專利名稱：一種銀翹解毒軟膠囊指紋圖譜的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種銀翹解毒軟膠囊指紋圖譜的測定方法。
背景技術(shù)：
銀翹解毒軟膠囊原方來源于清代吳鞠通《溫病條辨》中的銀翹散。該方具有辛涼解表、清熱解毒的功效，現(xiàn)代用于治療流行性感冒、急性扁桃體炎、咽喉炎、肺炎、皰疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性疾病?！吨袊幍洹?010年版一部第1089-1090頁收錄了銀翹解毒軟膠囊，其配方為金銀花400g，連翹400g，薄荷240g，荊芥160g，淡豆豉200g，牛蒡子(炒)240g,桔梗240g，淡竹葉160g，甘草200g。然而藥典收載的銀翹解毒軟膠囊鑒別項下采用薄層色譜法對處方中的荊芥、連翹、牛蒡子、甘草、薄荷5味藥材進(jìn)行鑒別，含量測定項下采用高效液相色譜法以綠原酸為指標(biāo)進(jìn)行含量測定。CN101991785A(中國專利申請?zhí)?200910168454.9，公告日:2012.07.18，發(fā)明名稱:一種銀翹解毒軟膠囊藥物及其制備方法與質(zhì)量檢測方法)公開了銀翹解毒軟膠囊的制備方法與質(zhì)量檢測方法，其質(zhì)量檢測方法包括薄層鑒別及含量測定方法，其含量測定方法為(I)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-0.1%磷酸溶液比例為9: 91為流動相，檢測波長為327nm，理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000;
(2)對照品溶液的制備:精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色瓶中，加甲醇制成每Iml含30 Ug的溶液；(3)供試品溶液的制備:取本品內(nèi)容物，混勻，精密稱取lg，置圓底燒瓶中，加入二氯甲烷40ml，水浴回流I小時，濾過，棄去二氯甲烷液，殘渣加甲醇50ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，甲醇洗滌藥渣數(shù)次，合并濾液和洗液于IOOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾 膜濾過，即得；(4)測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測定，本品每粒含綠原酸不得少于1.40mg。銀翹解毒軟膠囊成分較復(fù)雜，而臨床用藥強調(diào)整體性，現(xiàn)行的單一測定方法片面，無法全面、準(zhǔn)確地評價中藥制劑質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供該藥物的指紋圖譜的測定方法，以便有效地控制本發(fā)明藥物的質(zhì)量。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種銀翹解毒軟膠囊指紋圖譜的測定方法，該方法采用高效液相色譜法，包括以下步驟:(I)供試品溶液的制備:精密稱取銀翹解毒軟膠囊lg，置具塞錐形瓶中，加入甲醇，超聲，放冷，補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，濾過；(2)對照品溶液的制備:精密稱取甘草苷、連翹酯苷A、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，加甲醇配成混合溶液，即得；
(3)測定方法:分別精密量取對照品和供試品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀，考察IlOmin內(nèi)供試品溶液的色譜分離情況，記錄色譜圖。上述測定方法的優(yōu)選方案為:(I)供試品溶液的制備:精密稱取銀翹解毒軟膠囊lg，置具塞錐形瓶中，加入50mL甲醇，超聲30min,放冷,補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μ m濾膜濾過；(2)對照品溶液的制備:精密稱取甘草苷、連翹酯苷A、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，加甲醇配成濃度分別為117.2、129.6,54.1,82.3,51.2,89.0,51.3,59.5、57.4μ g/ml 的混合溶液，即得；(3)測定方法:分別精密量取對照品和供試品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀，考察IlOmin內(nèi)供試品溶液的色譜分離情況，記錄SOmin色譜圖。其中所述流動 相:乙腈:磷酸水溶液；乙腈5-25%:磷酸水溶液95-75% ;梯度洗脫:T(min) 0-150 ;柱溫:30°C ;檢測波長 327nm。其中所述銀翹解毒軟膠囊指紋圖譜用以下方法建立，取10批銀翹解毒軟膠囊，分別按上述供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，根據(jù)檢測所得的10批檢測數(shù)據(jù)，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A》進(jìn)行評價，在327nm檢測波長下的相似度大于
0.95的圖譜為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；其中所述銀翹解毒軟膠囊指紋圖譜在327nm檢測波長下的指紋圖譜具有14個特征峰，其中2號峰為新綠原酸，4號峰為綠原酸，5號峰為隱綠原酸，6號峰為咖啡酸，8號峰為甘草苷，9號峰為連翹酯苷A，12號峰為異綠原酸B，13號峰為異綠原酸A，14號峰為異綠原酸C ;歸屬于金銀花的有6個峰分別為峰2、4、5、12、13、14 ;歸屬于連翹的有5個峰分別為峰7、8、9、10、11 ;歸屬于薄荷的有3個峰分別為峰1、5、6 ;歸屬于牛蒡子的有7個峰分別為峰2、4、5、6、12、13、14 ;歸屬于甘草的3個峰分別為峰1、7、8 ;歸屬于桔梗I個峰為峰I。本發(fā)明的測定方法，采用高效液相色譜法，其色譜條件優(yōu)選為:色譜柱為Kromasil C18 柱(250mmX 4.6mm, 5 μ m),柱溫:30°C，流動相:A為乙腈，B為磷酸水溶液，洗脫方式:梯度洗脫，流動相流速:1.0ml/min,進(jìn)樣量10 μ L,檢測波長:327nm。其中所述流動相A為乙腈，B為0.1 %磷酸水溶液。其中，梯度洗脫過程如下:
T/min乙腈 %0.1% 磷酸-7jC%
O5%95%
2015%85%
4520%80%
8025%75%
本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種銀翹解毒軟膠囊指紋圖譜的構(gòu)建方法。本發(fā)明的測定方法專屬性強、操作簡便、且具有優(yōu)異的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性，可較全面的、完整、準(zhǔn)確的評價銀翹解毒軟膠囊的有效性、安全性、穩(wěn)定性和質(zhì)量均一性。為證實本發(fā)明指紋圖譜測定方法的效果，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實驗進(jìn)行優(yōu)選，并對最終確定的測定方法進(jìn)行了科學(xué)的驗證，驗證實驗如下:I儀器與試藥1.1儀器與試劑:Agilentll00高效液相色譜儀系統(tǒng)，Agilentl200高效液相色譜儀系統(tǒng)，AB204-S電子天平，KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，甲醇、乙腈，超純水。1.2試藥:銀翹解毒軟膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，批號分別為Z120701、 Z120301、 Z120801、 Z120401、 Z120501、 Z120901、 Z120902、 Z120201、 Z120702、Z120302)、對照品綠原酸(批號110753-200413)購于中國食品藥品鑒定研究院，咖啡酸(批號 110885-200102)、甘草苷(批號 111610-201005)、連翹酯苷 A (批號 111810-201103)均購于中國藥品生物制品檢定所，新綠原酸(批號MUST-11112202)、隱綠原酸(批號MUST-11112203)、異綠原酸 A (批號 MUST-11061601)、異綠原酸 B (批號 MUST-11083102)、異綠原酸C (批號MUST-11081803)均購于成都曼思特生物科技有限公司。2色譜條件的確定2.1流動相的選擇考察了乙腈-水、乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.05%三氟乙酸系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果見附

圖1，結(jié)果表明選擇乙腈-0.1 %磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫時，得到的色譜峰形較好，且較穩(wěn)定。記錄該色譜條件下IlOmin色譜圖，SOmin后無色譜峰出現(xiàn)，故色譜記錄時間為80mino`
2.2測定波長的選擇采用DAD 二級管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，比較了 200 400nm所得的HPLC圖譜，結(jié)果在250nm，280nm，327nm波長檢測時，其HPLC圖譜中呈現(xiàn)較多的色譜峰(見附圖2)，但是為了排除輔料類成分干擾，同時使各色譜峰分離度較好、出峰數(shù)目適中、峰形較好，故確定327nm處波長為檢測波長。2.3色譜柱及儀器型號的考察考察了Phenomenex GeminiC18 柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m), WatersSymmetry@C18 柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m), Kromasil C18 柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m) 3 種不同型號的色譜柱，結(jié)果見附圖3。Kromasil C18柱的出峰較其他兩種色譜柱早，而且各色譜峰分離度較佳，峰形較好，因此選擇Kromasil C18柱。2.4柱溫的選擇實驗中考察了 30°C、35°C、40°C三個柱溫條件下，各色譜峰的分離情況見附圖4，結(jié)果表明，不同柱溫下的色譜峰略有區(qū)別，當(dāng)溫度升高時，部分峰發(fā)生峰位相對位移與合并，使分離度降低，因此選擇在柱溫30°C時進(jìn)行檢測。3供試品溶液提取方法試驗為了能夠在指紋圖譜中全面反映銀翹解毒軟膠囊的成分，本發(fā)明未采用現(xiàn)有技術(shù)CN101991785A中供試品制備方法(取銀翹解毒軟膠囊內(nèi)容物加入二氯甲烷，水浴回流，濾過，棄去二氯甲烷液，殘渣加甲醇，超聲處理)，本發(fā)明創(chuàng)新了供試品的制備方法，采取直接對銀翹解毒軟膠囊內(nèi)容物進(jìn)行提取，分別對提取溶劑(甲醇、乙醇、80%甲醇、50%甲醇)、提取方式(超聲、加熱回流)及提取時間進(jìn)行了考察，最終選擇用甲醇超聲30min，方法簡便，得到的色譜峰信息豐富。4方法與結(jié)果4.1對照品溶液的制備:精密稱取甘草苷、連翹酯苷A、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，加甲醇配成濃度分別為117.2、129.6,54.1,82.3,51.2,89.0,51.3,59.5,57.4 μ g/ml 的混合溶液，即得。4.2供試品溶液的制備:取裝量差異項下的銀翹解毒軟膠囊內(nèi)容物(批號120701)約lg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，超聲30min(30°C，100W，40kHz)，放冷，補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μ m濾膜濾過。4.3色譜條件:色譜柱為 Kromasil C18 柱(250mmX 4.6mm, 5 μ m),檢測波長327nm,柱溫30°C，體積流量1.0ml/min,流動相為乙腈(A) -0.1 %的磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序的體積濃度配置如下:
權(quán)利要求
1.一種銀翹解毒軟膠囊指紋圖譜的測定方法，其特征在于該方法采用高效液相色譜法，包括以下步驟: (1)供試品溶液的制備:精密稱取銀翹解毒軟膠囊lg，置具塞錐形瓶中，加入甲醇，超聲，放冷，補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，濾過； (2)對照品溶液的制備:精密稱取甘草苷、連翹酯苷A、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，加甲醇配成混合溶液，即得； (3)測定方法:分別精密量取對照品和供試品溶液各10μ L，注入高效液相色譜儀，考察IlOmin內(nèi)供試品溶液的色譜分離情況，記錄色譜圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱為 Kromasil C18 柱(250mm X 4.6mm, 5 μ m), 柱溫:30°C， 流動相:A為乙腈，B為磷酸水溶液， 洗脫方式:梯度洗脫， 流動相流速:1.0ml/min,檢測波長:327nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征在于，流動相B為0.1 %的磷酸水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征在于，洗脫時間為0-150分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測定方法，其特征在于，洗脫時間為0-110分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征在于，所述梯度洗脫步驟為:0 20分鐘，流動相乙腈:磷酸水溶液的體積比由5: 95漸變?yōu)?5: 85 ;20 45分鐘，流動相乙腈:磷酸水溶液的體積比由15: 85漸變?yōu)?0: 80 ;45 80分鐘，流動相乙腈:磷酸水溶液的體積比由20: 80漸變?yōu)?5: 75。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述銀翹解毒軟膠囊的指紋圖譜測定方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)供試品溶液的制備:精密稱取銀翹解毒軟膠囊lg，置具塞錐形瓶中，加入50mL甲醇，超聲30min,放冷,補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μ m濾膜濾過； (2)對照品溶液的制備:精密稱取甘草苷、連翹酯苷A、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，加甲醇配成濃度分別為117.2、·129.6,54.1,82.3,51.2,89.0,51.3,59.5,57.4ug/ml 的混合溶液，即得； (3)測定方法:分別精密量取對照品和供試品溶液各10μ L，注入高效液相色譜儀，考察IlOmin內(nèi)供試品溶液的色譜分離情況，記錄80min色譜圖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述銀翹解毒軟膠囊的指紋圖譜測定方法得到的HPLC指紋圖譜，其特征在于，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度大于0.95。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種銀翹解毒軟膠囊的指紋圖譜測定方法。該方法包括(a)供試品溶液的制備，(b)對照品溶液的制備，(c)色譜條件色譜柱為Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫30℃，流動相A為乙腈，B為磷酸水溶液，梯度洗脫，流速1.0ml/min，檢測波長327nm，(d)測定，得到銀翹解毒軟膠囊的指紋圖譜。該方法專屬性強、操作簡便，可以有效地控制銀翹解毒軟膠囊的質(zhì)量。
文檔編號G01N30/02GK103245739SQ20131014111
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者蕭偉, 周曉峰, 王振中, 畢宇安, 徐連明, 梁慧慧, 徐豐果, 章晨峰, 徐海娟, 王團結(jié) 申請人:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司