基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析的潛在指紋成像的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析的潛在指紋成像的方法，包括：將指印按在電極基底上，得到指印樣本；往所述指印樣本的指印上加入待檢測(cè)目標(biāo)代謝物的抗體溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后用緩沖液進(jìn)行沖洗；將所述的指印樣本吹干，然后向指印上加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；或者將所述的指印樣本吹干，然后向指印上加入生物素標(biāo)記的二抗，孵育一段時(shí)間后沖洗、吹干指印樣本，再向指印上加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育；孵育后，用所述的緩沖液沖洗指印樣本，吹干后制備得到工作電極，然后通過電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集指紋圖像。本發(fā)明的方法在獲取指紋圖像的同時(shí)可實(shí)現(xiàn)潛在指紋中目標(biāo)代謝物的特異性高靈敏檢測(cè)。
【專利說明】基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析的潛在指紋成像的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)和指紋檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析的潛在指紋成像的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]潛在指紋是經(jīng)身體自然分泌物(如汗液)轉(zhuǎn)移形成的指紋紋路，目視不易發(fā)現(xiàn)，是案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)中最常見的指紋。據(jù)我國(guó)各地不完全統(tǒng)計(jì)，警方偵破的刑事案件中，利用指紋破案占七成以上，并且比例正在逐年上升。通常情況下，指紋是犯罪分子在現(xiàn)場(chǎng)留下的最直接物證，所以，研究潛在指紋的顯現(xiàn)技術(shù)，是提高指紋物證的采取率和利用率的重要環(huán)節(jié)。
[0003]現(xiàn)代指紋學(xué)的發(fā)展已經(jīng)具有上百年的歷史，按照顯現(xiàn)原理的不同，傳統(tǒng)的潛在指紋顯現(xiàn)方法主要分為三類:光學(xué)顯現(xiàn)法、化學(xué)顯現(xiàn)法以及物理吸附法。其基本原理是使用一種光線或物質(zhì)作用于指紋印痕的汗液物質(zhì)，使不能看見的潛在指紋變?yōu)榭梢姷摹０l(fā)展至今，指紋檢測(cè)不僅在法醫(yī)鑒定、個(gè)體識(shí)別方面起著重要作用，同時(shí)廣泛應(yīng)用于日常生活中的安全檢驗(yàn)、訪問控制、個(gè)人認(rèn)證等領(lǐng)域。近年來隨著分析科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)指紋的研究已不僅僅停留在利用傳統(tǒng)物理或化學(xué)手段對(duì)其形貌進(jìn)行觀察，同時(shí)更加致力于發(fā)展各種新興技術(shù)如質(zhì)譜成像、紅外/拉曼成像、掃描電化學(xué)顯微鏡以及熒光免疫成像等，對(duì)指紋中的成分進(jìn)行分析檢測(cè)，從而發(fā)掘出更多有價(jià)值的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)信息。比如，恐怖分子是否接觸過爆炸物、一個(gè)人是否具有吸煙的習(xí)慣，科學(xué)家都可以通過指紋檢測(cè)來獲取相關(guān)信息。
[0004]盡管指紋顯現(xiàn)技術(shù)在刑偵及分析科學(xué)中發(fā)揮著重大作用，但是目前在指紋顯現(xiàn)領(lǐng)域中仍然存在諸多困難。例如，在傳統(tǒng)方法中，大多要引用一種外源物質(zhì)來對(duì)潛在指紋進(jìn)行顯現(xiàn)，處理過程較為繁瑣復(fù)雜，同時(shí)對(duì)樣本具有破壞性。目前廣泛使用的煙熏法和刷粉法中采用的小粒度粉末對(duì)技術(shù)人員存在一定的身體損傷。而新興的指紋技術(shù)如質(zhì)譜成像法和紅外/拉曼成像法，則需要用到昂貴的大型儀器和專業(yè)的操作知識(shí)，不利于普及。因此目前仍然需要一種簡(jiǎn)單、快速、適用范圍廣的方法對(duì)潛在指紋進(jìn)行顯現(xiàn)。
[0005]電化學(xué)發(fā)光是電化學(xué)反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的產(chǎn)物。由于電化學(xué)發(fā)光是在電極表面產(chǎn)生的，因此可以反應(yīng)出電極反應(yīng)活性，并且具有背景低、時(shí)空可控等優(yōu)點(diǎn)。因此，電化學(xué)發(fā)光被廣泛用于成像研究。電化學(xué)發(fā)光成像是一種全新的成像技術(shù)，兼有化學(xué)發(fā)光成像和電化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)提供光學(xué)圖像與電化學(xué)兩種信號(hào)，進(jìn)行高靈敏高通量檢測(cè)。目前并未有利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析來對(duì)指紋進(jìn)行檢測(cè)和成像的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析的潛在指紋成像的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏且發(fā)光強(qiáng)度高，能夠?qū)χ讣y進(jìn)行清晰的成像。
[0007]一種基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析的潛在指紋成像的方法，包括:
[0008](I)將指印轉(zhuǎn)移到電極基底上，得到指印樣本；
[0009](2)往所述指印樣本的指印上加入手指代謝物的抗體溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后用緩沖液進(jìn)行沖洗；
[0010](3)將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行
孵育；
[0011]或者將所述的經(jīng)(2)處理后的指印樣本干燥，然后向指印上加入生物素標(biāo)記的二抗，孵育一段時(shí)間后沖洗、吹干指印樣本，再向指印上加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育；
[0012](4)孵育后，用所述的緩沖液沖洗指印樣本，干燥后制備得到工作電極，然后通過電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集指紋圖像。
[0013]人類指紋皮膚表面布滿汗腺，觸物留痕。一般來說留在客體表面的指紋物質(zhì)較少，一般為0.llmg，其中99%為水分，會(huì)迅速蒸發(fā)掉；固體物質(zhì)只占1%，其中2/3是有機(jī)物質(zhì)，如:氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸、尿素等；剩余1/3是無機(jī)物質(zhì)。首先選擇手指代謝物的抗體(一抗)，以及辣根過氧化氫酶(HRP)標(biāo)記的二抗或者生物素標(biāo)記的二抗、鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物，通過抗體與手指代謝物的特異性免疫反應(yīng)，使HRP間接標(biāo)記到指紋上，然后通過電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，即可顯示出指紋紋路。
[0014]所述的電極基底為聚苯乙烯鍍金片，也可以為玻碳電極、鉬電極等。
[0015]步驟(1)中，所述的指印為血指印或汗?jié)撝赣　?br> [0016]當(dāng)所述的指印為血指印時(shí)，所述的手指代謝物具體可以為IgG。
[0017]當(dāng)所述的指 印為汗?jié)撝赣r(shí)，所述的手指代謝物為表皮生長(zhǎng)因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽 Dermcidin0
[0018]其中，IgG的抗體為羊抗人IgG，具體可購(gòu)自生工生物工程有限公司，貨號(hào)為DAC1011 ;表皮生長(zhǎng)因子抗體具體可購(gòu)自生工生物工程有限公司，貨號(hào)為DA1709 ;溶菌酶抗體可購(gòu)自生工生物工程有限公司，貨號(hào)為DA2322 ;人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體可購(gòu)自百奇生物科技有限公司，貨號(hào)AP6 718b。
[0019]所述抗體溶液的濃度為0.05~0.2mg/mL,優(yōu)選的，所述抗體溶液的濃度為0.1mg/mL?？贵w溶液的濃度過高不僅浪費(fèi)試劑，還會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合，或顯色背景重，而濃度過低，則會(huì)導(dǎo)致抗原與抗體的反應(yīng)不完全，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度弱，從而影響指紋成像效果。
[0020]為使反應(yīng)充分進(jìn)行，加入抗體溶液后，所述孵育的時(shí)間為25~35min,優(yōu)選為30mino
[0021]所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗的濃度為0.04~0.06mg/mL，優(yōu)選為0.05mg/mL，二抗?jié)舛冗^高會(huì)增加非特異性結(jié)合，且容易造成發(fā)光強(qiáng)度過強(qiáng)，二抗?jié)舛冗^低則導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度弱，指紋成像不清晰。
[0022]為使反應(yīng)充分進(jìn)行，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗后，所述孵育的時(shí)間為25~35min,優(yōu)選為 30min。
[0023]本申請(qǐng)中，通過兩步法(經(jīng)手指代謝物的抗體溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測(cè))或三步法(經(jīng)手指代謝物的抗體溶液、生物素標(biāo)記的二抗檢測(cè)和鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶)均可顯現(xiàn)指紋圖像，但對(duì)于表皮生長(zhǎng)因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermcidin，三步法的效果更好，因此，以汗?jié)撝赣≈械谋砥どL(zhǎng)因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermcidin為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，優(yōu)選采用三步法。
[0024]三步法中，所述生物素標(biāo)記的二抗的濃度為0.005~0.02mg/mL,優(yōu)選為0.01mg/mL。所述鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶的濃度為3~6 μ g/mL,優(yōu)選為5 μ g/mL。采用上述濃度，得到的指紋圖像清晰，發(fā)光強(qiáng)度高。
[0025]為使反應(yīng)充分進(jìn)行，加入生物素標(biāo)記的二抗后，所述孵育的時(shí)間為25~35min，優(yōu)選為30min，加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶后，所述孵育的時(shí)間為25~35min，優(yōu)選為30min。
[0026]步驟(2)和(4)中，所述的緩沖液為含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液。
[0027]通過電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集指紋圖像時(shí)，電位為-1~-0.5V，優(yōu)選為-0.75V。
[0028]通過電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集指紋圖像時(shí)，電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液為含0.15MNaCl、3.0X KT4M魯米諾、1.4X 10-4Μ對(duì)碘苯酚的Tris-HCl緩沖溶液，Tris-HCl緩沖溶液的pH 為 8.5。
[0029]電化學(xué)反應(yīng)使電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液中的溶解02還原生成H2O2，在指紋HRP的催化作用下，H2O2與魯米諾在指紋上產(chǎn)生波長(zhǎng)425nm的化學(xué)發(fā)光，從而顯現(xiàn)出指紋紋路。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是，
[0031](I)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速，只需數(shù)秒鐘即可得到完整的指紋圖像，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于掃描電化學(xué)顯微鏡技術(shù)(十幾至幾十小時(shí))。
[0032](2)本發(fā)明的方法不需要昂貴儀器，便于現(xiàn)場(chǎng)快速實(shí)時(shí)檢測(cè)，且發(fā)光試劑具有造價(jià)低、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。
[0033](3)本發(fā)明以酶 聯(lián)免疫分析為檢測(cè)手段、電化學(xué)發(fā)光成像為信號(hào)獲取方式，與廣泛使用的熒光法相比，本發(fā)明的方法不需要外加激發(fā)光源，因此不存在背景光干擾，指紋圖像更加顯著清晰。
[0034](4)本發(fā)明方法的靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)汗?jié)撝赣≈泻哿看x物(表皮生長(zhǎng)因子、溶菌酶、人汗腺抗菌肽Dermcidin等)的特異性檢測(cè)，能夠在進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)汗?jié)撝赣〕煞址治龅哪康摹?br> 【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)示意圖；
[0036]圖2為圖1中電化學(xué)反應(yīng)池的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0037]圖1~圖2中，1、電化學(xué)反應(yīng)池；2、電化學(xué)工作站；3、(XD照相機(jī)；4、底座；5、池體；
6、凹槽；7、0型密封圈；8、螺栓；9、電極孔；10、工作電極；11、對(duì)電極；12、參比電極；
[0038]圖3為用羊抗人IgG檢測(cè)得到的血指印電化學(xué)發(fā)光圖；
[0039]圖4a為用表皮生長(zhǎng)因子抗體檢測(cè)(三步法)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0040]圖4b為用表皮生長(zhǎng)因子抗體檢測(cè)(兩步法)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0041]圖5a為用溶菌酶抗體檢測(cè)(三步法)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0042]圖5b為用溶菌酶抗體檢測(cè)(兩步法)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0043]圖6a為用人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體檢測(cè)(三步法)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0044]圖6b為用人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體檢測(cè)(兩步法)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0045]圖6c為用人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體檢測(cè)(兩步法,羊抗兔IgG/HRP的濃度分別為0.005mg/mL)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0046]圖6d為用人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體檢測(cè)(兩步法,羊抗兔IgG/HRP的濃度分別為0.01mg/mL)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖；
[0047]圖6e為用人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體檢測(cè)(兩步法,羊抗兔IgG/HRP的濃度分別為0.05mg/mL)得到的潛在指紋電化學(xué)發(fā)光圖。
【具體實(shí)施方式】[0048]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。
[0049]本發(fā)明在電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)，該電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)可采用常規(guī)結(jié)構(gòu)。
[0050]如圖1和圖2所示，電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)包括電化學(xué)反應(yīng)池1、電化學(xué)工作站2和CCD照相機(jī)3。
[0051]電化學(xué)工作站2包括由工作電極10、對(duì)電極11和參比電極12組成的三電極體系，其中，工作電極為聚苯乙烯鍍金片，對(duì)電極為鉬環(huán)，參比電極為Ag/AgCl電極或飽和甘汞電極。
[0052]聚苯乙烯鍍金片可依據(jù)文獻(xiàn)(Electrophoresis, 2006，27:2940-2950)的方法進(jìn)行制備，首先將聚苯乙烯片放在紫外燈下曝光3h，依次浸在胺化液、ImM HAuC14、0.1mMNaBH4及鍍金液中，分別反應(yīng)3h、2.5h、15min及3h，最后在烘箱中80°C下烘干3h。
[0053]電化學(xué)反應(yīng)池I包括底座4和池體5,均可采用聚四氟乙烯材料,底座4上具有用于容納工作電極10的凹槽6。
[0054]池體5通過螺栓8固定在底座4上，池體5的一側(cè)設(shè)有電極孔9，工作時(shí)，參比電極12位于該電極孔9內(nèi)，池體5中空，池體5的中空部位正對(duì)凹槽6，且該中空部位設(shè)有O型密封圈7。
[0055]使用時(shí)，將工作電極置于凹槽內(nèi)、對(duì)電極置于池體內(nèi)，參比電極置于電極孔內(nèi)，向池體內(nèi)加入電化學(xué)發(fā)光溶液，工作電極表面產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光會(huì)被上方的高靈敏CCD照相機(jī)捕獲，由此得到指印圖像。
[0056]試劑溶液
[0057](I)表皮生長(zhǎng)因子抗體:購(gòu)自生工生物工程有限公司，貨號(hào)為DA1709 ；
[0058](2)溶菌酶抗體:購(gòu)自生工生物工程有限公司，貨號(hào)為DA2322 ；
[0059](3)人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體:購(gòu)自百奇生物科技有限公司，貨號(hào)為AP6718b
[0060](4)羊抗人IgG:購(gòu)自生工生物工程有限公司，貨號(hào)為DAC1011 ；
[0061](5)兔抗羊 IgG/HRP:購(gòu)自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,貨號(hào)為305-065-003 ；
[0062](6)羊抗兔IgG/HRP:購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為bsb_0295G ；
[0063](7)羊抗兔IgG/生物素:購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為bsb_0295G ；
[0064](8)鏈霉親和素/HRP:購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為bse-0437P ；
[0065](9) PBS-T:0.1% 吐溫-20 的 PBS 緩沖液，pH 為 7.4。
[0066](10)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液:含0.15M NaCl、3.0 X 10-4Μ魯米諾、1.4 X 10-4Μ對(duì)碘苯酚的Tris-HCl緩沖溶液，Tris-HCl緩沖溶液的pH為8.5。
[0067]實(shí)施例1[0068]( I)手指上廳少量新鮮血液，在聚本乙纟布鍛金片上按一枚血指?。?br> [0069](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL羊抗人IgG (溶解抗體的溶劑均為含2%BSA，0.1%吐溫-20的PBS)滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.05mg/mL兔抗羊IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0070](3)電化學(xué)發(fā)光成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片(工作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像。
[0071]圖3示出了本實(shí)施例采集的電化學(xué)發(fā)光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0072]實(shí)施例2
[0073]1、二步法
[0074](I)在聚苯乙烯鍍金片上按一枚汗?jié)撝赣。?br> [0075](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL表皮生長(zhǎng)因子抗體滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將IOOyL 0.01mg/mL羊抗兔IgG/生物素滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干，再將100 μ L 5 μ g/mL鏈霉親和素/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0076](3)電化學(xué)發(fā)光 成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片(工作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像。
[0077]圖4a示出了本實(shí)施例采集的電化學(xué)發(fā)光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0078]2、兩步法
[0079]( I)在聚苯乙烯鍍金片上按一枚汗?jié)撝赣。?br> [0080](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL表皮生長(zhǎng)因子抗體滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.01mg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0081](3)電化學(xué)發(fā)光成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片(工作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像。
[0082]如圖4b所示，盡管經(jīng)一抗、二抗/HRP處理(兩步法)后也可采集到指紋圖像，但與經(jīng)一抗、二抗/生物素、鏈霉親和素/HRP處理的樣本圖像(三步法)相比，兩步法采集的指紋圖像發(fā)光強(qiáng)度弱，紋理不清晰。
[0083]實(shí)施例3
[0084]1、三步法
[0085]( I)在聚苯乙烯鍍金片上按一枚汗?jié)撝赣。?br> [0086](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL溶菌酶抗體滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.01mg/mL羊抗兔IgG/生物素滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干，再將100 μ L 5 μ g/mL鏈霉親和素/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0087](3)電化學(xué)發(fā)光成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片(工作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像。
[0088]圖5a示出了本實(shí)施例采集的電化學(xué)發(fā)光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0089]2、兩步法
[0090](I)在聚苯乙烯鍍金片上按一枚汗?jié)撝赣。?br> [0091](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL溶菌酶抗體滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.01mg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0092](3)電化學(xué)發(fā)光成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像。
[0093]如圖5b所示，盡管經(jīng)一抗、二抗/HRP處理(兩步法)后也可采集到指紋圖像，但與經(jīng)一抗、二抗/生物素、鏈霉親和素/HRP處理的樣本圖像(三步法)相比，兩步法采集的指紋圖像發(fā)光強(qiáng)度弱，不均勻，紋理不清晰。
[0094]實(shí)施例4
[0095]1、三步法
[0096](I)在聚苯乙烯鍍金片上按一枚汗?jié)撝赣。?br> [0097](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min,用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.01mg/mL羊抗兔IgG/生物素滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干，再將100 μ L 5 μ g/mL鏈霉親和素/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0098](3)電化學(xué)發(fā)光成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像。
[0099]圖6a示出了本實(shí)施例采集的電化學(xué)發(fā)光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0100]2、兩步法
[0101](1)在聚苯乙烯鍍金片上按一枚汗?jié)撝赣。?br> [0102](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min,用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.01mg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0103](3)電化學(xué)發(fā)光成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片(工作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像 。
[0104]如圖6b所示，盡管經(jīng)一抗、二抗/HRP處理(兩步法)后也可采集到指紋圖像，但與經(jīng)一抗、二抗/生物素、鏈霉親和素/HRP處理的樣本圖像(三步法)相比，兩步法采集的指紋圖像發(fā)光強(qiáng)度弱，紋理不清晰。
[0105]3、不同羊抗兔/HRP濃度對(duì)指紋圖像的影響
[0106](I)在聚苯乙烯鍍金片上按一枚汗?jié)撝赣。?br> [0107](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個(gè)圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L 0.lmg/mL人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min,用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0108](3)電化學(xué)發(fā)光成像:將上述處理的聚苯乙烯鍍金片(工作電極)、對(duì)電極和參比電極置于電化學(xué)反應(yīng)池中，加入電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站通電，CCD照相機(jī)采集指紋圖像。
[0109]羊抗兔IgG/HRP 的濃度分別為 0.005、0.01,0.05mg/mL。
[0110]采集的指紋圖像如圖6c-6e所示,可以看出羊抗兔IgG/HRP的濃度(0.005mg/mL)太低時(shí)電化學(xué)發(fā)光很弱，無法顯示指紋(圖6c)，二抗的濃度為0.01mg/mL可以使反應(yīng)充分，繼續(xù)提高二抗的濃度(0.05mg/mL)時(shí)會(huì)使電化學(xué)發(fā)光太強(qiáng)，也不利于指紋的顯現(xiàn)(圖6e)，所以二抗的濃度為0.01mg/mL時(shí)效果較佳(圖6d)。
[0111]上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析的潛在指紋成像的方法，其特征在于，包括: (1)將指印轉(zhuǎn)移到電極基底上，得到指印樣本； (2)往所述指印樣本的指印上加入手指代謝物的抗體溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后用緩沖液進(jìn)行沖洗； (3)將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育； 或者將所述的經(jīng)(2)處理后的指印樣本干燥，然后向指印上加入生物素標(biāo)記的二抗，孵育一段時(shí)間后沖洗、吹干指印樣本，再向指印上加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育； (4)孵育后，用所述的緩沖液沖洗指印樣本，干燥后制備得到工作電極，然后通過電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集指紋圖像。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的電極基底為聚苯乙烯鍍金片。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的指印為血指印或汗?jié)撝赣　?br> 4.如權(quán)利要求3所 述的方法，其特征在于，所述的指印為血指印時(shí)，所述的手指代謝物為 IgG0
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的指印為汗?jié)撝赣r(shí)，所述的手指代謝物為表皮生長(zhǎng)因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermc idin。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體溶液的濃度為0.05~0.2mg/mL。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗的濃度為0.04 ~0.06mg/mL。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的二抗的濃度為0.005~0.02mg/mL。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶的濃度為3~6 μ g/mL。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液為含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103536295SQ201310493595
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】蘇彬, 許林茹 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)