專利名稱：酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酵母濃度的檢測(cè)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
釀酒(如葡萄酒、啤酒等)要經(jīng)過(guò)發(fā)酵過(guò)程。影響發(fā)酵過(guò)程的因素很多，如發(fā)酵液的成分和濃度、溶解氧含量、溫度、PH值、攪拌速度、酵母的種類、活性和濃度等等。在上述因素中，酵母濃度是最重要的工藝參數(shù)，因?yàn)樵谝欢l件下，發(fā)酵的得率與酵母濃度密切相關(guān)。酵母的存在會(huì)改變發(fā)酵液的電特性，發(fā)酵液在無(wú)線電頻率范圍內(nèi)的電特性可用電容率和電導(dǎo)率充分地描述?！?shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)酵液在無(wú)線電頻率范圍內(nèi)的電容率增量是測(cè)量頻率和生物量濃度的函數(shù)。酵母濃度反映了酵母的生長(zhǎng)速率和增值狀況，是酵母培養(yǎng)和發(fā)酵過(guò)程中的監(jiān)控指標(biāo)。目前，測(cè)定酵母濃度一般采用血球板計(jì)數(shù)法，但該方法操作誤差大，重復(fù)性較差，耗時(shí)。流式細(xì)胞術(shù)是一種以單個(gè)細(xì)胞為對(duì)象的檢測(cè)技術(shù)，具有快速、客觀準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可同時(shí)測(cè)定多個(gè)指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)臨床研究中的應(yīng)用十分廣泛，但在酵母發(fā)酵監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用仍較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于快速測(cè)定酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，該方法測(cè)定量大，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，包括以下步驟:I)測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度；2)制備酵母懸液；3)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度。本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法，步驟I)的測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度，是這樣操作的:在流式上樣管中加入一定的蒸餾水，稱量管和水總重量，記為初重；然后以慢速進(jìn)行上樣，上樣一定時(shí)間后立即停止上樣，取下上樣管稱量管和水總重量，記為末重，根據(jù)上樣速度計(jì)算公式計(jì)算流式細(xì)胞儀在慢速狀態(tài)下的上樣速度，重復(fù)測(cè)定5次以上，計(jì)算平均值。本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法,所述上樣速度計(jì)算公式:上樣速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) -T-上樣時(shí)間(min)。本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法，步驟2)的制備酵母懸液，是取酵母液，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用酵母培養(yǎng)液或蒸餾水調(diào)整酵母濃度后得到酵母懸液。本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法，所述酵母懸液中的酵母濃度的數(shù)量級(jí)優(yōu)選IO6個(gè)/ml。
本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法，步驟3)的利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度，是這樣操作的:在分析軟件中建立FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖，取一管酵母懸液進(jìn)行上樣，調(diào)整并確定流式細(xì)胞儀的前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)基本參數(shù)，F(xiàn)SC采用Line線性形式，SSC采用Log對(duì)數(shù)形式，在FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖上圈定酵母范圍；每個(gè)樣品上樣Imin，根據(jù)圈定的酵母范圍，分析酵母?jìng)€(gè)數(shù)占總顆粒數(shù)的比例，計(jì)算Imin讀取到的酵母?jìng)€(gè)數(shù)，根據(jù)酵母濃度計(jì)算公式計(jì)算酵母濃度，每個(gè)樣品測(cè)定3次以上，計(jì)算平均值。本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)方法，所述的酵母濃度計(jì)算公式:酵母濃度(個(gè)/ml)=lmin讀取酵母?jìng)€(gè)數(shù)(個(gè)/min) +上樣速度(ml/min) X稀釋倍數(shù)。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是:本發(fā)明的方法測(cè)定量大，準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便快速，為酵母濃度的測(cè)定提供了方法依據(jù)。


圖1是實(shí)施例1的啤酒酵母FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖。 圖2是實(shí)施例2的啤酒酵母FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖。圖3是實(shí)施例3的啤酒酵母FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。 實(shí)施例1使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法測(cè)定啤酒發(fā)酵過(guò)程中的啤酒酵母濃度，包括以下步驟:I)測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度:所用流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)的，型號(hào)為FACSCalibur ;在流式上樣管中隨機(jī)加入1/2-3/4管的蒸餾水，稱量管和水總重量，記為初重；然后以慢速進(jìn)行上樣，上樣IOmin后立即停止上樣，取下上樣管，稱量管和水總重量，記為末重；根據(jù)上樣速度計(jì)算公式:上樣速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上樣時(shí)間(lOmin)，計(jì)算流式細(xì)胞儀在慢速狀態(tài)下的上樣速度，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算平均值得到上樣速度為0.014ml/min。2)制備酵母懸液:取滿罐期的啤酒發(fā)酵液，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用生理鹽水稀釋10倍后得到酵母懸液，酵母濃度數(shù)量級(jí)為IO6個(gè)/ml (酵母懸液濃度？或其他數(shù)值)；3)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度:在CellQuest Pro分析軟件中建立FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖，如圖1所示，取I管酵母懸液進(jìn)行上樣，調(diào)整并確定流式細(xì)胞儀的基本參數(shù)，前向角散射光(FSC)電壓E00，放大器2.5，數(shù)據(jù)采用Line線性形式，側(cè)向角散射光(SSC)電壓280，數(shù)據(jù)采用Log對(duì)數(shù)形式，在FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖上圈定酵母范圍；每個(gè)樣品上樣lmin，根據(jù)圈定的酵母范圍，分析酵母?jìng)€(gè)數(shù)占總顆粒數(shù)的比例，計(jì)算Imin讀取到的酵母?jìng)€(gè)數(shù)，根據(jù)酵母濃度計(jì)算公式計(jì)算酵母濃度，測(cè)定3次，計(jì)算平均值得到酵母濃度為14.41 X IO6 個(gè)/ml。實(shí)施例2
使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法測(cè)定啤酒發(fā)酵過(guò)程中的啤酒酵母濃度，包括以下步驟:I)測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度:所用流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)的，型號(hào)為FACSCalibur ;在流式上樣管中隨機(jī)加入1/2-3/4管的蒸餾水，稱量管和水總重量，記為初重；然后以慢速進(jìn)行上樣，上樣IOmin后立即停止上樣，取下上樣管，稱量管和水總重量，記為末重；根據(jù)上樣速度計(jì)算公式:上樣速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上樣時(shí)間(lOmin)，計(jì)算流式細(xì)胞儀在慢速狀態(tài)下的上樣速度，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算平均值得到上樣速度為0.014ml/min。2)制備酵母懸液:取發(fā)酵第一天的啤酒發(fā)酵液，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用生理鹽水稀釋10倍后得到酵母懸液，酵母濃度數(shù)量級(jí)為IO6個(gè)/ml (酵母懸液濃度？或其他數(shù)值)；3)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度:在CellQuest Pro分析軟件中建立FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖，如圖2所示，取I管酵母懸液進(jìn)行上樣，調(diào)整并確定流式細(xì)胞儀的基本參數(shù)，前向角散射光(FSC)電壓E00，放大器2.5，數(shù)據(jù)采用Line線性形式，側(cè)向角散射光(SSC)電壓280，數(shù)據(jù)采用Log對(duì)數(shù)形式，在FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖上圈定酵母范圍；每個(gè)樣品上樣lmin，根據(jù)圈定的酵母范圍，分析酵母?jìng)€(gè)數(shù)占總顆粒數(shù)的比例，計(jì)算Imin讀取到的酵母?jìng)€(gè)數(shù)，根據(jù)酵母濃度計(jì)算公式計(jì)算酵母濃度，測(cè)定3次，計(jì)算平均值得到酵母濃度為43.72X IO6 個(gè)/ml。實(shí)施例3使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法測(cè)定啤酒發(fā)酵過(guò)程中的啤酒酵母濃度，包括以下步驟:I)測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度:所用流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)的，型號(hào)為FACSCalibur ;在流式上樣管中隨機(jī)加入1/2-3/4管的蒸餾水，稱量管和水總重量，記為初重；然后以慢速進(jìn)行上樣，上樣IOmin后立即停止上樣，取下上樣管，稱量管和水總重量，記為末重；根據(jù)上樣速度計(jì)算公式:上樣速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上樣時(shí)間(IOmin),計(jì)算流式細(xì)胞儀在慢速狀態(tài)下的上樣速度，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算平均值得到上樣速度為0.014ml/min。2)制備酵母懸液:取發(fā)酵第二天的啤酒發(fā)酵液，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用生理鹽水稀釋10倍后得到酵母懸液，酵母濃度數(shù)量級(jí)為IO6個(gè)/ml ；3)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度:在CellQuest Pro分析軟件中建立FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖，如圖3所示，取I管酵母懸液進(jìn)行上樣，調(diào)整并確定流式細(xì)胞儀的基本參數(shù)，前向角散射光(FSC)電壓E00，放大器2.5，數(shù)據(jù)采用Line線性形式，側(cè)向角散射光(SSC)電壓280，數(shù)據(jù)采用Log對(duì)數(shù)形式，在FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖上圈定酵母范圍；每個(gè)樣品上樣lmin，根據(jù)圈定的酵母范圍，分析酵母?jìng)€(gè)數(shù)占總顆粒數(shù)的比例，計(jì)算Imin讀取到的酵母?jìng)€(gè)數(shù)，根據(jù)酵母濃度計(jì)算公式計(jì)算酵母濃度，測(cè)定3次，計(jì)算平均值得到酵母濃度為48.06X IO6 個(gè)/ml。將上述實(shí)施例1-3的酵母濃度按照計(jì)算公式:酵母濃度(個(gè)/ml) =Imin讀取酵母?jìng)€(gè)數(shù)(個(gè)/min) +上樣速度(ml/min) X稀釋倍數(shù)(10)，每個(gè)樣品測(cè)定3次，計(jì)算平均值。計(jì)算結(jié)果如下表I和2所示:表I實(shí)施例1-3中的流式細(xì)胞儀的上樣速度檢測(cè)數(shù)據(jù)

權(quán)利要求
1.一種酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，其特征在于其包括以下步驟: 1)測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度； 2)制備 酵母懸液； 3)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，其特征在于:步驟I)的測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度，是這樣操作的: 在流式上樣管中加入一定的蒸餾水，稱量管和水總重量，記為初重；然后以慢速進(jìn)行上樣，上樣一定時(shí)間后立即停止上樣，取下上樣管，稱量管和水總重量，記為末重；根據(jù)上樣速度計(jì)算公式計(jì)算流式細(xì)胞儀在慢速狀態(tài)下的上樣速度，重復(fù)測(cè)定5次以上，計(jì)算平均值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，其特征在于:所述上樣速度其計(jì)算公式為: 上樣速度(ml/min)=(初重-末重)+水密度(lg/ml) +上樣時(shí)間(min)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，其特征在于:步驟2)中，制備酵母懸液的方式是:取酵母液，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用酵母培養(yǎng)液或蒸餾水調(diào)整酵母濃度后得到酵母懸液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，其特征在于:所述酵母懸液，其中酵母濃度的數(shù)量級(jí)優(yōu)選IO6個(gè)/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，其特征在于:步驟3)所述的利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度，是這樣操作的: 在分析軟件中建立FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖，取I管酵母懸液進(jìn)行上樣，調(diào)整并確定流式細(xì)胞儀的前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)基本參數(shù)，F(xiàn)SC采用Line線性形式，SSC采用Log對(duì)數(shù)形式，在FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖上圈定酵母范圍；每個(gè)樣品上樣lmin，根據(jù)圈定的酵母范圍，分析酵母?jìng)€(gè)數(shù)占總顆粒數(shù)的比例，計(jì)算Imin讀取到的酵母?jìng)€(gè)數(shù)，根據(jù)酵母濃度計(jì)算公式計(jì)算酵母濃度，每個(gè)樣品測(cè)定3次以上，計(jì)算平均值。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，其特征在于:所述的酵母濃度計(jì)算公式:酵母濃度(個(gè)/ml) =Imin讀取酵母?jìng)€(gè)數(shù)(個(gè)/min) +上樣速度(ml/min) X稀釋倍數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母濃度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，包括步驟1)測(cè)定流式細(xì)胞儀的上樣速度；2)制備酵母懸液；3)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母濃度。在FSC-H/SSC-H散點(diǎn)圖上圈定酵母范圍；每個(gè)樣品上樣1min，根據(jù)圈定的酵母范圍，分析酵母?jìng)€(gè)數(shù)占總顆粒數(shù)的比例，計(jì)算1min讀取到的酵母?jìng)€(gè)數(shù)，根據(jù)酵母濃度計(jì)算公式計(jì)算酵母濃度。本發(fā)明的方法測(cè)定量大，準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便快速，為酵母濃度的測(cè)定提供了方法依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N15/14GK103234892SQ20131012437
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者張秀霞, 熊丹, 李惠萍, 蔡紅遠(yuǎn), 張宇鋒 申請(qǐng)人:廣州南沙珠江啤酒有限公司, 廣州珠江啤酒股份有限公司