ml正己燒,搖勻后,2000rpm離心3min,將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到梨形瓶中，40°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到含己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了動(dòng)物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A的方法，通過乙腈提取，體積比41的正己烷與二氯甲烷溶劑分離非極性物質(zhì)，體積比12的正己烷與二氯甲烷溶劑進(jìn)一步將人工合成激素溶于有機(jī)相中，分離水相中極性物質(zhì)，不需要固相萃取柱凈化，降低了提取成本，己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和/或雙酚A提取物的純度高，無機(jī)、有機(jī)雜質(zhì)少，可以用內(nèi)標(biāo)的氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)，檢出限低，每種人工合成激素檢測(cè)限為0.05μg/kg左右，定量檢測(cè)誤差少。
文檔編號(hào)G01N30/06GK103197015SQ20131010652
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者鐘惠英, 柴麗月, 朱勵(lì)華, 柳海 申請(qǐng)人:寧波市海洋與漁業(yè)研究院