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      基于近紅外熒光納米微球標(biāo)記物的免疫層析定量檢測(cè)試劑的制作方法

      文檔序號(hào):6231587閱讀:436來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:基于近紅外熒光納米微球標(biāo)記物的免疫層析定量檢測(cè)試劑的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明建立了一種基于近紅外熒光納米微球標(biāo)記物的免疫層析定量檢測(cè)試劑,包括近紅外熒光納米微球試紙條和相應(yīng)試劑的制備方法。本發(fā)明采用近紅外熒光納米微球作為標(biāo)記,采用免疫層析技術(shù),制備近紅外熒光免疫層析試紙條,然后構(gòu)成包括樣品墊/玻璃纖維膜/硝酸纖維素膜和吸水紙的檢測(cè)卡,其中硝酸纖維素膜上固定有檢測(cè)線和質(zhì)控線。在檢測(cè)過(guò)程中,采用近紅外光分別掃描質(zhì)控線和樣品線,激發(fā)熒光分子發(fā)光,發(fā)射出的熒光經(jīng)濾光片,經(jīng)光電倍增管轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào),用質(zhì)控線熒光強(qiáng)度校正檢測(cè)線熒光強(qiáng)度后代入熒光分析儀中的標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可分析檢測(cè)標(biāo)本中的待測(cè)物的濃度。該系統(tǒng)可以在微生物檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、毒品檢測(cè)以及危險(xiǎn)化學(xué)品快速檢測(cè)中應(yīng)用。本發(fā)明具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確操作方便的特點(diǎn)。
      背景技術(shù)
      免疫層析法在疾病快速診斷、小分子檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。其原理是將特異的抗原或抗體(捕獲分子)先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶,用標(biāo)記物標(biāo)記的抗原或抗體(檢測(cè)分子)固定在膜的另外一端。當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后,當(dāng)檢測(cè)樣品中含有目標(biāo)分子時(shí),檢測(cè)分子與目標(biāo)分子結(jié)合形成復(fù)合物。由于毛細(xì)管作用,復(fù)合物將沿著膜向前移動(dòng),當(dāng)移動(dòng)至固定有檢測(cè)分子的區(qū)域時(shí),樣品中相應(yīng)的目標(biāo)分子與檢測(cè)分子形成的復(fù)合物與捕獲分子發(fā)生特異性結(jié)合。若用免疫膠體金標(biāo)記檢測(cè)分子,可使該區(qū)域顯示一定的顏色,從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。常用的標(biāo)記物為膠體金顆粒、酶以及著色微球。膠體金顆粒和著色微球是通過(guò)靜電吸附將抗原或抗體標(biāo)記在顆粒表面,通過(guò)觀察膠體金顆?;蛭⑶蛟跈z測(cè)線上的聚集顯色判斷檢測(cè)結(jié)果。酶標(biāo)記通過(guò)催化底物顯色,顯示檢測(cè)結(jié)果。以上標(biāo)記技術(shù)存在靈敏度低,不能精確定量的缺點(diǎn)。限制了免疫層析應(yīng)用范圍。熒光標(biāo)記技術(shù)具有靈敏度高,操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),被廣泛用于生物檢測(cè)領(lǐng)域。如DNA序列測(cè)定、蛋白表達(dá)分析、臨床診斷等。常用的熒光標(biāo)記物光譜范圍大多在可見光區(qū)(400-750nm)。由于生物體的蛋白、核酸等在紫外光的激發(fā)下會(huì)產(chǎn)生熒光,因此,使用可見光區(qū)的熒光標(biāo)記物會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的背景熒光,干擾檢測(cè)信號(hào),降低了檢測(cè)的靈敏度。近紅外熒光材料的發(fā)射波長(zhǎng)范圍在650_1000nm,在這個(gè)范圍內(nèi),生物體自發(fā)熒光較弱,因此,使用近紅外熒光材料作為檢測(cè)熒光標(biāo)記物,具有背景熒光低、檢測(cè)信噪比高,檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)。中國(guó)專利CN201210152948.X所公開的內(nèi)容是將近紅外熒光分子直接標(biāo)記到檢測(cè)分子上,可以建立基于間接法、雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等檢測(cè)方法的檢測(cè)試劑。本發(fā)明與之不同在于,近紅外熒光分子首先標(biāo)記到納米微球上,再與抗體或抗原(檢測(cè)分子)連接;或抗體或抗原與近紅外熒光分子連接后,再與納米微球連接。由于抗體或抗原(捕獲分子)、納米微球、熒光分子形成了復(fù)合物,改善了標(biāo)記物在層析卡上的層析特性,顯著的提高了檢測(cè)靈敏度,降低了背景噪音。CN200910117820.8公開了一種以雙結(jié)構(gòu)二氧化硅復(fù)合有機(jī)染料的發(fā)光納米粒子作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)。其在檢測(cè)過(guò)程中,采用熒光掃描儀檢測(cè)檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度,再將測(cè)定的檢測(cè)線熒光強(qiáng)度乘以校正系數(shù),把校正后的熒光強(qiáng)度代入預(yù)先設(shè)置在熒光分析儀中的標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可通過(guò)熒光分析儀自動(dòng)計(jì)算獲得樣本中待測(cè)物的濃度。其特點(diǎn)是將異硫氰酸熒光素、異硫氰酸羅丹明等熒光分子摻入到二氧化硅形成的納米微球中,再通過(guò)修飾微球,將抗體連接到熒光納米微球上。該專利使用的熒光物質(zhì)多為紫外激發(fā),生物分子自發(fā)熒光較強(qiáng);與之不同的是,本申請(qǐng)中使用的近紅外熒光分子激發(fā)光和發(fā)射光均為近紅外光,生物分子自發(fā)熒光較弱;該發(fā)明是在合成納米微球的過(guò)程中摻入熒光染料。本申請(qǐng)是通過(guò)化學(xué)鍵將熒光染料連接到納米微球上,特別是使用羥基與氨基的縮合反應(yīng)形成的肽鍵,熒光染料與微球的比例可以進(jìn)行靈活的調(diào)整。中國(guó)專利CN03819391.4以及CN200480005319.8公開是以時(shí)間分辨熒光標(biāo)記物作為檢測(cè)標(biāo)記物的免疫層析方法及儀器。時(shí)間分辨采用脈沖信號(hào)激發(fā)熒光物質(zhì),利用激發(fā)脈寬短,而熒光物質(zhì)發(fā)光脈寬長(zhǎng),可以消除壽命較短的背景干擾。與時(shí)間分辨熒光免疫層析的區(qū)別在于,本發(fā)明不使用時(shí)間分辨熒光物質(zhì),也不需要采用脈沖光源,對(duì)檢測(cè)儀器要求較低。中國(guó)專利 CN200420049579.2、CN200520045657.6、CN200420049580.5 公開的是以上轉(zhuǎn)換磷光納米材料作為標(biāo)記物的免疫層析方法。與上轉(zhuǎn)換磷光免疫層析不同的是,本發(fā)明采用近紅外熒光分子標(biāo)記無(wú)色納米顆粒,熒光激發(fā)和發(fā)射不具有上轉(zhuǎn)換的特點(diǎn)。與以上公開的專利最重要的區(qū)別是,本發(fā)明采用背景干擾低、信噪比更好的近紅外熒光物質(zhì)連接納米微球。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明建立了一種基于近紅外熒光納米微球標(biāo)記物的免疫層析定量檢測(cè)試劑,以及新的檢測(cè)方法。所述定量檢測(cè)試劑包檢測(cè)試紙條及試紙條的制備方法。其工作原理為:在免疫層析試紙條的樣品墊上固定有近紅外熒光納米微球標(biāo)記的參照物和能與被檢測(cè)物特異性結(jié)合的檢測(cè)分子,當(dāng)檢測(cè)標(biāo)本滴加到樣品墊上,近紅外熒光納米微球標(biāo)記的檢測(cè)分子與被檢測(cè)物形成復(fù)合物,與近紅外熒光納米微球標(biāo)記的參照物在毛細(xì)作用下向上涌動(dòng),在經(jīng)過(guò)檢測(cè)線和質(zhì)控線時(shí)分別被固定在兩條線上的捕獲分子所捕獲。用熒光掃描儀分別讀取參照線和檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度,即可以判斷檢測(cè)標(biāo)本中是否含有被檢測(cè)物;在定量檢測(cè)中,將兩者的熒光強(qiáng)度代入公式,即可得到樣品中待檢測(cè)物的濃度。本發(fā)明所采用的方法是:近紅外熒光分子、納米微球以及抗原或抗體連接。近紅外熒光分子可以首先與檢測(cè)分子連接,然后再與無(wú)色納米微球連接;也可以先將近紅外熒光分子標(biāo)記到無(wú)色納米微球上,再將檢測(cè)分子連接到預(yù)染色的納米微球上。當(dāng)使用夾心法檢測(cè)目標(biāo)分子時(shí)(可以是雙抗體夾心法檢測(cè)抗原,也可以是雙抗原檢測(cè)抗體);在免疫層析試紙的檢測(cè)線上固定的是與目標(biāo)分子可以特異性結(jié)合的抗原或抗體(雙抗體夾心法是抗體,雙抗原夾心法是抗原),在質(zhì)控線上作為參照物的是與目標(biāo)分子和檢測(cè)線固定的分子無(wú)關(guān)的抗體,通常是山羊抗雞IgY多克隆抗體。結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種或多種近紅外熒光納米微球標(biāo)記的抗體或抗原,一種是與檢測(cè)目標(biāo)特異性結(jié)合的抗原或抗體,另外一種是可以與質(zhì)控線上參照物特異性結(jié)合的抗原或抗體,一般是雞IgY。當(dāng)含有目標(biāo)分子的樣品滴加到樣品墊上時(shí),溶液將結(jié)合墊上的兩種成分解離,目標(biāo)分子與解離出來(lái)的特異性結(jié)合分子形成抗原抗體復(fù)合物。抗原抗體復(fù)合物以及參照物隨溶液向試紙條上端移動(dòng)。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物移動(dòng)到檢測(cè)線時(shí),被固定在檢測(cè)線上的目標(biāo)分子特異性結(jié)合分子所捕獲。質(zhì)控分子隨溶液繼續(xù)移動(dòng),當(dāng)移動(dòng)到質(zhì)控線時(shí),被固定在質(zhì)控線上的參照物抗體所捕獲。反應(yīng)結(jié)束后,用熒光掃描儀測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度。由于結(jié)合墊上參照物的量為一個(gè)定值,同時(shí)參照物單克隆抗體不會(huì)與檢測(cè)目標(biāo)分子和抗體結(jié)合,因此,參照物的熒光強(qiáng)度可以作為檢測(cè)試劑的內(nèi)參。通過(guò)計(jì)算檢測(cè)線與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值,并且與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行計(jì)算,就能夠得出樣品中目標(biāo)分子的濃度;當(dāng)使用間接法檢測(cè)目標(biāo)分子時(shí):在免疫層析試紙的檢測(cè)線上固定的是檢測(cè)抗原,在質(zhì)控線上固定的是參照物抗體,一般是山羊抗雞IgY多克隆抗體。結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種近紅外熒光納米微球標(biāo)記的生物分子,分別是小鼠抗人抗體的第二抗體和雞IgY。當(dāng)含有目標(biāo)分子的樣品滴加到樣品墊上后,同時(shí)滴加稀釋液,溶液將結(jié)合墊上的生物大分子解離,近紅外熒光標(biāo)記的第二抗體與人抗體結(jié)合,形成抗體復(fù)合物,在溶液的推動(dòng)下,抗體復(fù)合物和雞IgY隨溶液向試紙條上端移動(dòng)。當(dāng)抗體復(fù)合物移動(dòng)到檢測(cè)線時(shí),抗體復(fù)合物被固定在檢測(cè)線上的抗原所捕獲。雞IgY隨溶液繼續(xù)移動(dòng),當(dāng)移動(dòng)到質(zhì)控線時(shí),被固定在質(zhì)控線上的山羊抗雞IgY抗體所捕獲。反應(yīng)結(jié)束后,用熒光掃描儀測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度。反應(yīng)結(jié)束后,用熒光掃描儀測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度。通過(guò)計(jì)算檢測(cè)線與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值,并且與預(yù)先設(shè)定的閾值進(jìn)行比較,就可以得出樣品中是否含有HIV抗體。當(dāng)使用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)小分子時(shí):在免疫層析試紙的檢測(cè)線上固定的是小分子-BSA偶聯(lián)物,在質(zhì)控線上固定的是作為參照的山羊抗雞IgY多克隆抗體。結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種紅外熒光納米微球標(biāo)記的單克隆抗體,分別是抗小分子單克隆抗體和雞IgY。檢測(cè)時(shí),首先向樣品墊滴加標(biāo)本,然后滴加稀釋液。溶液將結(jié)合墊上的生物大分子解離,若樣品存在一定濃度的小分子時(shí),全部小鼠單克隆抗體被結(jié)合,小分子與抗體結(jié)合的復(fù)合物在溶液的推動(dòng)下向試紙條上端移動(dòng)。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物移動(dòng)到檢測(cè)線時(shí),抗小分子單克隆抗體不能被固定在檢測(cè)線上的BSA-小分子復(fù)合物所捕獲。雞IgY隨溶液繼續(xù)移動(dòng),當(dāng)移動(dòng)到質(zhì)控線時(shí),被固定在質(zhì)控線上的山羊抗雞IgY抗體所捕獲。反應(yīng)結(jié)束后,用熒光掃描儀測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度。反應(yīng)結(jié)束后,用熒光掃描儀測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度。通過(guò)計(jì)算檢測(cè)線與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值,并且與預(yù)先設(shè)定的閾值進(jìn)行比較,就可以得出樣品中是否含有待檢測(cè)的小分子。本申請(qǐng)中所使用的熒光掃描儀器為中國(guó)專利CN201220372662.8公開的便攜式高靈敏度近紅外點(diǎn)熒光掃描儀;本申請(qǐng)中所使用的近紅外熒光標(biāo)記材料為發(fā)射波長(zhǎng)在650_1000nm的染料,優(yōu)選為NHS活化的近紅外熒光染料Dylight800 ;本申請(qǐng)中使用的納米微球直徑在50_300nm,可以是有機(jī)高分子聚合納米微球,也可以是無(wú)機(jī)納米微球;微球表面修飾的化學(xué)集團(tuán),可以是氨基、羧基等集團(tuán),優(yōu)選為羧基修飾的聚苯乙烯納米微球。該檢測(cè)方法與近紅外熒光分子直接標(biāo)記抗原或抗體的方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn):改善了標(biāo)記物、免疫復(fù)合物的層析性質(zhì),縮短了滴加標(biāo)本到層析完成時(shí)間。層析時(shí)間由15-20分鐘縮短為5-15分鐘。近紅外熒光分子直接標(biāo)記的檢測(cè)分子分子量較小,在層析過(guò)程中,可以進(jìn)入層析膜的孔徑中,層析過(guò)程中會(huì)有一部分滯留在層析膜中,造成較高的背景噪音信號(hào);近紅外熒光分子與納米微球結(jié)合后,除與檢測(cè)線和質(zhì)控線結(jié)合外,大部分納米熒光微球通過(guò)膜表面層析到頂端吸水紙,降低了背景熒光強(qiáng)度,提高了信噪比。納米微球直徑在50-300納米,單個(gè)納米微球上可以結(jié)合多個(gè)近紅外熒光分子及抗原抗體,相當(dāng)于信號(hào)放大系統(tǒng),因此提高了檢測(cè)靈敏度。如通過(guò)本發(fā)明建立的血紅蛋白定量檢測(cè)試劑血紅蛋白最低檢出限為500pg/ml,而基于近紅外熒光分子直接標(biāo)記抗體的血紅蛋白檢測(cè)試劑最低檢出限一般為10ng/ml。


      圖1為近紅外突光微球標(biāo)記抗體示意圖;1:納米微球;2:單克隆抗體;3:近紅外突光分子;圖2免疫層析卡示意圖4:吸水墊;5:硝酸纖維膜;6:含有近紅外熒光標(biāo)記物玻璃纖維膜;7:反應(yīng)支持物;8:檢測(cè)線;9:質(zhì)控線;10:樣品墊。圖3為血紅蛋白紅外熒光檢測(cè)4為血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5為近紅外熒光直接標(biāo)記血紅蛋白抗體檢測(cè)血紅蛋白標(biāo)本掃描圖;1:檢測(cè)2000ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品熒光掃描圖:2:檢測(cè)1000ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品熒光掃描圖:3:檢測(cè)500ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品熒光掃描圖:4:檢測(cè):50ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品熒光掃描圖:5:檢測(cè)5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品突光掃描圖:C:質(zhì)控線掃描峰;T:檢測(cè)線掃描峰。圖6為近紅外熒光納米微球標(biāo)記血紅蛋白抗體檢測(cè)500pg/ml血紅蛋白標(biāo)本掃描圖;圖7為近紅外熒光直接標(biāo)記HIV-1P24單克隆抗體檢測(cè)80pg/ml P24標(biāo)準(zhǔn)品掃描圖;圖8為近紅外熒光納米微球標(biāo)記HIV-1P24單克隆抗體檢測(cè)40pg/ml P24標(biāo)準(zhǔn)品掃描9為100pg/ml NT-proBNP近紅外熒光納米微球掃描圖;圖10為50pg/ml NT-proBNP近紅外熒光納米微球掃描圖。
      具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:近紅外熒光納米微球的制備方法本申請(qǐng)中主要采用如下兩種方法制備近紅外熒光納米微球:方法1:熒光染料通過(guò)中間分子即賴氨酸(Lys)或BSA,通過(guò)氨基-羧基縮合反應(yīng)連接在納米微球上,然后再通過(guò)縮合反應(yīng)將檢測(cè)分子連接到納米微球上。按照如下步驟進(jìn)行近紅外熒光染料標(biāo)記納米微球及連接抗體:吸取Iml0.0lmM NaAC pH5.0 到玻璃試管中;加入25 μ 110%竣基納米微球(美國(guó)ACMEmicrospheres),混勻;加入IOmg碳化二亞胺(EDAC),混勻;加入100 μ 1100mg/ml Lys (或 10mg/ml BSA),混勻;加入3.5μ1 Dylight800近紅外突光染料(美國(guó)Thermo Scientific),混勻,室溫振搖I小時(shí);3000g離心5分鐘,吸掉上清,加入Iml0.0lmM NaAC pH5.0重懸微球;3000g離心5分鐘,加入Iml0.0lmM NaAC pH5.0,重懸后,超聲分散微球;加入Img單克隆抗體,室溫振搖I小時(shí),加入9ml重懸液(1%BSA, 5%鹿糖,0.2%Tween20, 0.1%疊氮化鈉,25mM Tris.Cl)混勻,4攝氏度保存。方法2:近紅外熒光分子與檢測(cè)分子通過(guò)氨基-羧基縮合反應(yīng)連接后,再通過(guò)縮合反應(yīng)連接到納米微球上。按照如下步驟進(jìn)行近紅外熒光染料標(biāo)記抗體及連接納米微球:吸取Iml0.0lmM NaAC pH5.0 到玻璃試管中;加入25 μ I羧基納米微球(美國(guó)ACMEmicrospheres),混勻;加入IOmg碳化二亞胺(EDAC),混勻,室溫I小時(shí);3000g離心5分鐘,加入Iml0.0lmM NaAC pH5.0,重懸后,超聲分散微球;吸取Img抗體,加入3.5 μ I Dylight800近紅外突光染料(美國(guó)ThermoScientific),混勻,室溫I小時(shí);將抗體加入到微球中,室溫振搖I小時(shí);加入9ml 重懸液(1%BSA, 5% 蔗糖,0.2%Tween20, 0.1% 疊氮化鈉,25mM Tris.Cl)混
      勻,4攝氏度保存。實(shí)施例2:制作近紅外熒光納米微球血紅蛋白抗原免疫層析檢測(cè)試劑I)標(biāo)記抗體。血紅蛋白單克隆抗體(珠海博美生物技術(shù)有限公司)和雞IgY抗體(英國(guó)Abcam公司)用PBS透析后,按照實(shí)施例1中的方法I或2標(biāo)記抗體。4°C保存。2)制作結(jié)合墊選取玻璃纖維素帶作為結(jié)合墊固相材料,在條帶上噴涂近紅外熒光納米微球標(biāo)記的血紅蛋白單克隆抗體和雞IgY抗體,室溫風(fēng)干條帶。3)制作樣品墊選取纖維素膜帶,將封閉液(5%BSA,0.l%Tween20, PBS)噴涂在膜帶上,室溫風(fēng)干后備用。
      4)制作免疫層析試紙條選取硝酸纖維素膜,將血紅蛋白捕獲單克隆抗體(珠海博美生物技術(shù)有限公司)和羊抗雞IgY多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)用劃線機(jī)在膜上制成檢測(cè)帶和質(zhì)控帶,檢測(cè)帶和質(zhì)控帶間距0.4cm,室溫風(fēng)干膜條帶。5)組裝檢測(cè)試紙卡將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊如圖2方式按照順序安裝好,然后用切割機(jī)切成試紙條,放入塑料卡槽中,組裝成品試紙卡。實(shí)施例3檢測(cè)血紅蛋白標(biāo)本連續(xù)稀釋血紅蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品(珠海博美生物技術(shù)有限公司),用稀釋液(5%BSA,
      0.l%Tween20, PBS)將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 2 倍系列稀釋,制成 2 μ g/ml、I μ g/ml、500ng/ml、250ng/mll25ng/ml、62.5ng/ml、31.3/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、l.9ng/ml 樣品。用微量加樣器吸取50 μ I以上標(biāo)本滴加到樣品墊上,待樣品吸收后用滴管滴加50 μ I樣品稀釋液。室溫靜置10分鐘,將樣品卡放到便攜式高靈敏近紅外點(diǎn)熒光掃描儀(北京潤(rùn)博福得科技發(fā)展有限公司)中讀數(shù)。用檢測(cè)線熒光值值除以質(zhì)控線熒光值為測(cè)量值。每個(gè)樣品濃度進(jìn)行測(cè)量?jī)纱?,取平均值后,以測(cè)量值對(duì)樣品濃度做圖。結(jié)果如圖3所示。用檢測(cè)峰熒光值除以質(zhì)控峰熒光值作為檢測(cè)結(jié)果。每個(gè)濃度做兩次重復(fù)試驗(yàn),取兩次結(jié)果平均值,以平均值對(duì)樣品濃度做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,如圖4所示。將血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋為2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml, 500pg/ml,同時(shí)使用近紅外突光分子直接標(biāo)記血紅蛋白抗體(中國(guó)專利CN201210152948.X公開的方法)制備的血紅蛋白試紙條以及本申請(qǐng)中制備的試劑檢測(cè)以上血紅蛋白標(biāo)本。結(jié)果見圖5及圖6。結(jié)果:用近紅外熒光納米直接標(biāo)記血紅蛋白抗體制備的試紙條檢測(cè),結(jié)果顯示檢測(cè)下限在5ng/ml (圖5),而用近紅外熒光納米微球標(biāo)記血紅蛋白抗體后,檢測(cè)下限達(dá)到500pg/ml (圖6),比近紅外熒光分子直接標(biāo)記血紅蛋白單克隆抗體靈敏度高約10倍;本申請(qǐng)中制備的血紅蛋白檢測(cè)試劑血紅蛋白濃度與檢測(cè)信號(hào)值從4ng/ml到2000ng/ml線性關(guān)系良好。因此,近紅外熒光分子標(biāo)記納米微球應(yīng)用于免疫層析可以提高檢測(cè)靈敏度。表1:不同濃度血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)檢測(cè)結(jié)果。
      權(quán)利要求
      1.一種近紅外熒光分子免疫層析試紙,其特征在于:由依次在帶有粘合劑的反應(yīng)支持物上相互搭接的樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊組成,其中, 所述的結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種或多種連接有近紅外熒光納米微球標(biāo)記的抗體或抗原,一種是與檢測(cè)目標(biāo)特異性結(jié)合的抗原或抗體,即檢測(cè)分子,另外一種是與質(zhì)控線上參照物特異性結(jié)合的抗原或抗體; 所述的抗體承載膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜,抗體承載膜上分別用可以與目標(biāo)分子可以特異性結(jié)合的抗原或抗體,即捕獲分子,和作為質(zhì)控的抗體劃?rùn)z測(cè)線以及質(zhì)控線;所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線區(qū)域的熒光強(qiáng)度的比值為檢測(cè)值;通過(guò)檢測(cè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,可以建立待檢樣品濃度與檢測(cè)值的工作曲線和方程;待檢樣品的檢測(cè)值代入工作方程后,即可以完成待測(cè)樣 品的定量檢測(cè),得到樣品中待檢測(cè)物的濃度。
      2.權(quán)利要求1的近紅外熒光納米微球免疫層析試紙,所述的近紅外熒光標(biāo)記材料為發(fā)射波長(zhǎng)在650-1000nm的染料,優(yōu)選為NHS活化的近紅外熒光染料Dylight800。
      3.權(quán)利要求1的近紅外熒光納米微球免疫層析試紙,所述的納米微球?yàn)橹睆皆?0-300nm的微球,可以是聚苯乙烯微球、乳膠微球、磁微球、二氧化硅微球等材料,優(yōu)選為聚苯乙烯納米微球。
      4.權(quán)利要求1所述的近紅外熒光納米微球免疫層析試紙,近紅外熒光納米微球的制備方法可以是在納米微球合成過(guò)程中摻入,也可以在納米微球合成后連接;優(yōu)選的方法是使用中間分子,如賴氨酸或BSA,通過(guò)化學(xué)鍵如通過(guò)氨基-羧基縮合反應(yīng)將近紅外熒光分子與納米微球連接起來(lái)。
      5.權(quán)利要求4所述的近紅外熒光納米微球免疫層析試紙,所述近紅外熒光納米微球的制備方法主要步驟為: 1)用碳化二亞胺活化羧基修飾的聚苯乙烯納米微球; 2)加入中間分子如賴氨酸或BSA,使中間分子連接到活化的納米微球上; 3)加入近紅外熒光染料標(biāo)記到中間分子上; 4)在加入捕獲抗體或抗原與熒光納米微球連接。
      6.權(quán)利要求1-5的近紅外熒光分子免疫層析試紙,結(jié)合墊上所述的與質(zhì)控線上參照物特異性結(jié)合的抗原或抗體是雞IgY ;質(zhì)控線上所述的與目標(biāo)分子和檢測(cè)線固定的分子無(wú)關(guān)的抗體為山羊抗雞IgY多克隆抗體。
      7.權(quán)利要求1-6之一的近紅外熒光分子免疫層析試紙,所述檢測(cè)線上固定的檢測(cè)分子是小分子-BSA偶聯(lián)物,所述質(zhì)控線上固定的是作為參照的山羊抗雞IgY多克隆抗體。所述結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種紅外熒光納米微球標(biāo)記的單克隆抗體,分別是抗小分子單克隆抗體和雞IgY。
      8.權(quán)利要求1-7之一的近紅外熒光分子免疫層析試紙,所述檢測(cè)線上固定的檢測(cè)分子是抗原,在質(zhì)控線上固定的是參照物抗體,例如是山羊抗雞IgY多克隆抗體。結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種近紅外熒光納米微球標(biāo)記的生物分子,分別是作為檢測(cè)分子的第二抗體(抗抗體)和雞IgY,抗抗體可以是小鼠來(lái)源、山羊來(lái)源或兔來(lái)源。
      9.權(quán)利要求1-7之一的近紅外熒光分子免疫層析試紙,所述檢測(cè)線上固定的檢測(cè)分子是抗原,在質(zhì)控線上固定的是參照物抗體,例如是山羊抗雞IgY多克隆抗體。結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種近紅外熒光納米微球標(biāo)記的生物分子,分別是作為檢測(cè)分子的抗原和雞 IgY.
      10.權(quán)利要求1-7之一的近紅外熒光分子免疫層析試紙,所述檢測(cè)線上固定的檢測(cè)分子是抗體,在質(zhì)控線上固定的是參照物抗體,例如是山羊抗雞IgY多克隆抗體。結(jié)合墊上分別用噴涂法固定了兩種近紅外熒光納米微球標(biāo)記的生物分子,分別是作為檢測(cè)分子的抗體和雞IgYo
      11.權(quán)利要求1-10所述近紅外熒光納米微球免疫層析試紙的制備方法,其主要步驟為: 1)制備紅外熒光納米微球標(biāo)記檢測(cè)分子和雞IgY; 2)制作結(jié)合墊; 3)制作樣品墊; 4)制作免疫層析試紙條。
      12.一種利用權(quán)利要求1-10之一所述的近紅外熒光分子免疫層析試紙定量檢測(cè)抗原或抗體的方法,包括如下步驟: 1)將抗原或抗體標(biāo)準(zhǔn)品配制成2 10倍梯度的濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品; 2)將上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品分別用權(quán)利要求1-10之一所述的試紙進(jìn)行免疫層析,利用熒光定量光譜儀分別檢測(cè)檢測(cè)線和質(zhì)檢線區(qū)域的熒光強(qiáng)度,制作抗原或抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.3)待測(cè)抗原或抗體用權(quán)利要求1-7之一所述的試紙進(jìn)行免疫層析,利用上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得抗原或抗體濃度。
      13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光免疫層析試紙定量檢測(cè)抗原的方法,其特征在于,所述的抗原或抗體為血紅蛋白、NT-proBNP、HIV-lP24、或鹽酸克倫特羅等單克隆抗體。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種基于近紅外熒光分子與納米微球標(biāo)記的方法以及基于近紅外熒光納米微球的免疫層析定量檢測(cè)試劑。本發(fā)明將近紅外熒光與納米微球連接,制備了基于近紅外熒光納米微球的免疫層析試紙條。在檢測(cè)過(guò)程中,利用紅外光掃描儀,采用近紅外光分別掃描質(zhì)控線和樣品線,用質(zhì)控線熒光強(qiáng)度校正檢測(cè)線熒光強(qiáng)度后代入熒光分析儀中的標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可分析檢測(cè)標(biāo)本中的待測(cè)物的濃度。與近紅外熒光分子直接與檢測(cè)分子連接相比,近紅外熒光納米微球免疫層析顯著的提高了檢測(cè)靈敏度,降低了背景熒光強(qiáng)度。該標(biāo)記方法和試劑可以在微生物檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、毒品檢測(cè)以及危險(xiǎn)化學(xué)品快速檢測(cè)中應(yīng)用。
      文檔編號(hào)G01N33/577GK103197074SQ20131014088
      公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
      發(fā)明者李志剛, 陳唯軍 申請(qǐng)人:北京潤(rùn)博福得生物科技發(fā)展有限公司
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