用于檢測(cè)人abcg2基因突變的探針、引物及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針、引物及試劑盒。本發(fā)明針對(duì)ABCG2基因的Q126X位點(diǎn)、Q141K位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針和引物，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR體系，可同時(shí)檢測(cè)ABCG2基因2種突變形式；本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高，10-20拷貝的突變可以檢出；本發(fā)明可直接采用從拭子、新鮮和冷凍的全血、血漿和體液等來(lái)源的人基因組DNA，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)廉價(jià)，臨床應(yīng)用范圍廣；本發(fā)明檢測(cè)特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度快，檢測(cè)過(guò)程只需要90分鐘即可完成。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針、引物及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針、引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]痛風(fēng)，特指急性特征性關(guān)節(jié)炎和慢性痛風(fēng)石疾病，是由單鈉尿酸鹽沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)。痛風(fēng)常伴腹型肥胖、高脂血癥、高血壓、2型糖尿病及心血管病等表現(xiàn)，重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)殘疾和腎功能不全。
[0003]痛風(fēng)分布在世界各地，受種族、飲食、飲酒、職業(yè)、環(huán)境和受教育程度等多因素影響。在我國(guó)，近年來(lái)痛風(fēng)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，我國(guó)普通人群患病率約1.14%，其中臺(tái)灣和青島地區(qū)是痛風(fēng)高發(fā)區(qū)，18歲以上臺(tái)灣土著居民患病率約11.7%。痛風(fēng)的發(fā)生與性別和年齡相關(guān)，多見(jiàn)于中老年人，約占90%，發(fā)病高峰年齡為40~50歲，男女比例約為20:1。痛風(fēng)患者由于關(guān)節(jié)受累，疼痛難忍，1-2個(gè)月都無(wú)法消除，無(wú)法正常工作，嚴(yán)重的患者甚至?xí)斐缮眢w殘疾，喪失勞動(dòng)力，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。并且近年來(lái)隨著人們生活水平的提高，高蛋白飲食習(xí)慣以及抽煙喝酒等不良生活習(xí)慣造成了痛風(fēng)的發(fā)病年齡年輕化的趨勢(shì)。
[0004]痛風(fēng)的發(fā)生與遺傳有一定相關(guān)性。Hirotaka Matsuo等日本科學(xué)家實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與尿酸排出有關(guān)的基因ABCG2發(fā)生變異，不到29歲的年輕人患上痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)大幅升高。通過(guò)檢測(cè)ABCG2基因的變異情況，評(píng)估患痛風(fēng)這種疾病的風(fēng)險(xiǎn)程度，有效預(yù)防痛風(fēng)發(fā)作，引起個(gè)體對(duì)自己健康的重視，提醒并激勵(lì)個(gè)體改變不良的生活方式和行為，采取措施消除各種影響健康的不利因素，以達(dá)到改善健康狀況的目的，對(duì)提高國(guó)人健康水平都具有非常重要的意義。
`[0005]ABCG2 (ATP-binding cassette sub-family G member2)為 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族G亞家族第2成員，是一種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在人的正常細(xì)胞和腫瘤組織中均有表達(dá)，具有抑制消化道吸收某些外源性物質(zhì)，參與形成血腦、胎血屏障等生理功能。同時(shí)ABCG2也是新的藥物排出泵，是腫瘤多藥耐藥的重要機(jī)制之一。ABCG2基因的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)可能影響ABCG2蛋白的表達(dá)與功能,與疾病的易感性及藥動(dòng)學(xué)等相關(guān)。
[0006]人類(lèi)ABCG2基因位于4q22~23，編碼655個(gè)氨基酸殘基。ABCG2全長(zhǎng)66kb，由16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子為60~332bp不等。研究表明，其126位氨基酸如果從谷酰胺(gin Q)突變?yōu)槠渌被?X)，即Q126X，其第141位氨基酸如果從谷酰胺(ginQ)突變?yōu)橘?lài)氨酸(lys K)，即Q141K，就會(huì)造成ABCG2蛋白的功能失調(diào)，從而造成機(jī)體高尿酸血癥，從而引起痛風(fēng)。所以檢測(cè)ABCG2基因Q126X，Q141K突變可以為痛風(fēng)的早期診斷提供參考依據(jù)。
[0007]目前檢測(cè)ABCG2突變的方法還是DNA直接測(cè)序法，然而直接測(cè)序法靈敏度低，只有20-30%，檢測(cè)步驟繁瑣，效率低下，至少需要2-3天時(shí)間才能出結(jié)果；并且如果樣本基因組DNA含量稀少時(shí)，直接測(cè)序法會(huì)導(dǎo)致大量的漏檢和假陰性。所以特別要一種高靈敏度和高特異性的檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)基因突變的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針。
[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的引物。
[0010]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的試劑盒。[0011]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0012]在本發(fā)明的一方面，提供一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針，該探針是針對(duì)ABCG2基因的Q126X位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為:
[0013]126P:5’ -FAM-AGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAA-BHQ1，如 SEQ ID N0.1 所示或其互補(bǔ)鏈。
[0014]此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針，該探針是針對(duì)ABCG2基因的Q141K位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為:
[0015]141P:5’ -FAM-TAAGGATGATGTTGTGATGGGCACT-BHQUn SEQ ID N0.2 所示或其互補(bǔ)鏈。
[0016]此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針，包括以上兩種探針。
[0017]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的引物，該引物是針對(duì)ABCG2基因的Q126X位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為:
[0018]126F: CTGGAGATGTTCTGATAAATGjn SEQ ID N0.3 所示；
[0019]126CR:GCAAACCCACTAATACTTACTT，如 SEQ ID N0.4 所示；
[0020]126TR:GCAAACCCACTAATACTTACTTA，如 SEQ ID N0.5 所示。
[0021]此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的引物，該引物是針對(duì)ABCG2基因的Q141K位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為:
[0022]141F: TTGCCTTAAGGATGATGTTGjn SEQ ID N0.6 所示；
[0023]14IAR: CAGAGCTGCTGAGAACTTjn SEQ ID N0.7 所示；
[0024]141CR:CAGAGCTGCTGAGAACT，如 SEQ ID N0.8 所示。
[0025]此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的引物，包括以上兩種引物。
[0026]本發(fā)明用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的PCR引物和探針設(shè)計(jì)方法，具體為:在基因高度同源和保守的區(qū)域設(shè)計(jì)正向PCR通用引物及探針；在變異基因的位置設(shè)計(jì)與變異基因完全互補(bǔ)的反向引物。
[0027]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、反向突變型特異性引物、探針，所述反向突變型特異性引物為如上所述的126F、126CR引物對(duì)，以及如上所述的126F、126TR引物對(duì)；所述探針為如上所述的126P探針。
[0028]此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、反向突變型特異性引物、探針，所述反向突變型特異性引物為如上所述的141F、141AR引物對(duì)，以及如上所述的141F、141CR引物對(duì)；所述探針為如上所述的141P探針。
[0029]此外，本發(fā)明提供另一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，包括:如上所述的126F、126CR引物對(duì)，如上所述的126F、126TR引物對(duì)，如上所述的141F、141AR引物對(duì)，以及如上所述的141F、141CR引物對(duì)；還包括:如上所述的126P探針，以及如上所述的141P探針。
[0030]所述反向突變型特異性引物對(duì)于野生型基因的擴(kuò)增存在阻礙及滯后，而對(duì)于突變型基因模板則可以正常擴(kuò)增。本發(fā)明采用AS-PCR (等位基因特異性-聚合酶鏈反應(yīng))的原理參見(jiàn)圖1，在基因高度同源和保守區(qū)設(shè)計(jì)正向PCR通用引物及探針，在變異基因的位置(突變堿基)設(shè)計(jì)與變異基因完全互補(bǔ)的反向引物(突變引物，即反向突變型特異性引物)，該突變引物對(duì)于野生型基因的擴(kuò)增存在阻礙及滯后(即圖1中的野生型不擴(kuò)增)，而對(duì)于突變型基因模板則可以正常擴(kuò)增(即圖1中的突變型擴(kuò)增)。
[0031]在本發(fā)明的另一方面，提供上述探針在制備診斷痛風(fēng)疾病的試劑盒中的應(yīng)用。
[0032]在本發(fā)明的另一方面，提供上述引物在制備診斷痛風(fēng)疾病的試劑盒中的應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明可與現(xiàn)行用于臨床檢驗(yàn)的其它技術(shù)聯(lián)合使用，這些技術(shù)包括:實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析；本發(fā)明適用于人疾病相關(guān)致病基因的檢測(cè)，致病基因包括但不限于ABCG2基因126密碼子的突變(突變類(lèi)型為Q126X)、ABCG2基因141密碼子的突變(突變類(lèi)型為Q141K)等。
[0034]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0035](I)本發(fā)明建 立了實(shí)時(shí)熒光PCR體系，可同時(shí)檢測(cè)ABCG2基因2種突變形式；
[0036](2)檢測(cè)靈敏度高，10-20拷貝的突變可以檢出；
[0037](3)可直接采用從拭子、新鮮和冷凍的全血、血漿和體液等來(lái)源的人基因組DNA，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)廉價(jià)，臨床應(yīng)用范圍廣；
[0038](4)檢測(cè)速度快，檢測(cè)過(guò)程只需要90分鐘即可完成，與直接測(cè)序法相比，本發(fā)明可以在90分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致率100%，但實(shí)驗(yàn)時(shí)間至少節(jié)省了 2-3天；
[0039](5)檢測(cè)特異性強(qiáng)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，用本發(fā)明的引物和探針獲得的ABCG突變位點(diǎn)與直接測(cè)序法獲得的突變位點(diǎn)一致，檢測(cè)特異性強(qiáng)。在今后通風(fēng)病的預(yù)防、診斷中有廣泛的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1為本發(fā)明中AS-PCR的技術(shù)原理示意圖。
[0041]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中ABCG2 126T擴(kuò)增曲線(10000-10拷貝)示意圖。
[0042]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中ABCG2 141A擴(kuò)增曲線(10000-10拷貝)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0044]實(shí)施例1
[0045]1、人基因組DNA提取:采用博大泰克細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒(貨號(hào)DP1091)從拭子、新鮮和冷凍的全血、血漿和體液等來(lái)源的樣本中獲取人基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)確認(rèn)DNA抽提質(zhì)量和濃度。-70攝氏度低溫冰箱保存。
[0046]2、ABCG2特異性引物和探針的合成:根據(jù)人ABCG2基因外顯子4和外顯子5突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩條探針，5’端標(biāo)記FAM(綠色熒光)，3’端標(biāo)記BHQ-1淬滅基團(tuán)，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成和標(biāo)記。探針序列及標(biāo)記如下:
[0047]126P:5’ -FAM-AGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAA-BHQl (如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0048]141P:5，-FAM-TAAGGATGATGTTGTGATGGGCACT-BHQ1 (如 SEQ ID N0.2 所示)；
[0049]PCR引物用PRMER5程序設(shè)計(jì)，Q126X位點(diǎn)序列引物如下:
[0050]126F: CTGGAGATGTTCTGATAAATG (如 SEQ ID N0.3 所示)；
[0051]126CR: GCAAACCCACTAATACTTACTT (如 SEQ ID N0.4 所示)；
[0052]126TR: GCAAACCCACTAATACTTACTTA (如 SEQ ID N0.5 所示)；
[0053]Q141K位點(diǎn)序列引物如下:
[0054]141F: TTGCCTTAAGGATGATGTTG (如 SEQ ID N0.6 所示)；
[0055]141AR: CAGAGCTGCTGAGAACTT (如 SEQ ID N0.7 所示)；
[0056]141 CR: CAGAGCTGCTGAGAACT (如 SEQ ID N0.8 所示)；
[0057]上述引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
[0058]3、熒光PCR反應(yīng):以基因工程重`組質(zhì)粒檢測(cè)本發(fā)明，以Q126X突變型為檢測(cè)對(duì)象。經(jīng)基因工程構(gòu)建的帶有ABCG基因的質(zhì)粒作為檢測(cè)對(duì)象，質(zhì)粒pDJ為帶有Q126X和Q141K雙突變ABCG基因的質(zhì)粒，質(zhì)粒pABCG為帶有野生型ABCG基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒溶解在TE緩沖液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，PH=8.0)中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量和濃度，計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)，用TE緩沖液梯度稀釋獲得10000、1000、100、10拷貝/ul的pDJ和pABCG質(zhì)粒溶液，然后作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),使用2XGoldernStar Taq Master Mix (購(gòu)自康為世紀(jì)，含0.05U/μ ITaq酶、0.5mM dNTP、PCR緩沖液(含Mg2+)及10%甘油)及上述引物、探針配制20 μ IPCR反應(yīng)體系，每個(gè)樣本共計(jì)4個(gè)反應(yīng)，注意各個(gè)反應(yīng)所取DNA模板量必須一樣，反應(yīng)體系具體如下:
[0059]126C:
[0060]
成分體積
模板(質(zhì)粒)--Π
2XG0LDSTART Taq Master Mix 10 μ I
126F、126CR (引物)1-5pMol
126P (探針)1-3pMol
ddH20至 20ul
[0061]126T:
[0062]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的探針，其特征在于，該探針是針對(duì)ABCG2基因的Q126X位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為: 126P:5’ -FAM-AGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAA-BHQ1，如 SEQ ID N0.1 所示或其互補(bǔ)鏈；和/或 該探針是針對(duì)ABCG2基因的Q141K位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為:
141P:5’ -FAM-TAAGGATGATGTTGTGATGGGCACT-BHQ1，如 SEQ ID N0.2 所示或其互補(bǔ)鏈。
2.用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的引物，其特征在于，該引物是針對(duì)ABCG2基因的Q126X位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為:
126F: CTGGAGATGTTCTGATAAATGjn SEQ ID N0.3 所示；
126CR:GCAAACCCACTAATACTTACTT，如 SEQ ID N0.4 所示；
126TR:GCAAACCCACTAATACTTACTTA，如 SEQ ID N0.5 所示；和 / 或 該引物是針對(duì)ABCG2基因的Q141K位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其序列為:
141F: TTGCCTTAAGGATGATGTTGjn SEQ ID N0.6 所示；
14IAR: CAGAGCTGCTGAGAACTTjn SEQ ID N0.7 所示；
141CR:CAGAGCTGCTGAGAACT，如 SEQ ID N0.8 所示。
3.一種用于檢測(cè)人ABCG2基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、反向突變型特異性`引物、探針，其特征在于:所述反向突變型特異性引物為如權(quán)利要求2所述的126F、126CR引物對(duì)，以及如權(quán)利要求2所述的126F、126TR引物對(duì)；所述探針為如權(quán)利要求1所述的126P探針；和/或 所述反向突變型特異性引物為如權(quán)利要求2所述的141F、141AR引物對(duì)，以及如權(quán)利要求2所述的141FU41CR引物對(duì)；所述探針為如權(quán)利要求1所述的141P探針。
4.如權(quán)利要求1所述的探針在制備診斷痛風(fēng)疾病的試劑盒中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的引物在制備診斷痛風(fēng)疾病的試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103820545SQ201410047351
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】蔡麗君, 謝彩霞, 羅鵬, 沈偉強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海鼎晶生物醫(yī)藥科技有限公司