一種檢測重組豬干擾素α1凍干粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測重組豬干擾素α1凍干粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。采用改良鱟試劑檢查法，用2ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解重組豬干擾素α1凍干粉針劑，100℃煮沸10min去除鱟試驗干擾因素，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在不超過最大有效倍數(shù)的情況下對煮沸處理后重組豬干擾素α1蛋白進行逐級稀釋，先檢查各稀釋濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，然后再從反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋度開始做干擾試驗，找出在無干擾的情況下能與鱟試驗形成凝膠的最低濃度，從而確定重組豬干擾素α1凍干粉針劑中內(nèi)毒素的具體含量。本發(fā)明為重組豬干擾素α1凍干粉針劑生產(chǎn)應(yīng)用提供了測定細(xì)菌內(nèi)毒素的測定方法。
【專利說明】一種檢測重組豬干擾素α1凍干粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測方法，具體涉及一種重組豬干擾素α I凍干粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素作為當(dāng)前公認(rèn)的抗病毒有效藥物，安全性能好，并具有良好的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)功能，是當(dāng)今應(yīng)用前景最為廣泛的生物制劑之一。動物用干擾素最早應(yīng)用于獸醫(yī)臨床的是豬白細(xì)胞干擾素，但該種干擾素表達(dá)量低，需采用生化分離的方法獲得，成本較高，不利于規(guī)模化生產(chǎn)。我室采用基因工程技術(shù)獲得了一種重組豬干擾素α(重組豬α干擾素的制備方法，專利號2008100201804)，臨床試用結(jié)果表明其可有效治療豬病毒性腹瀉等疾病。
[0003]細(xì)菌內(nèi)毒素是一種革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，只有在細(xì)菌死亡或繁殖時，才釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮各種效應(yīng)。內(nèi)毒素化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(LPS)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是近二十年來發(fā)展起來的用于檢測藥品及其中間品中內(nèi)毒素污染的一種方法。傳統(tǒng)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是家兔熱原檢查。2005年版《中國藥典》參照美、歐、日三方關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法協(xié)調(diào)案的格式，并結(jié)合國內(nèi)實際情況，確定了鱟試驗法做為檢測人基因工程干擾素制劑細(xì)菌內(nèi)毒素含量的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。本法與傳統(tǒng)家兔法比較具有靈敏度高，無個體差異，受外界影響小，實驗重現(xiàn)性好，費用低廉等優(yōu)點，非常適合廠家對生產(chǎn)全過程的熱原監(jiān)控和中間產(chǎn)品檢測。但是目前獸用生物制品現(xiàn)行的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法依然是傳統(tǒng)的家兔熱原檢查，因此建立獸用生物制品中新的細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測方法具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的就是提供一種重組豬干擾素α I凍干粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]一種檢測重組豬干擾素α I凍干粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法，采用改良鱟試劑檢查法，包括以下步驟:
[0007]用2ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解重組豬干擾素α I凍干粉針劑，100°C煮沸IOmin去除鱟試驗干擾因素，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在不超過最大有效倍數(shù)的情況下對煮沸處理后重組豬干擾素α I蛋白進行逐級稀釋，先檢查各稀釋濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，然后再從反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋度開始做干擾試驗，找出在無干擾的情況下能與鱟試驗形成凝膠的最低濃度，從而確定重組豬干擾素α I凍干粉針劑中內(nèi)毒素的具體含量。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0009]可以快速地檢測出重組豬干擾素α I凍干粉針劑中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。
[0010]采用加熱法去除了干擾因素，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。[0011]操作簡便，無需貴重精密的大型的設(shè)備，檢測成本低。
【具體實施方式】
[0012]實施例1
[0013]1.試劑
[0014]供試品:重組豬干擾素α I凍干粉針劑(批號是20121116，效價為1.0XlO6IU,內(nèi)毒素含量為25EU)
[0015]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水:內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水
[0016]細(xì)囷內(nèi)毒素國豕標(biāo)準(zhǔn)品:購自中國食品藥品檢定研究院，每支10000EU。
[0017]鱟試劑:購自廈門鱟試劑廠，0.1ml/支(λ=0.25EU/ml)
[0018]2.儀器設(shè)備
[0019]旋潤混合器、封口膜、試管(IOX 75mm)、吸管、鑷子(金屬)、金屬盒。
[0020]實驗中使用的所有玻璃器具一般經(jīng)洗液浸泡后，取出用自來水、純化水依次沖洗干凈(可用純化水浸泡)。
[0021]試驗中所用的器皿，需要經(jīng)過250°C干烤30分鐘以上備用，以除去外源性內(nèi)毒素。除去外源性內(nèi)毒素的玻璃器皿應(yīng)在規(guī)定內(nèi)使用(如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用)，否則須再次除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。
[0022]3.確定細(xì)菌內(nèi)毒素限值
[0023]公式L=K/M計算。M為每公斤每小時臨床最大用藥劑量，依據(jù)藥品使用說明書確定，注射時間若不足I小時，按I小時計算。K為每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以 EU/(kg.h)表示，注射劑 K=5EU/(kg.h)
[0024]本室重組豬干擾素α I凍干粉針劑按效價計算:每公斤每小時臨床最大用重組豬干擾素α I凍干粉針劑劑量1000IU (20公斤乳豬20000IU干擾素)，L為5EU/2000IU=0.0025EU/IU，每支重組豬干擾素α凍干成品20000IU，則每支重組豬干擾素α I凍干粉針劑內(nèi)毒素限值為50EU。
[0025]4.確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)
[0026]最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)(MVD)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD:MVD=cL/ λ
[0027]其中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度，λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml)，或是在光度測定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。
[0028]本室重組豬干擾素α I凍干粉針劑:c=10000IU/ml，L為0.0025EU/IU，λ為
0.25EU/ml, MVD=IOO。
[0029]5.鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗
[0030]在本檢查法規(guī)定的條件下使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml標(biāo)示。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。
[0031]根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(λ )，將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解,在鏇渦混合器上混勻15分鐘,然后制成2 λ、λ、0.5 λ和0.25 λ四個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步應(yīng)在漩渦混合器上混勻30秒鐘。取分裝有
0.1ml當(dāng)試劑溶液的IOmmX 75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的當(dāng)試劑原安瓿18支,其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37°C ±1°C的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。
[0032]當(dāng)最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λ C)。
[0033]λ C=Ig-1 (Σ Χ/4)
[0034]式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。
[0035]需要注意的是，當(dāng)實測靈敏度入。在0.5入?2.0λ (包括0.5入?2.0λ，λ為鱟試劑靈敏的標(biāo)示值)時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度(結(jié)果見表I)。
[0036]6.干擾試驗預(yù)試驗
[0037]取一支重組豬干擾素α I凍干粉針劑，然后用2ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后作為原液。按照擬定內(nèi)毒素限值，加內(nèi)毒素檢查用水溶解并稀釋至不超過MVD規(guī)定的系列稀釋度:1:10、1:20、1:40、1:80、1:100，再分別將每個稀釋度制成含有和不含有2 λ細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的重組豬干擾素αI溶液。同時設(shè)立陽性對照(加入2λ的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素)及陰性對照(細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水)，其中每個稀釋度平行做兩支，計算平均回收率。
[0038]重組豬干擾素α I原液1:20、1:40、1:80、1:100稀釋外加2 λ細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品后，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測回收率均在有效范圍50%?200%內(nèi)，表明重組豬干擾素α I凍干粉針劑在該實驗條件下已能排除干擾因素。正式干擾實驗選用1:20稀釋度。
[0039]7.干擾試驗
[0040]重組豬干擾素α I原液1:20稀釋，按表2制備各系列溶液。參照鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作，記錄供試液的干擾情況。
[0041]結(jié)果觀察與判斷:
[0042]只有當(dāng)重組豬干擾素α I溶液(A)和陰性對照溶液(D)的平行管都為陰性，且鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列溶液的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時，試驗方為有效，計算系列鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列溶液和干擾試劑系列溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es和Et)。當(dāng)Es在0.5 λ?2 λ (包括0.5 λ和2 λ )及Et在0.5Es?2Es (包括0.5Es和2Es)時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若重組豬干擾素α I溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將重組豬干擾素α I溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗。本實驗結(jié)果表明重組豬干擾素α I原液1:20稀釋對鱟試劑檢測無干擾。
[0043]當(dāng)進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗；當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。
[0044]8.細(xì)菌內(nèi)毒素檢測
[0045]取重組豬干擾素α I凍干粉針劑,然后用2ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后作為原液，在渦旋振動器上使其完全溶解。取鱟試劑，每支加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水溶解，從中取I支加入0.1ml2 λ的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，I支加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水作為陰性對照，其余每4支作平行加入各稀釋度的重組豬干擾素α I溶液0.1ml0將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37 ± I °C的恒溫器中，保溫60 土 2min后觀察結(jié)果。
[0046]9.結(jié)果判定
[0047]在重組豬干擾素α I溶液形成凝膠的最大稀釋倍數(shù)且無干擾的情況下，計算重組豬干擾素α I凍干粉針劑中內(nèi)毒素含量。
[0048]重組豬干擾素α I凍干粉針劑中內(nèi)毒素濃度=鱟試劑的靈敏度X所有平行管反應(yīng)終點濃度的幾何平均值。
[0049]表1標(biāo)示靈敏度0.25EU/ml的鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測重組豬干擾素α I凍干粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于采用改良鱟試劑檢查法，包括以下步驟: 用2ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解重組豬干擾素α I凍干粉針劑，100°C煮沸10 min去除鱟試驗干擾因素，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在不超過最大有效倍數(shù)的情況下對煮沸處理后重組豬干擾素α I蛋白進行逐級稀釋，先檢查各稀釋濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，然后再從反應(yīng)結(jié)果為陰性的最低稀釋度開始做干擾試驗，找出在無干擾的情況下能與鱟試驗形成凝膠的最低濃度，從而確定重組豬干擾素α I凍干粉針劑中內(nèi)毒素的具體含量。
【文檔編號】G01N33/68GK103592442SQ201310526221
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王明麗, 趙俊, 葉靚, 周煒 申請人:王明麗, 趙俊