一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光免疫試劑盒，包括有用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG、陽(yáng)性對(duì)照樣品、固定液和PBS洗液；所述的檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體，是用氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的PCV2Cap蛋白抗原免疫小鼠制備的。本發(fā)明所制備的用于檢測(cè)PCV2的試劑盒內(nèi)主要成分為小鼠抗豬圓環(huán)病毒2型單因子血清抗體，是將氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的抗原免疫小鼠制備的，制備出的抗體能夠與PCV2發(fā)生特異性反應(yīng)。以此單因子血清為基礎(chǔ)構(gòu)建的豬圓環(huán)病毒2型熒光免疫試劑盒可檢測(cè)臨床上PCV2感染豬病料組織中的抗原，判定是否感染PCV2，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好且檢測(cè)速度快。
【專利說(shuō)明】—種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光免疫試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于家畜病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]1991年加拿大John Harding報(bào)道了斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS),后經(jīng)廣泛深入的調(diào)查和研究，于1998年證實(shí)豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus, PCV)為主要病原?，F(xiàn)有研究表明，豬圓環(huán)病毒病(Porcine Circovirus Disease, PCVD)是由PCV2感染而引起的一種臨床癥狀為漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難急促、貧血、腹瀉、黃疸、間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)炎及腎炎，主要侵害斷奶仔豬，與近年來(lái)發(fā)生的PMWS、豬皮炎與腎炎綜合征(Porcine Dermatitis and NephropathySyndrome, FONS)、豬呼吸道綜合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)、A2 型先天性振顫(Congenital Tremor, CT)、豬增生性和壞死性肺炎(Porcine Proliferativeand Necrotizing Pneumonia, PNP)、繁殖障礙等疾病都有密切相關(guān)。PCV2的危害在于能夠使感染豬只的免疫功能受到損害，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，并經(jīng)常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)，易被忽視。由于PCV2感染使免疫系統(tǒng)受到損害，容易繼發(fā)或并發(fā)其它病原體，使病情加重，并造成更大危害。本病呈世界性流行，自2000年證實(shí)我國(guó)存在此病以來(lái)，現(xiàn)已在我國(guó)豬群中普遍存在，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]豬圓環(huán)病毒(PCV)在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是已知的最小的動(dòng)物病毒之一。病毒粒子直徑約17nm，呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜。PCV具有兩個(gè)基因型，即PCV1、PCV2，基因組大小約為1.76kb，含有2個(gè)主要閱讀框架，其中ORFl基因產(chǎn)物與病毒復(fù)制酶相關(guān)(R印)，0RF2基因產(chǎn)物是構(gòu)成病毒衣殼蛋白(Cap)成分。PCVl是由Tischer等1974年首次在PK15細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)，對(duì)豬無(wú)致病性。目前PCV2的檢測(cè)主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)抗體檢測(cè)試劑盒、原位雜交(ISH)、免疫組織化學(xué)(IHC)以及本動(dòng)物回歸等方法進(jìn)行了鑒別診斷。其中PCR和ISH需要明確且通用的核酸序列進(jìn)行鑒別，對(duì)于實(shí)驗(yàn)者操作技術(shù)要求高且易出現(xiàn)假陽(yáng)性；IHC對(duì)于操作者病理切片技術(shù)要求較高，檢測(cè)程序相對(duì)繁瑣；而動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)需要飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物待發(fā)病觀察臨床癥狀用于鑒別，因此診斷耗時(shí)較長(zhǎng)且成本較高；ELISA抗體檢測(cè)試劑盒只能檢測(cè)PCV2抗體，無(wú)法確定豬體是否感染有PCV2。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光免疫試劑盒，可以更靈敏特異的檢測(cè)到PCV2病毒，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明的熒光免疫試劑盒，包括有用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG、陽(yáng)性對(duì)照樣品、固定液和PBS洗液；所述的檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體，是用氨基酸序列為SEQ ID NO:1的PCV2Cap蛋白抗原免疫小鼠制備的。[0006]本發(fā)明的熒光免疫試劑盒，是有如下的組分構(gòu)成的:
[0007]I)用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體；
[0008]2) 二抗:FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG ；
[0009]3)陽(yáng)性對(duì)照樣品:保藏編號(hào)為CGMCC N0.7707的PCV2SD株；
[0010]4)固定液:按丙酮與甲醇體積比1:1配置固定液；
[0011]5) PBS 洗液:磷酸鹽緩沖液，按 Nacl8.0g ；Kcl0.2g ；Na2HP043.58g ；KH2PO40.24g 定容至1L。
其中豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus2)毒株P(guān)CV2SD株，已于2013年5月31日保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7707。
[0012]上述的用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體，其具體制備方法如下:將序列為SEQ IDNO: 2的PCV2Cap蛋白基因插入表達(dá)載體PET_28a中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒PET-0RF2 ;通過(guò)轉(zhuǎn)化和IPTG誘導(dǎo)BL21宿主菌表達(dá)His-Cap重組融合蛋白；對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行純化，混合免疫佐劑免疫BALB/C小鼠，收集小鼠血清制成單因子血清抗體。
[0013]本發(fā)明所制備的用于檢測(cè)PCV2的試劑盒內(nèi)主要成分為小鼠抗豬圓環(huán)病毒2型單因子血清抗體，是將氨基酸序列為SEQ ID NO:1的抗原免疫小鼠制備的，制備出的抗體能夠與PCV2發(fā)生特異性反應(yīng)。以此單因子血清為基礎(chǔ)構(gòu)建的豬圓環(huán)病毒2型熒光免疫試劑盒可檢測(cè)臨床上PCV2感染豬病料組織中的抗原，判定是否感染PCV2，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好且檢測(cè)速度快；與以往的PCR、ELISA、ISH、IHC及動(dòng)物回歸試驗(yàn)診斷方法相比，利用該試劑盒通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)技術(shù)檢測(cè)更方便、更準(zhǔn)確。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，本發(fā)明所用到的化學(xué)藥品或試齊U，可以根據(jù)其功能選用已有的其它類型的產(chǎn)品，而不僅限于實(shí)施例的具體記載。對(duì)于實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0015](一)用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體(一抗)的制備
[0016]1、氨基酸序列為SEQ ID NO:2的PCV2的Cap蛋白的制備
[0017]根據(jù)PCV20RF2基因兩端的一段序列與表達(dá)性載體PET_28a的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì) PCV20RF2 的特異性引物 PCV20RF2-F:5' -GGG GGA TCC ATG ACG TAT CCA AGG AGGCGT-3' (WATBamH I 酶切位點(diǎn))，PCV20RF2-R:5' -GGG AAG CTT TAA GGT TTT AAGTGG CTT GTC-3'(加入了 Hind III酶切位點(diǎn))。以 PCV2SD 株(CGMCC N0.7707)病毒液提取的DNA為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為702bp的目的基因序列，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增，并用DNA純化回收試劑盒回收目的基因，同時(shí)將目的基因與載體PET-28a雙酶切并連接獲得PET-0RF2重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒按常規(guī)方法轉(zhuǎn)入表達(dá)性大腸桿菌BL21宿主菌，挑取單個(gè)克隆，酶切法鑒定陽(yáng)性克隆，搖菌，測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ IDNO: 2，其翻譯的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1 ;將此序列經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)其為PCV2新的基因序列，與已知的4株P(guān)CV2序列氨基酸同源性在85.5?93.2%。
[0018]為了排除此新的等位基因是由于擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的誤差，進(jìn)行了多次擴(kuò)增和測(cè)序，證明陽(yáng)性對(duì)照菌PCV2SD株中擴(kuò)增出的表達(dá)PCV2的Cap蛋白基因?yàn)樾碌牡任换颉?br> [0019]2、用氨基酸序列為SEQ ID NO:2的Cap抗原制備單因子血清抗體(一抗)
[0020]將測(cè)序結(jié)果正確的單個(gè)克隆重組質(zhì)粒PET-0RF2轉(zhuǎn)化的表達(dá)性BL21宿主菌，接種于5ml含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB細(xì)菌培養(yǎng)基，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日取出Iml培養(yǎng)物接種于120ml的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)2.5h后，菌液搖至半透明半渾濁狀態(tài)，吸光光度法測(cè)得0D_=0.6?0.8，在誘導(dǎo)前先取IOml作為誘導(dǎo)前對(duì)照，并將振搖溫度變?yōu)?0°C加IPTG (終濃度為1.0mmol/L)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4h收集IOml菌液，以誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)化PET載體的菌液作為空白對(duì)照，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化PET載體的菌液作為空載體對(duì)照。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液取出，離心棄上清，再用0.5mllXPBS重懸菌體，超聲波裂解破碎細(xì)菌后，按1:1加2 X上樣Buffer煮沸l(wèi)Omin，離心取上清，上清用12%SDS-PAGE電泳鑒定分析獲得約27?28kDa的目的蛋白，利用His標(biāo)簽純化試劑盒按規(guī)定操作對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。將純化好的His-Cap目的蛋白用分光光度法定量(1.05mg/ml)加等量的弗氏完全佐劑，頸部皮下注射10只BALB/C小鼠，每只0.2ml (約105 μ g/只),2周后用含弗氏不完全佐劑的Cap蛋白抗原背部皮下免疫第二次，0.2ml/只，再經(jīng)2周后第三次免疫(方法同第二次)，其中4只未免疫抗原的BALB/C小鼠作為陰性對(duì)照組。第三次免疫后10d，心臟采血致死，析出的免疫血清置-20°C保存。
[0021]3、針對(duì)PCV2SD株Cap蛋白制備的單因子血清的敏感性和特異性鑒定
[0022]將PCV2SD分離株病毒液(106 25TCID5(l/ml)與剛消化好的PK15細(xì)胞懸液按1:9體積比混合接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(Iml/孔)，維持72h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去上清液，用I XPBS洗一遍，丙酮:甲醇(1:1)固定液于_20°C固定30min，I XPBS洗3遍，將小鼠血清分別用I XPBS按1:50、1:100、1:200、1:500作四個(gè)稀釋度加到固定好的PK15細(xì)胞上，37。。孵育90min，lXPBS洗3遍，再加1:200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma公司)37°C孵育60min, I XPBS洗3次，棄去洗滌液，再將24孔板中每個(gè)孔加一滴50%的甘油，在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒定結(jié)果在1:100稀釋度時(shí)效果較好。利用針對(duì)PCV2SD株(陽(yáng)性對(duì)照株)Cap蛋白制備的單因子血清通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)(IFA)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的其它4株P(guān)CV2:SDIdOl 株(HM535640)、AH05 株(FJ644556)、GXWM 株(EF675241)及 SH03733 株(GQ358998)進(jìn)行區(qū)分鑒定，結(jié)果與該4株P(guān)CV2均反應(yīng)出現(xiàn)特異性綠色熒光。與以報(bào)道的PCV2制備的Cap蛋白制備的單因子血清相比，本發(fā)明PCV2SD株Cap蛋白制備的單因子血清抗體(一抗)敏感性和特異性高都有明顯提高(P ( 0.05)，這可能有本發(fā)明的PCV2Cap蛋白氨基酸序列與已報(bào)道的蛋白的差異造成的。
[0023](二)用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光免疫試劑盒構(gòu)建及其敏感性與特異性試驗(yàn)
[0024]1、用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型熒光免疫試劑盒構(gòu)建
[0025]I) 一抗:小鼠抗PCV2SD株Cap蛋白單因子血清，為本試劑盒的關(guān)鍵組成成分，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離到的PCV2SD株制備。
[0026]2) 二抗:FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,購(gòu)自sigma公司。
[0027]3)陽(yáng)性對(duì)照毒:保藏編號(hào)為CGMCC N0.7707的PCV2SD株；
[0028]4)固定液:按丙酮與甲醇體積比1:1配置固定液，密封保存，用前放于_20°C冰箱保存。
[0029]5)洗液:磷酸鹽緩沖液(PBS)，按 Nacl 8g ；Kcl 0.2g ；Na2HPO4 3.58g ；KH2PO40.24g定容至IL0[0030]2、用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型熒光免疫試劑盒靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)I) IFA和PCR對(duì)比檢測(cè)
[0031]為了分析本發(fā)明檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗原的熒光免疫試劑盒的敏感性和特異性，分別應(yīng)用IFA和PCR方法和江蘇、浙江、安徽、山東及福建等地豬場(chǎng)送檢的103份臨床診斷疑似PCV2感染的組織樣品進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)。IFA和PCR檢測(cè)不同地區(qū)來(lái)源組織樣品結(jié)果
見(jiàn)下表。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光免疫試劑盒，包括有用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG、陽(yáng)性對(duì)照樣品、固定液和PBS洗液；所述的檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體，是用序列為氨基酸序列為SEQ ID N0:1的PCV2Cap蛋白抗原免疫小鼠制備的。
2.權(quán)利要求1所述的熒光免疫試劑盒，其構(gòu)成如下: 1)用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體； 2)二抗:FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG ； 3)陽(yáng)性對(duì)照樣品:PCV2病毒株； 4)固定液:按丙酮與甲醇體積比1:1配置固定液；
5)PBS 洗液:磷酸鹽緩沖液，按 Nacl 8.0g ；Kcl 0.2g ；Na2HP04 3.58g ；KH2PO4 0.24g 定容至1L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的用于檢測(cè)PCV2的單因子血清抗體，其制備方法如下:將序列為SEQ ID N0:2的PCV2Cap蛋白基因插入表達(dá)載體PET-28a中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒PET-0RF2 ;通過(guò)轉(zhuǎn)化和IPTG誘導(dǎo)BL21宿主菌表達(dá)His-Cap重組融合蛋白；對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行純化，混合免疫佐劑免疫BALB/C小鼠，收集小鼠血清制成單因子血清抗體。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的PCV2病毒株，為保藏編號(hào)為CGMCCN0.7707 的 PCV2SD 株。.
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103472225SQ201310404814
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】張恒, 鄒敏, 范根成, 劉蕾, 徐保娟, 胡瀟, 申洪銀, 陶曉珊 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司