一種檢測蛋白質(zhì)烷基化修飾劑peg修飾能力的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可用于檢測蛋白質(zhì)烷基化修飾劑PEG修飾能力的試劑盒及其使用方法。本試劑盒內(nèi)包括有陽性對(duì)照谷胱甘肽粉劑、蛋白質(zhì)與修飾劑反應(yīng)Buffer緩沖液、NaH2PO4溶液、5,5－二硫代對(duì)二硝基苯甲酸（DTNB）顯色液。該試劑盒的使用方法是設(shè)置蛋白質(zhì)經(jīng)修飾劑修飾與蛋白質(zhì)不經(jīng)修飾劑修飾兩組，分別用5,5－二硫代對(duì)二硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑，利用分光光度計(jì)測定在波長412nm下兩組反應(yīng)體系的吸光值，根據(jù)兩組吸光值的差異來檢測蛋白質(zhì)烷基化修飾劑PEG的修飾能力。該試劑盒整個(gè)檢測過程在60min內(nèi)可完成，快速，簡便，并且穩(wěn)定性好、保存期長，具有重要的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種檢測蛋白質(zhì)烷基化修飾劑PEG修飾能力的試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒及其使用方法。更具體地，涉及ー種可用于檢測蛋白質(zhì)烷基化修飾劑PEG修飾能力的試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)化學(xué)修飾具有十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專一。20世紀(jì)50年代末期，用化學(xué)修飾的方法研究蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的目的是用于生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)方面。在生物醫(yī)學(xué)方面，化學(xué)修飾可以降低免疫原性的免疫反應(yīng)性、抑制免疫球蛋白E的產(chǎn)生等；在生物【技術(shù)領(lǐng)域】，酶經(jīng)過化學(xué)修飾后能夠在有機(jī)溶劑中高效地發(fā)揮催化作用，并表現(xiàn)出新穎的催化性能。
[0003]蛋白質(zhì)修飾劑與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的性質(zhì)，主要可以分為四種類型:(I)酰化及其相關(guān)反應(yīng)，這類修飾劑可以與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生?；磻?yīng)；(2)烷基化反應(yīng)，這類修飾劑的特點(diǎn)是帶有活潑的鹵素原子，由于鹵素原子的電負(fù)性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的親核基團(tuán)發(fā)生烷基化；(3)氧化和還原反應(yīng)，這類修飾劑具有氧化性，能將側(cè)鏈基團(tuán)氧化；(4)芳香環(huán)取代反應(yīng)，蛋白質(zhì)氨基酸殘基的酚羥基在3和5位上很容易發(fā)生親電取代的碘化和硝化反應(yīng)。有代表性的修飾劑有こ酰咪唑、鹵代こ酸、N-乙基馬來酰亞胺、碳化二亞胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-鹵代琥珀酰亞胺、こ二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/順丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、環(huán)糊精、聚 乙二醇(PEG )等。其中，PEG溶解性好，毒性低，無免疫原性，蛋白質(zhì)經(jīng)其修飾后不但保持了水溶性而且在有機(jī)溶劑中的溶解性也増加了，因此PEG類修飾劑應(yīng)用最多。
[0004]由于PEG的醇羥基化學(xué)性質(zhì)不活潑，所以必須通過特定的活化劑與其反應(yīng)使之活化。其中氰尿酰氯法是比較經(jīng)典的方法。該法具有活化反應(yīng)操作簡單、所活化的PEG修飾能力強(qiáng)、修飾蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的PEG活化方法之一。經(jīng)氰尿酰氯活化后的PEG帶上^!素原子，由于鹵素原子的電負(fù)性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的親核基團(tuán)(例如-SH，-NH2等)發(fā)生烷基化反應(yīng)，且?guī)€基基團(tuán)是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。因此活化的PEG修飾劑很容易與蛋白質(zhì)中的巰基與氨基發(fā)生反應(yīng)。
[0005]但是氰尿酰氯也存在著易水解的問題，水解后的氰尿酰氯即失去活化PEG的能力，此外活化后修飾劑的放置時(shí)間對(duì)其修飾能力產(chǎn)生很大影響，通常情況下，隨著活化PEG在冰箱中放置時(shí)間的延長，其修飾蛋白質(zhì)的能力會(huì)越來越低，并最終失去修飾能力。另外在制備PEG修飾劑的過程中，隨著操作及反應(yīng)條件的變化，PEG修飾能力也會(huì)有較大的差異。所以及時(shí)了解和掌握PEG修飾劑修飾蛋白質(zhì)的能力具有重要的意義。
[0006]目前還沒有理想有效的測定各種活化PEG修飾蛋白質(zhì)的能力的方法的相關(guān)報(bào)道。常遠(yuǎn)等(1996)以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白，采用凝膠電泳法來測定各種活化PEG的修飾能力，但該方法操作麻煩、操作時(shí)間長、結(jié)果不理想，而且不能定量的檢測活化PEG修飾蛋白質(zhì)的能力。
[0007]本試劑盒發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以利用修飾劑與蛋白質(zhì)在一定比例和一定的條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，用5，5 —二硫代對(duì)二硝基苯甲酸(DTNB)為顯色劑，利用分光光度計(jì)測定反應(yīng)后反應(yīng)體系的吸光值，根據(jù)蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾與不經(jīng)修飾兩組反應(yīng)體系吸光值的差異來檢測蛋白質(zhì)烷基化修飾劑PEG的修飾能力。
[0008]該方法利用氰尿酰氯法活化的蛋白質(zhì)烷基化修飾劑(例如活化的PEG)帶有活潑的鹵素原子，由于鹵素原子的電負(fù)性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的親核基團(tuán)(例如-NH2, -SH等)發(fā)生烷基化反應(yīng)，因此蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈基團(tuán)氨基、巰基等在一定的條件下可以與活化的PEG反應(yīng)，生成PEG-蛋白。以GSH為例，GSH與活化的PEG修飾劑的反應(yīng)式如下:
【權(quán)利要求】
1.一種檢測蛋白質(zhì)烷基化修飾劑修飾能力的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)包括有谷胱甘肽粉劑、蛋白質(zhì)與修飾劑反應(yīng)Buffer緩沖液、NaH2PO4溶液、5，5 一二硫代對(duì)二硝基苯甲酸顯色液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)包括: 谷胱甘肽粉劑1.536mgX 10支； Buffer 緩沖液0.lmol/L , 16OmL ； NaH2PO4 溶液3.2mol/L, 250mL ； .5,5 —二硫代對(duì)二硝基苯甲酸顯色液 1.0mmol/L, 25mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)烷基化修飾劑為聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)Buffer緩沖液按如下組分配制得到: .0.04mol/L 巴比妥鈉50.0mL ； .0.2mol/L HCl0.825mL ； 蒸餾水定容至IOOmL ； 然后用PH計(jì)調(diào)節(jié)pH值至9.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述試劑盒，其特征在于，所述的5，5一二硫代對(duì)二硝基苯甲酸顯色液按如下組分配制得到: DTNB20mg ； 檸檬酸三鈉500mg ； 雙蒸水溶解并稀釋定容至50mL，置于棕色瓶避光4°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述試劑盒，其特征在于，所述谷胱甘肽粉劑在每次測定前，取I支用buffer緩沖液定容至5mL，得到1.0mmol/L的GSH溶液。
7.權(quán)利要求1或2所述試劑盒的使用方法，其特征在于，使用步驟如下: .51.準(zhǔn)備活化的待檢測修飾劑和待修飾的蛋白質(zhì)溶液； .52.檢測實(shí)驗(yàn)分為兩組:按照2:1的摩爾比分別準(zhǔn)備SI準(zhǔn)備好的修飾劑與蛋白質(zhì)溶液作為測定組，蛋白質(zhì)溶液作為對(duì)照組； .53.分別將S2測定組中加入權(quán)利要求3所述Buffer緩沖液，修飾劑與蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系的pH值為9.0、，反應(yīng)溫度為35°C~55°C、反應(yīng)時(shí)間為3(T50min ； .54.分別往S3所述反應(yīng)體系和對(duì)照組中加入5，5一二硫代對(duì)二硝基苯甲酸顯色液，利用分光光度計(jì)測定在波長412nm下兩組反應(yīng)體系的吸光值； .55.根據(jù)S4測定的兩組吸光值的差異來判斷和/或計(jì)算出待檢測修飾劑對(duì)待修飾蛋白質(zhì)的修飾能力；計(jì)算公式為:
^ ^o3 = lg,f.g.ZE.l_ZlggMMI_I_IEggWttjx _。 +” 一 '對(duì)照管嚷先_'
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述使用方法，其特征在于，SI所述活化的待檢測修飾劑優(yōu)選的活化方法如下: . 511.用無水苯重結(jié)晶三聚氰氯； .512.取Sll處理的三聚氰氯溶解于含無水碳酸鈉的無水苯中，加入修飾劑，室溫下攪拌過夜后過濾； 取濾液在攪拌下加入乙醚，得白色沉淀，繼續(xù)攪拌后抽濾，所得沉淀用無水苯溶解；上述沉淀、溶解重復(fù)操作多次，直到紫外檢測無三聚氰氯的吸收峰為止； S13.將S12處理的修飾劑真空抽干后密封冷藏保存?zhèn)溆谩?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求7所述使用方法，其特征在于，S3所述反應(yīng)溫度為45°C、反應(yīng)時(shí)間為40mino
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述使用方法，其特征在于，所述待修飾的蛋白質(zhì)溶液濃度為。1.0mmol/L，使用Buffer緩沖 液配制；以谷胱甘肽作為待修飾蛋白質(zhì)的陽性對(duì)照。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK103575730SQ201310494929
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】陳芳艷, 王林川, 馮定遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)