的癌胚抗原的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學(xué)免疫傳感技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于納米探針C6O的癌胚抗原(CEA)的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法。具體涉及一種金納米簇作為抗體捕獲基底，AuNPs@L-cys-C6Q標記的第二抗體作為氧化還原探針的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]CEA屬于胚胎抗原中的一種，是一種正常成分，因其在胚胎發(fā)育階段由胚胎組織產(chǎn)生。隨著胚胎的生長，胚胎的后期胚胎抗原的含量減少，出生后會逐漸消失或僅存在極微量。當細胞癌變時，此類抗原可被重新合成，并且表達于腫瘤細胞表面，也可分泌到血液中，其含量與細胞惡性程度常常呈正相關(guān)，因此，臨床診斷上常把CEA作為檢測腫瘤的一個重要指標。目前測定CEA的免疫方法主要有酶聯(lián)免疫分析，熒光免疫分析，放射免疫分析等。這些傳統(tǒng)的免疫分析方法通常存在操作復(fù)雜，價格昂貴，不適合實時檢測。電化學(xué)免疫傳感器由于所需儀器設(shè)備簡單，靈敏度高，檢測速度快，成本低，尤其是滿足實時檢測的需要而備受人們的廣泛關(guān)注?；陔娀瘜W(xué)傳感器的優(yōu)良性質(zhì)本發(fā)明制備了一種基于納米探針C6q的CEA的電化學(xué)免疫傳感器，以C6q為電化學(xué)探針，通過抗原抗體之間高度的特異性結(jié)合實現(xiàn)對CEA的檢測。
[0003]本發(fā)明中金納米簇作為第一抗體捕獲基底，由于其良好的生物相容性，優(yōu)異的導(dǎo)電性和大的表面積，不僅可以負載更多的抗體，而且可以促進蛋白質(zhì)和電極之間的電子傳遞。AuNPs@L-cys-C6o作為電化學(xué)檢測時的氧化還原納米探針用于第二抗體的標記，基于抗原抗體之間良好的特異性，該傳感器用于檢測CEA。在本發(fā)明中構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器具有成本低，穩(wěn)定性好，制備過程簡單，靈敏度高等優(yōu)點，有效克服了目前CEA檢測方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是以AuNPs@L-cys-C6Q為電化學(xué)氧化還原探針，構(gòu)建了一種簡單快速，穩(wěn)定性好，靈敏度高的電化學(xué)免疫傳感器。
[0005]本發(fā)明的目的之二是將該電化學(xué)免疫傳感器用于CEA的檢測。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
1.一種基于納米探針C6O的CEA的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法:
(1)用Al2O3拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min，氮氣吹干；以10 mL含有濃度為1.0 mmoL/L的HAuCl4溶液為底液，以GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極在-0.8?0.6 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描30圈后，將電極在0.1 moL/L的KCl溶液中浸泡過夜，用PBS(pH 7.4)緩沖液沖洗得到金納米簇修飾玻碳電極(nano-Au/GCE)；
(2)取10yL 1-2.5 yg/mL的CEA第一抗體(Ab1)標準溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4°C冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到Abi/nano-Au/GCE;
(3)取10yL質(zhì)量分數(shù)為1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Abi/nano-Au/GCE表面，在37 °C下孵育I h，以封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/Abi/nano-Au/GCE ；
(4)將10yL 0.1 pg/mL?1.0ng/mL的一系列不同濃度的CEA標準溶液滴涂到BSA/Abi/nano-Au/GCE表面用于與抗體特異性識別，在37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE ；
(5)滴加6~10yL AuNPs@L-cys-C6Q標記CEA第二抗體(Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q)到上述電極表面，在37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，再取10 yL 10.0mmoL的四辛基溴化銨甲苯溶液滴涂到電極表面室溫下孵育1min后用I3BS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于納米探針C6q的CEA的電化學(xué)免疫傳感器(Ab2-AuNPS@L-cyS-Ceo/CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE)。
[0007]2.上述的Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q的制備:
(1)AuNPs@L-cys-C6Q的制備
在磁力攪拌下，將0.40 g的L-cys加入到于I mL 7.1 moL/L的NaOH溶液中，然后加入8mL乙醇繼續(xù)攪拌使得溶液充分混勾，將2 mL I mg/mL的Cso的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室溫下持續(xù)攪拌24 h，用超純水離心洗滌3次得到L-cys-C6Q；將L-cys-C6Q重新分散至IJ4 mL超純水中，取2 mL 0.01 mol/L的HAuCU加入到上述溶液中攪拌24 h，之后滴加0.03 mol/L的抗壞血酸直至溶液成黑色，用超純水離心洗滌得到AuNPs@L-cys-C6Q，將AuNPs@L-cys-C6Q重新分散到2 mL超純水中；
(2)Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q的制備
取0.2 mL 10 yg/mL的Ab2在攪拌的條件下加入到2 mL AuNPs@L-cys-C6Q溶液中，室溫下攪拌30 min后在4 °C下孵育過夜，得到的混合溶液在9000 r/s離心15 min，棄去上清液，重新溶解到I mL PBS (pH 7.4)緩沖溶液中，得到Ab2-AuNPs@L-cys-C6Q溶液。
[0008]3.CEA的檢測:
(1)實驗在電化學(xué)工作站上進行，采用三電極體系以所制備的免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極。在PBS(pH 7.4)緩沖溶液中進行測試；
(2)用差分脈沖伏安法對一系列不同濃度CEA標準溶液及未特異性結(jié)合CEA的電極進行檢測，掃描的電位區(qū)間為-0.4 V-0.4 V，掃描速度為100 mV/s，記錄示差脈沖伏安圖，根據(jù)所得的峰電流值和CEA濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替CEA標準溶液進行檢測。
[0009]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明以金納米簇作為第一抗體捕獲基底，不僅可以負載更多的抗體，而且可以促進蛋白質(zhì)和電極之間的電子傳遞，進而增加電極的靈敏度；另外AuNPs@L-cys-C6Q作為電化學(xué)檢測時的氧化還原納米探針用于第二抗體的標記，一方面可以增加第二抗體的負載量，另一方面可以有效避免氧化還原探針分子的滲漏；
(2)本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于CEA的檢測，具有簡單、快速、高靈敏檢測的優(yōu)勢，線性范圍為0.1 pg/mL?1.0ng/mL，檢出限為0.05 pg/mL。
[0010]【附圖說明】: 圖1所示為不同濃度CEA的差分脈沖伏安圖。
[0011 ]圖2所示為本發(fā)明峰電流差值與Igc線性關(guān)系圖。
[0012]其中，圖1中由a到j(luò)的氧化峰圖分別代表CEA的濃度為0、1.0 X 10—13、5.0X10-13、1.0X10—12、5.0X10—12、1.0X10—n、5.0X10—η、1.ΟΧΙΟ—10、1.0X10—9 g/mL；
【具體實施方式】:
為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。
[0013]實施例1一種基于納米探針C6q的CEA的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法
(1)用Al2O3拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min，氮氣吹干；以10 mL含有濃度為1.0 mmoL/L的HAuCl4溶液為底液，以GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極在-0.8?0.6 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描30圈后，將電極在0.1 moL/L的KCl溶液中浸泡過夜，用PBS(pH 7.4)緩沖液沖洗得到金納米簇修飾玻碳電極(nano-Au/GCE)；
(2)取10yL 1.0 yg/mL的CEA第一抗體(Ab1)標準溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4°C冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到Abi/nano-Au/GCE;
(3)取10yL質(zhì)量分數(shù)為1%的BSA溶液滴涂到Ah/nano-Au/GCE表面，在37 °C下孵育Ih，以封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到854/^131/11&110-Au/GCE；
(4)將10yL 0.1 pg/mL?1.0ng/mL的一系列不同濃度的CEA標準溶液滴涂到BSA/Abi/nano-Au/GCE表面用于與抗體特異性識別，在37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE ；
(5)滴加6yL AuNPs@L-cyS-C6Q標記CEA第二抗體(Ab2-AuNPs@L_cyS-C6Q)到上述電極表面，在37 °C下孵育60 min，用roS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，再取10 yL 10 mmoL的四辛基溴化銨甲苯溶液滴涂到電極表面室溫下孵育1min后用I3BS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于納米探針C6q的CEA的電化學(xué)免疫傳感器(Ab2-AuNPsOL-Cys-C60/CEA/BSA/Abi/nano-Au/GCE)。
[0014]實施例2—種基于納米探針C6q的CEA的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法
(1)用Al2O3拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min，氮氣吹干；以10 mL含有濃度為1.0 mmoL/L的HAuCl4溶液為底液，以GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極在-0.8?0.6 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描30圈后，將電極在0.1 moL/L的KCl溶液中浸泡過夜，用PBS(pH 7.4)緩沖液沖洗得到金納米簇修飾玻碳電極(nano-Au/GCE)；
(2)取10yL 2.0 yg/mL的CEA第一抗體(Ab1)標準溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4°C冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到Abi/nano-Au/GCE;
(3)取10yL質(zhì)量分數(shù)為2%的BSA溶液滴涂到Abi/nano-Au/GCE表面，在37 °C下孵育Ih，以封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到854/^131/11&110-Au/GCE；
(4)將10yL 0.