一種基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物化學(xué)的檢測(cè)和分析領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)和應(yīng)用。將結(jié)合有特異性的功能分子的多巴胺，即為生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)。所述多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域用于檢測(cè)生物分子。本發(fā)明利用特異性分子標(biāo)記的多巴胺放大信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子，比如蛋白因子、核酸、微生物、病毒等，用其檢測(cè)檢測(cè)控制生物分子濃度的變化，能夠快速檢測(cè)對(duì)生物分子、微生物和細(xì)胞。相對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附的測(cè)量，本發(fā)明的快速檢測(cè)和分析生物分子具有顯著的特異性，同時(shí)準(zhǔn)確性高。利用多巴胺放大信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高，不容易失活，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】—種基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)的檢測(cè)和分析領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]在環(huán)境安全檢測(cè)和人體健康的監(jiān)控中，許多生物靶點(diǎn)分子的含量非常低。很多生物信號(hào)分子、有害微生物或腫瘤細(xì)胞在初期濃度非常低，需要對(duì)靶點(diǎn)物質(zhì)進(jìn)行信號(hào)放大才可以檢測(cè)分析。目前，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種信號(hào)放大的技術(shù)來(lái)檢測(cè)低豐度靶點(diǎn)，包括銀增加強(qiáng)反應(yīng)、酪氨酸信號(hào)放大、酶金屬礦化和滾環(huán)放大報(bào)告系統(tǒng)。銀增強(qiáng)反應(yīng)基于納米金催化沉淀銀，從而來(lái)檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)和微生物等有害物質(zhì)(Wan，Y., Wang, Y., ffu, J., Zhang, D.,2011b.Analytical Chemistry83(3), 648-653 ；Taton,T.A., Mirkin, C.A., Letsinger, R.L.，2000.Science289 (5485)，1757-1760.)。相對(duì)銀增強(qiáng)的技術(shù)來(lái)說(shuō)，替代的方案用過(guò)氧化物酶來(lái)催化銀的沉淀，這種方法叫酶礦化技術(shù)(Mm ler, R.，Powell, R.D.，Hainfeld, J.F.，F(xiàn)ritzsche, W.，2005.Nano Letters5 (7)，1475-1482)。最近出現(xiàn)一種超靈敏的技術(shù)，結(jié)合氫化酶標(biāo)記的酶聯(lián)免疫反應(yīng)來(lái)控制納米金生成過(guò)程，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的信號(hào)(de IaRica, R., Stevens, Μ.Μ., 2012.Nature Nanotechnology do1: 10.1038/nnan0.2012.186),來(lái)分析生物靶點(diǎn)物質(zhì)。酪氨酸信號(hào)放大系統(tǒng)結(jié)合生物沉淀和熒光標(biāo)記來(lái)增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)免疫反應(yīng)的靈敏度(Clutter, M.R., Heffner, G.C., Krutzik, P.0., Sachen, K.L., Nolan, G.P., 2010.Cytometry Part A77A(11)，1020-1031)。滾環(huán)放大技術(shù)是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法,在RCA反應(yīng)中，DNA目標(biāo)鏈可沿環(huán)形探針頂替擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)；同時(shí)環(huán)形探針的鏈接成環(huán)對(duì)DNA單堿基錯(cuò)配有很高的特異性，適合單核苷酸突變的分析檢測(cè)。
[0003]多巴胺是一種包含有苯酚結(jié)構(gòu)和氨基官能團(tuán)用來(lái)幫助細(xì)胞傳送脈沖的化學(xué)物質(zhì)。它廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，特別是在貝殼類粘附蛋白中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高濃度的多巴胺。多巴胺是一種很神奇的分子，這種腦內(nèi)分泌物質(zhì)主要負(fù)責(zé)大腦的情欲，感覺(jué)，傳遞興奮及開(kāi)心等信息，也與上癒有關(guān)。
[0004]當(dāng)pH為8.5時(shí)，多巴胺能夠發(fā)生聚合形成聚多巴胺。聚合膜與貝殼類粘附蛋白的結(jié)構(gòu)很相似。聚多巴胺膜這種特殊的結(jié)構(gòu)，能夠用于化學(xué)反應(yīng)吸附和沉積生物或者化學(xué)分子。它能夠與很多種類的無(wú)機(jī)材料形成強(qiáng)的化學(xué)鍵結(jié)構(gòu)，這種鍵的作用力比生物素-親和素作用交聯(lián)還要強(qiáng)(Ryu, J., Ku, S.H., Lee, H., Park, C.B., 2010.Advanced Funct1nalMaterials20 (13) ,2132-2139)。因此，多巴胺的自聚合被用作一種多功能的強(qiáng)力復(fù)合膜覆蓋在金屬材料、陶瓷、金屬氧化物以及聚合物表面。聚多巴胺不僅能夠作為固定的檢測(cè)平臺(tái)，而且可以作為交聯(lián)試劑來(lái)固定生物化學(xué)分子。首先，生物傳感器的固定平臺(tái)對(duì)傳感器的選擇性、檢測(cè)限以及穩(wěn)定性有重要影響。許多不同的檢測(cè)平臺(tái)，如自組裝膜、有機(jī)聚合材料、納米材料摻雜的聚合膜，已經(jīng)用于抗體以及其他蛋白的固定。這些材料具有良好的生物相容性和有序的結(jié)構(gòu)，使其能夠在微生物檢測(cè)以及細(xì)胞行為研究方面發(fā)揮重要的作用。其次，對(duì)于研究危害人體健康的微生物檢測(cè)以及環(huán)境體系中生物安全和污染而言，抗體及其它蛋白的固定扮演很重要的角色?？贵w及其他生物分子在表面的固定分為非共價(jià)交聯(lián)和共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)。非共價(jià)交聯(lián)是通過(guò)物理吸附、蛋白相互作用、氫鍵、范德華力作用以及疏水相互作用使生物或者化學(xué)分子能夠在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(>12h)固定在固體物質(zhì)表面。共價(jià)交聯(lián)是在自組裝膜的表面通過(guò)EDC/NHS在短時(shí)間內(nèi)激活，使生物或化學(xué)分子修飾到自組裝膜的表面形成穩(wěn)定的、可重復(fù)的、可靠的生物功能膜(Kang, S.M., You, 1., Cho, ff.Κ., Shon, Η.K., Lee, Τ.G., Choi, 1.S., Karp, J.Μ., Lee, H., 2010.Angewandte Chemie-1nternat1nalEdit1n49 (49) ,9401-9404)。最近的研究表明，蛋白分子可以通過(guò)聚多巴胺的結(jié)構(gòu)直接修飾到固定的表面形成功能膜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)和應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)，將結(jié)合有特異性的功能分子的多巴胺，即為生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)。
[0008]所述特異性的功能分子可為生物素、主客體分子、重氮鹽、適配體、抗體或組氨酸標(biāo)簽。
[0009]基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)的應(yīng)用，所述多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域用于檢測(cè)生物分子。
[0010]所述多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)應(yīng)用于免疫吸附測(cè)定、電化學(xué)生物傳感器、熒光顯微鏡技術(shù)或激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)中進(jìn)行生物分子的檢測(cè)。
[0011]所述多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)在過(guò)氧化物酶的催化作用下，功能化的多巴胺分子聚合沉淀到生物靶點(diǎn)分子表面，聚合的特異性的功能分子同時(shí)提供大量的活性功能位點(diǎn)。
[0012]所述過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶或氫化酶。
[0013]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0014]本發(fā)明利用特異性分子標(biāo)記的多巴胺放大信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子，比如蛋白因子、核酸、微生物、病毒等，用其檢測(cè)檢測(cè)控制生物分子濃度的變化，能夠快速檢測(cè)對(duì)生物分子、微生物和細(xì)胞。相對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附的測(cè)量，利用多巴胺放大信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子具有顯著的特異性，同時(shí)準(zhǔn)確性高。利用多巴胺放大信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高，不容易失活，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供生物激發(fā)的多巴胺信號(hào)放大系統(tǒng)示意圖(a)和多巴胺介導(dǎo)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附測(cè)定(b)，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附測(cè)定作為控制對(duì)照試驗(yàn)。
[0016]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的生物激發(fā)的多巴胺信號(hào)放大系統(tǒng)介導(dǎo)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定分析腫瘤壞死因子-α的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照曲線。
[0017]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供生物激發(fā)的多巴胺信號(hào)放大系統(tǒng)介導(dǎo)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定分析腫瘤壞死因子-α和其他非特異性蛋白因子的信號(hào)強(qiáng)度，所有蛋白因子的濃度為1.0X10_8mol L'

【具體實(shí)施方式】
[0018]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1:
[0020]傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和多巴胺介導(dǎo)的免疫反應(yīng)檢測(cè)人體腫瘤壞死因子- α。
[0021]100 μ L鼠抗腫瘤壞死因子-α抗體滴加在96孔板表面4°C過(guò)夜，用緩沖液清洗三次；加入200 μ L封閉液，室溫下反應(yīng)30min，再用緩沖液清洗三次；再加入重組的人體腫瘤壞死因子-α (ΙΟ44到l(T5mol Γ1)，37°C反應(yīng)lh。接著加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人體腫瘤壞死因子-α抗體，37°C反應(yīng)lh。
[0022]對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，每孔加入100 μ L TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ Llmol L-1H2SO4,終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)(參見(jiàn)圖3)，其檢測(cè)范圍為1.0X10-n-1.0X10-6mOl L-1。檢測(cè)限為1.9X 10-nmol L—1，分析靈敏度7.9Xl(Tnmol L'
[0023]對(duì)于多巴胺介導(dǎo)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，100 μ L生物素標(biāo)記多巴胺工作液加入每孔，室溫下反應(yīng)20min，用緩沖液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，37°C反應(yīng)lh，用緩沖液清洗三次。每孔加入10yL TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ Llmoir1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。(參見(jiàn)圖3)具其檢測(cè)范圍為 1.0X10_13-1.0X10_6mol L' 檢測(cè)限為 4.1 X 1(Γ13，分析靈敏度 1.2 X l(T12molL'
[0024]其中，生物素標(biāo)記多巴胺步驟為:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽鍵縮合劑(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二異丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反應(yīng) 24h。再加入乙醚(30mL),過(guò)濾白色固體，用硅膠柱色譜純化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg終產(chǎn)物。
[0025]實(shí)施例2:
[0026]傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和多巴胺介導(dǎo)的免疫反應(yīng)檢測(cè)硫酸鹽還原菌。100 μ L硫酸鹽還原菌抗體滴加在96孔板表面4°C過(guò)夜，用緩沖液清洗三次；加入200 μ L封閉液，室溫下反應(yīng)30min，再用緩沖液清洗三次；再加入硫酸鹽還原菌(11到108cfu mL—1)，37°C反應(yīng)lh。接著加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的硫酸鹽還原菌抗體，37°C反應(yīng)lh。
[0027]對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，每孔加入100 μ L TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ Llmol L-1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。，其檢測(cè)范圍為 1.0XlO2-L OXlO6Cfu mL' 檢測(cè)限為 200cfu mL—1，分析靈敏度 10cfu mL'
[0028]對(duì)于多巴胺介導(dǎo)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，100 μ L生物素標(biāo)記多巴胺工作液加入每孔，室溫下反應(yīng)20min，用緩沖液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，37°C反應(yīng)lh，用緩沖液清洗三次。每孔加入10yL TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ LlmolL-1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。，其檢測(cè)范圍為1.0X 11-L OX 17Cfu mL'檢測(cè)限為δΟπιοΙΓ1，分析靈敏度 1cfu HiTr1O
[0029]其中，生物素標(biāo)記多巴胺步驟為:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽鍵縮合劑(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二異丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反應(yīng) 24h。再加入乙醚(30mL),過(guò)濾白色固體，用硅膠柱色譜純化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg終產(chǎn)物。
[0030]實(shí)施例3:
[0031]傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和多巴胺介導(dǎo)的免疫反應(yīng)檢測(cè)黃曲霉素。100 μ L黃曲霉素抗體滴加在96孔板表面4°C過(guò)夜，用緩沖液清洗三次；加入200 μ L封閉液，室溫下反應(yīng)30min，再用緩沖液清洗三次；再加入黃曲霉素(10_14到10_5mol L—1)，37°C反應(yīng)lh。接著加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉素抗體，37°C反應(yīng)lh。
[0032]對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，每孔加入100 μ L TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ Llmol T1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。其檢測(cè)范圍為 2.1Χ10_1(ι-2.lX10_6mOl L' 檢測(cè)限為 5.0 X l(Tnmol ?Λ 分析靈敏度 7.9 X l(Tnmol
I/1。
[0033]對(duì)于多巴胺介導(dǎo)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，100 μ L生物素標(biāo)記多巴胺工作液加入每孔，室溫下反應(yīng)20min，用緩沖液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，37°C反應(yīng)lh，用緩沖液清洗三次。每孔加入10yL TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ Llmoir1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)，其檢測(cè)范圍為2.1Χ1(Γ12-2.lXl(T6mol I71，檢測(cè)限為 2.I X l(T12mol Γ1，分析靈敏度 1.0 X l(T12mol L'
[0034]其中，生物素標(biāo)記多巴胺步驟為:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽鍵縮合劑(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二異丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反應(yīng) 24h。再加入乙醚(30mL),過(guò)濾白色固體，用硅膠柱色譜純化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg終產(chǎn)物。
[0035]實(shí)施例4:
[0036]傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫吸附測(cè)定和多巴胺介導(dǎo)的電化學(xué)免疫反應(yīng)檢測(cè)人體腫瘤壞死因子-α。100 μ L鼠抗腫瘤壞死因子-Ct抗體修飾在金電極表面4°C過(guò)夜,用緩沖液清洗三次；加入200 μ L封閉液，室溫下反應(yīng)30min，再用緩沖液清洗三次；再加入重組的人體腫瘤壞死因子-α (ΙΟ44到l(T5mol Γ1)，37°C反應(yīng)lh。接著加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人體腫瘤壞死因子-α抗體，37°C反應(yīng)lh。
[0037]對(duì)于傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，每孔加入100 μ L TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50yLlmol T1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用電化學(xué)分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。其檢測(cè)范圍為2.0X 10_n-2.0X 1-6H1l L-1。檢測(cè)限為0.9X 10-nmol L—1，分析靈敏度7.9Xl(T13mol L'
[0038]對(duì)于多巴胺介導(dǎo)的電化學(xué)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，100 μ L生物素標(biāo)記多巴胺工作液加入每孔，室溫下反應(yīng)20min，用緩沖液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，37°C反應(yīng)lh，用緩沖液清洗三次。每孔加入10yL TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ Llmol T1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用電化學(xué)分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。其檢測(cè)范圍為 L OXKT12-L OX l(T5mol L' 檢測(cè)限為 1.9X10_13mol ?Λ 分析靈敏度 8.9X 10_14molL'
[0039]其中，生物素標(biāo)記多巴胺步驟為:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽鍵縮合劑(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二異丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反應(yīng) 24h。再加入乙醚(30mL),過(guò)濾白色固體，用硅膠柱色譜純化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg終產(chǎn)物。
[0040]實(shí)施例5:
[0041]傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫吸附測(cè)定和多巴胺介導(dǎo)的電化學(xué)免疫反應(yīng)檢測(cè)硫酸鹽還原菌。100 μ L硫酸鹽還原菌抗體滴加在金電極表面4°C過(guò)夜，用緩沖液清洗三次；加入200 μ L封閉液，室溫下反應(yīng)30min，再用緩沖液清洗三次；再加入硫酸鹽還原菌(11到18CfumL—1)，37V反應(yīng)lh。接著加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的硫酸鹽還原菌抗體，37V反應(yīng)Ih0
[0042]對(duì)于傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，每孔加入100μ L TMB顯色液，室溫下20min,再在每孔加入50 μ Llmol L4H2SO4,終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。，其檢測(cè)范圍為2.0X 102-2.0X 16Cfu mL—1。檢測(cè)限為300cfuml/1,分析靈敏度10cfumL'
[0043]對(duì)于多巴胺介導(dǎo)的電化學(xué)免疫吸附測(cè)定來(lái)說(shuō)，100 μ L生物素標(biāo)記多巴胺工作液加入每孔，室溫下反應(yīng)20min，用緩沖液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，37°C反應(yīng)lh，用緩沖液清洗三次。每孔加入10yL TMB顯色液，室溫下20min，再在每孔加入50 μ Llmol T1H2SO4，終止反應(yīng)進(jìn)行。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。用酶標(biāo)板分析儀分析相關(guān)數(shù)據(jù)。，其檢測(cè)范圍為2.0X lO1-〗.0X 17Cfu mL—1。檢測(cè)限為20cfu mL—1，分析靈敏度1cfu mL'
[0044]其中，生物素標(biāo)記多巴胺步驟為:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽鍵縮合劑(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二異丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反應(yīng) 24h。再加入乙醚(30mL),過(guò)濾白色固體，用硅膠柱色譜純化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg終產(chǎn)物。
[0045]實(shí)施例6:
[0046]傳統(tǒng)的免疫熒光測(cè)定和多巴胺介導(dǎo)的免疫熒光檢測(cè)人體腫瘤壞死因子-α。100 μ L鼠抗腫瘤壞死因子-α抗體滴加在玻璃片表面4°C過(guò)夜，用緩沖液清洗三次；加入200 μ L封閉液，室溫下反應(yīng)30min，再用緩沖液清洗三次；再加入重組的人體腫瘤壞死因子-α (10_14到10_5mol Γ1)，37V反應(yīng)lh。接著加入100 μ L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人體腫瘤壞死因子-α抗體，37°C反應(yīng)lh。
[0047]對(duì)于傳統(tǒng)的免疫熒光測(cè)定來(lái)說(shuō)，每孔加入100 μ L熒光顯色液，室溫下20min，終止反應(yīng)進(jìn)行。用激光掃描共聚焦顯微鏡分析相關(guān)數(shù)據(jù)。其檢測(cè)范圍為2.0X 10_n-2.0X 10_6molL' 檢測(cè)限為 0.9X10_nmol ?Λ 分析靈敏度 7.9 X 10_13mol L'
[0048]對(duì)于多巴胺介導(dǎo)的免疫熒光檢測(cè)定來(lái)說(shuō)，100 μ L生物素標(biāo)記多巴胺工作液加入每孔，室溫下反應(yīng)20min，用緩沖液清洗三次。再每孔加入100 μ L熒光素標(biāo)記親和素，37°C反應(yīng)lh，用緩沖液清洗三次。用激光掃描共聚焦顯微鏡分析相關(guān)數(shù)據(jù)。其檢測(cè)范圍為
1.0X10_12-1.0X10_5mol L—1。檢測(cè)限為 1.9X10_13mol L—1，分析靈敏度 8.9 X 10_14mol L—1。
[0049]其中，生物素標(biāo)記多巴胺步驟為:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽鍵縮合劑(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二異丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反應(yīng) 24h。再加入乙醚(30mL),過(guò)濾白色固體，用硅膠柱色譜純化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg終產(chǎn)物。
【權(quán)利要求】
1.一種基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)，其特征在于:將結(jié)合有特異性的功能分子的多巴胺，即為生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)。
2.按權(quán)利要求1所述的基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)，其特征在于:所述特異性的功能分子可為生物素、主客體分子、重氮鹽、適配體、抗體或組氨酸標(biāo)簽。
3.—種權(quán)利要求1所述的基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域用于檢測(cè)生物分子。
4.按權(quán)利要求3所述的基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)應(yīng)用于免疫吸附測(cè)定、電化學(xué)生物傳感器、熒光顯微鏡技術(shù)或激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)中進(jìn)行生物分子的檢測(cè)。
5.按權(quán)利要求3或4所述的基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)在過(guò)氧化物酶的催化作用下，功能化的多巴胺分子聚合沉淀到生物靶點(diǎn)分子表面，聚合的特異性的功能分子同時(shí)提供大量的活性功能位點(diǎn)。
6.按權(quán)利要求5所述的基于多巴胺的生物激發(fā)信號(hào)放大系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶或氫化酶。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK104165996SQ201310186357
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】萬(wàn)逸, 張盾 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所