利用開(kāi)關(guān)型熒光能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚殘留的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種開(kāi)關(guān)型熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚殘留的方法。以熒光增白劑為熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系的給體，異硫氰酸熒光素為受體，利用異硫氰酸熒光素對(duì)細(xì)胞色素P450同工酶1A2(CYP4501A2)的標(biāo)記作用，造成受體異硫氰酸熒光素的熒光發(fā)生猝滅，即“開(kāi)關(guān)閉合”，并利用CYP4501A2對(duì)多溴聯(lián)苯醚的代謝作用，使熒光增敏，即“開(kāi)關(guān)打開(kāi)”，且熒光增敏量與待測(cè)多溴聯(lián)苯醚的濃度在100~900微克/升范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，方法檢出限為30微克/升，從而建立了一種測(cè)定痕量多溴聯(lián)苯醚的方法。本發(fā)明克服了已有技術(shù)在檢測(cè)時(shí)存在反應(yīng)條件苛刻，儀器昂貴、靈敏度低、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，更好地提高了選擇性和靈敏度，對(duì)于低濃度的多溴聯(lián)苯醚的檢測(cè)更加方便快速。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用開(kāi)關(guān)型熒光能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚殘留的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系與“開(kāi)關(guān)型”熒光探針相結(jié)合測(cè)定痕量多溴聯(lián)苯醚的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多漠聯(lián)苯釀(PolybrominatedDiphenyl Ethers, PBDEs)作為一種阻燃劑被廣泛應(yīng)用于電子、電器、化工、交通、建材、紡織、石油、采礦等領(lǐng)域中。目前PBDEs已經(jīng)在各種環(huán)境介質(zhì)中包括大氣、水體、沉積物、土壤和各種生物體(海洋哺乳動(dòng)物、魚(yú)、鳥(niǎo)和蛋等)和人體(奶、血清和脂肪組織等)中被檢測(cè)出來(lái)，并且最近幾年在世界范圍環(huán)境中其含量呈快速上升趨勢(shì)。相關(guān)研究表明，PBDEs具有發(fā)育毒性、生殖毒性,干擾生物體的內(nèi)分泌等危害,并且部分PBDEs同系物已經(jīng)建議列入全球持久性有機(jī)污染物斯德哥爾摩公約中。由于其持久性和潛在的危害性，人們對(duì)其在環(huán)境中分布、遷移、轉(zhuǎn)化及其生理毒性日益關(guān)注。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外探究多溴聯(lián)苯醚含量主要采用液相色譜法與氣相色譜法，兩者雖靈敏度較高，但反應(yīng)條件苛刻，儀器昂貴、操作時(shí)間長(zhǎng)且前期處理復(fù)雜。因此，發(fā)明快速、準(zhǔn)確、選擇性高的測(cè)定多溴聯(lián)苯醚的方法具有重要意義。而熒光共振能量轉(zhuǎn)移法作為一種新型熒光檢測(cè)技術(shù)，相比于其他熒光方法，具有更高的靈敏度和選擇性。本方法利用其獨(dú)特的檢測(cè)特性，從而建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚的方法。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用熒光光譜法在多溴聯(lián)苯醚的檢測(cè)上尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快速簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性好的檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚的方法。
[0005]本發(fā)明思路:以熒光增白劑作為熒光能量轉(zhuǎn)移的給體，異硫氰酸熒光素作為受體，構(gòu)成性能穩(wěn)定的能量轉(zhuǎn)移體系，熒光增白劑將能量傳遞給異硫氰酸熒光素，使其成為熒光強(qiáng)度更高的超靈敏熒光探針。而細(xì)胞色素P450同工酶1A2(CYP4501A2)可以有效地猝滅受體異硫氰酸熒光素的熒光強(qiáng)度，即“開(kāi)關(guān)閉合”;加入多溴聯(lián)苯醚后，使異硫氰酸熒光素的熒光強(qiáng)度升高，即“開(kāi)關(guān)打開(kāi)”，從而建立檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚的“開(kāi)關(guān)型”熒光法。
[0006]本發(fā)明具體機(jī)理:能量轉(zhuǎn)移體系的受體異硫氰酸熒光素可以標(biāo)記CYP4501A2，造成熒光猝滅，并加入還原型輔酶II (NADPH)為CYP4501A2的代謝發(fā)揮活性提供電子，熒光峰幾乎沒(méi)有波動(dòng)，而向體系中加入不同濃度的多溴聯(lián)苯醚后，CYP4501A2可以代謝多溴聯(lián)苯醚，使受體的熒光強(qiáng)度不同程度的增強(qiáng)，且熒光增敏量與待測(cè)多溴聯(lián)苯醚的濃度在100-900微克/升范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。
[0007]具體步驟如下:
Cl)多溴聯(lián)苯醚混和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:
用移液槍分別準(zhǔn)確移取濃度均為50毫克/升的4-溴聯(lián)苯醚、4，4'- 二溴聯(lián)苯醚、3，3'，4-三溴聯(lián)苯醚、2，2，4，4-三溴聯(lián)苯醚和2，2' ,4,4', 5-五溴聯(lián)苯醚各200微升到1.5毫升的棕色試劑進(jìn)樣瓶中，得到10毫克/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液即多溴聯(lián)苯醚溶液。
[0008](2)檢測(cè)方法:
在9支5毫升的比色管中分別加入500微升1.0X 10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液和200微升l.0XlO—4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液，構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系；再分別加入100微升1.0Χ10-3摩爾/升的CYP4501A2和100微升1.0X 10-3摩爾/升的NADPH，使異硫氰酸熒光素與酶充分結(jié)合，造成熒光猝滅；最后，分別加入50、100、150、200、250、300、350、400、450微升步驟(1)所得的多溴聯(lián)苯醚溶液，用ρΗ=7.6的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度；比色管中多溴聯(lián)苯醚的濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900微克/升；反應(yīng)15分鐘后用熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為330納米，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5納米和3納米。
[0009](3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的繪制:
在9支5毫升的比色管中分別加入500微升1.0X 10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液、200微升1.0X 10_4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液，100微升1.0Χ10_3摩爾/升的CYP4501A2和 100 微升 1.0Χ I(T3摩爾 / 升的NADPH,再分別加入 50、100、150、200、250、300、350、400、450微升步驟(1)所得的多溴聯(lián)苯醚溶液，用ρΗ=7.6的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度；比色管中多溴聯(lián)苯醚的濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900微克/升；反應(yīng)15分鐘后用熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為330納米，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5納米和3納米；多溴聯(lián)苯醚的濃度C在100-900微克/升范圍內(nèi)與熒光猝滅量Λ If呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為=AIf = 1.1694 C-2.7408，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r = 0.9996。
[0010]所述PH=7.6的TriS-HCl緩沖溶液為摩爾濃度為0.10摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷和摩爾濃度為0.20摩爾/升的鹽酸的混合溶液。
[0011]本發(fā)明克服了已有技術(shù)在檢測(cè)時(shí)存在反應(yīng)條件苛刻，儀器昂貴、靈敏度低、操作時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，更好地提高了選擇性，對(duì)于低濃度的多溴聯(lián)苯醚的檢測(cè)更加方便快速。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明實(shí)施例在1.0X 10_4摩爾/升的熒光增白劑，4.0X 10_4摩爾/升的異硫氰酸熒光素，2.0X 10_5摩爾/升的CYP4501A2，2.0X 10_5摩爾/升的NADPH和Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.6)中，不同濃度的多溴聯(lián)苯醚對(duì)異硫氰酸熒光素的熒光猝滅光譜圖。其中a為加入500微升1.0X 10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液、200微升1.0X 10_4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液后異硫氰酸熒光素的熒光光譜；b為a曲線(xiàn)加入100微升1.0X10-3摩爾/升的CYP4501A2和100微升1.0X 10-3摩爾/升的NADPH的熒光猝滅光譜；c~k分別為b曲線(xiàn)加入50、100、150、200、250、300、350、400、450微升的多溴聯(lián)苯醚后的熒光增敏光譜。
[0013]圖2為本發(fā)明實(shí)施例多溴聯(lián)苯醚含量與體系熒光增敏量的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例:
1、多溴聯(lián)苯醚混和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:用移液槍分別準(zhǔn)確移取濃度均為50毫克/升的4-溴聯(lián)苯醚、4，4'- 二溴聯(lián)苯醚、3，3'，4-三溴聯(lián)苯醚、2，2，4，4-三溴聯(lián)苯醚和2，2' ,4,4', 5-五溴聯(lián)苯醚各200微升到1.5毫升的棕色試劑進(jìn)樣瓶中，得到10毫克/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液(多溴聯(lián)苯醚溶液)。
[0015]2、檢測(cè)方法:
在9支5毫升的比色管中分別加入500微升1.0 X 10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液、200微升l.0XlO—4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液，構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系。再分別加入100微升1.0Χ10-3摩爾/升的CYP4501A2和100微升1.0 X 10-3摩爾/升的NADPH，使異硫氰酸熒光素與酶充分結(jié)合，造成熒光猝滅。最后，分別50、100、150、200、250、300、350、400,450微升的步驟(1)所得的多溴聯(lián)苯醚溶液，用ρΗ=7.6的Tris-HCl緩沖溶液(三羥甲基氨基甲烷的摩爾濃度為0.10摩爾/升，鹽酸的摩爾濃度為0.20摩爾/升)定容至刻度；比色管中多溴聯(lián)苯醚的濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900微克/升；反應(yīng)15分鐘后用熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為330納米，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5納米和3納米。
[0016]3、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的繪制:
在9支5毫升的比色管中分別加入500微升1.0X 10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液、200微升1.0X 10_4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液，100微升1.0Χ10_3摩爾/升的CYP4501A2和 100 微升 1.0Χ I(T3摩爾 / 升的NADPH,再分別加入 50、100、150、200、250、300、350、400、450微升步驟(1)所得的多溴聯(lián)苯醚溶液，用ρΗ=7.6的Tris-HCl緩沖溶液(三羥甲基氨基甲烷的摩爾濃度為0.10摩爾/升，鹽酸的摩爾濃度為0.20摩爾/升)定容至刻度。比色管中多溴聯(lián)苯醚的濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900微克/升；反應(yīng)15分鐘后用熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為330納米，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5納米和3納米。多溴 聯(lián)苯醚的濃度C在100-900微克/升范圍內(nèi)與熒光猝滅量(Λ If)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為:Λ If = 1.1694 C_2.7408，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=0.9996。
[0017]4、蔬菜中多溴聯(lián)苯醚含量的檢測(cè):
用于樣品檢測(cè)的蔬菜樣品購(gòu)于超市，將樣品切碎，并使用研缽研碎，冷凍干燥，研磨成粉，供實(shí)驗(yàn)用。稱(chēng)取蔬菜樣品粉末5.000克，用250毫升正己烷-丙酮(體積比1:1)，索式抽提72小時(shí)后，將剩余溶液用二次蒸餾水稀釋到5.00毫升，得到待測(cè)樣品。在5.00毫升的比色管中分別加入500微升1.0X 10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液、200微升1.0X 10_4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液，100微升1.0X 10_3摩爾/升的CYP4501A2,100微升1.0X 10_3摩爾/升的NADPH和10微升待測(cè)樣品，用pH=7.6的Tris-HCl緩沖溶液(三羥甲基氨基甲烷的摩爾濃度為0.10摩爾/升，鹽酸的摩爾濃度為0.20摩爾/升)定容至刻度，充分搖勻后放置反應(yīng)15分鐘，進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)；激發(fā)波長(zhǎng)為330納米，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5納米和3納米。根據(jù)校正曲線(xiàn)計(jì)算出多溴聯(lián)苯醚的濃度C ;計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。
[0018]表1:樣品測(cè)定和加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.一種利用開(kāi)關(guān)型熒光能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚殘留的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)多溴聯(lián)苯醚混和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制: 用移液槍分別準(zhǔn)確移取濃度均為50毫克/升的4-溴聯(lián)苯醚、4，4'- 二溴聯(lián)苯醚、，3，3'，4-三溴聯(lián)苯醚、2，2，4，4-三溴聯(lián)苯醚和2，2' ,4,4', 5-五溴聯(lián)苯醚各200微升到1.5毫升的棕色試劑進(jìn)樣瓶中，得到10毫克/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液即多溴聯(lián)苯醚溶液； (2)檢測(cè)方法: 在9支5毫升的比色管中分別加入500微升1.0X 10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液和，200微升l.0XlO—4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液，構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系；再分別加入100微升1.0X Kr3摩爾/升的細(xì)胞色素P450同工酶1A2即CYP4501A2和100微升，1.0X 10_3摩爾/升的還原型輔酶II即NADPH，使異硫氰酸熒光素與酶充分結(jié)合，造成熒光猝滅；最后，分別加入50、100、150、200、250、300、350、400、450微升步驟(1)所得的多溴聯(lián)苯醚溶液，用pH=7.6的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度；比色管中多溴聯(lián)苯醚的濃度分別為，100、200、300、400、500、600、700、800、900微克/升；反應(yīng)15分鐘后用熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為330納米，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5納米和3納米； (3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的繪制: 在9支5毫升的比色管中分別加入500微升1.0X10_6摩爾/升的熒光增白劑溶液、，200微升1.0X 10_4摩爾/升的異硫氰酸熒光素溶液，100微升1.0X10_3摩爾/升的CYP4501A2和 100 微升 1.0X I(T3摩爾 / 升的NADPH,再分別加入 50、100、150、200、250、300、，350、400、450微升步驟( 1)所得的多溴聯(lián)苯醚溶液，用pH=7.6的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度；比色管中多溴聯(lián)苯 醚的濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900微克/升；反應(yīng)15分鐘后用熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為330納米，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5納米和3納米；多溴聯(lián)苯醚的濃度C在100-900微克/升范圍內(nèi)與熒光猝滅量Λ If呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為=AIf = 1.1694 C-2.7408，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r = 0.9996 ； 所述pH=7.6的Tris-HCl緩沖溶液為摩爾濃度為0.10摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷和摩爾濃度為0.20摩爾/升的鹽酸的混合溶液。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103487417SQ201310395244
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】陶慧林, 徐銘澤, 易忠勝, 張慶軍, 艾芳婷, 陳杵序 申請(qǐng)人:桂林理工大學(xué)