一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒及其制備方法，該試劑盒包括試劑R1和試劑R2兩種組分，其中R1主要由緩沖液1、穩(wěn)定劑1、防腐劑1、增凝劑、保護(hù)劑1和EDTA組成，試劑R2主要由緩沖液2、穩(wěn)定劑2、防腐劑2、聚苯乙烯膠乳微球、PCT抗體、和保護(hù)劑2組成；所述試劑R2中的聚苯乙烯膠乳微球的粒徑為100～600nm，PCT抗體應(yīng)為鼠抗人PCT抗體、山羊抗人降鈣素原抗體或兔抗人降鈣素原抗體的一種或者幾種，其中PCT抗體與聚苯乙烯膠乳微球之間以共價偶聯(lián)或物理吸附方式連接。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中的降鈣素原（PCT）檢測試劑盒具有制備低廉、穩(wěn)定性好、易于保存、檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，比較容易的在臨床進(jìn)行推廣。
【專利說明】一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種體外診斷試劑領(lǐng)域，尤其是一種降鈣素原膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]降鈣素原(procalcitonin，PCT)是一種由116個氨基酸組成的糖蛋白，是降鈣素(calcitonin, CT)的前體肽。降鈣素原可被酶裂解為許多小的片斷，最終形成氨基降鈣素原、成熟的降鈣素和鈣抑肽。降鈣素原可以以游離形式存在于正常人血清中。在正常情況下，人體內(nèi)血清PCT水平很低,大多低于0.lng/ml,0.5ng/ml是全身性感染(膿毒癥)診斷的分界值；新生兒出生2天內(nèi)PCT生理性增高，最高可達(dá)21ng/ml ;長期血液透析患者血漿PCT值可達(dá)1.5ng/ml。降鈣素原在感染后2_3h即可增高，6_12h后到達(dá)頂峰，在48h內(nèi)保持較高水平，2d后降到基線水平。半衰期大約25-30h。PCT在體內(nèi)外穩(wěn)定性較好，與常規(guī)用于炎癥診斷的指標(biāo)相比，已被公認(rèn)為最理想的診斷嚴(yán)重細(xì)菌感染的指標(biāo)。它在細(xì)菌性感染和非細(xì)菌性感染的鑒別，細(xì)菌性感染的嚴(yán)重程度，嚴(yán)重感染或膿毒癥的早期診斷，高?；颊?如ICU，器官移植術(shù)后或免疫抑制治療的患者)感染性疾病的監(jiān)測，疾病轉(zhuǎn)歸的評估，以及指導(dǎo)治療方案的選擇等方面有很高的價值，優(yōu)于目前常用的其他檢測項(xiàng)目，有很好的應(yīng)用前景。PCT可廣泛用于I⑶病房、血液科、腫瘤科、兒科、早產(chǎn)兒及新生兒監(jiān)護(hù)室、外科、內(nèi)科、器官移植科、急診科和治療實(shí)驗(yàn)室等。
[0003]對于PCT檢測，現(xiàn)有檢測方法主要有定量方法、半定量檢測方法和定性檢測方法，定量檢測方法有雙抗夾心法(ELISA)、免疫發(fā)光法、高效液相色譜分析、放射免疫分析法等，其中放射免疫分析法和高效液相色譜分子法在臨床中有一定的限制，而ELISA (雙抗夾心法)和免疫發(fā)光法臨床比較常用，ELSA的靈敏度較高，但其操作復(fù)雜，需要較多時間，一般結(jié)果為定性或半定量，定量時偏差較大，且線性范圍窄，對于樣品稀釋度不好控制；免疫化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足臨床PCT測定需求，但是需要配套專門儀器使用，價格昂貴不利于醫(yī)院推廣，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線會隨著時間漂移(發(fā)光持續(xù)時間長，可在不同時間測量)。定性方法主要有免疫層析法，其可以作為定性或半定量檢測方法，可以快速給出結(jié)果，定性時不需要特殊儀器，但是不能給出定量數(shù)據(jù)，而且主觀誤差較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種制備成本低廉，穩(wěn)定性好，易于保存，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，檢測靈敏度高的降鈣素原檢測試劑盒，以及降鈣素原試劑盒的制備方法。
[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，包括試劑Rl和試劑R2兩種組分，所述試劑Rl主要由緩沖液1、穩(wěn)定劑1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護(hù)劑I組成；所述試劑R2主要由交聯(lián)PCT抗體的聚苯乙烯膠乳微球、緩沖液2、穩(wěn)定劑2、防腐劑2、保護(hù)劑2組成，其中聚苯乙烯膠乳微球與PCT抗體之間以共價交聯(lián)方式連接。
[0006]本技術(shù)方案中的防腐劑I和2是指可以抑制試劑中細(xì)菌和微生物污染的一類試齊U，對試劑具有防腐殺菌的作用。試劑R2中的保護(hù)劑一類能夠保護(hù)膠乳顆粒表面的抗體的試劑。穩(wěn)定劑I和2可以保持試劑內(nèi)的電荷平衡。
[0007]本技術(shù)方案中的降鈣素原膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，將PCT抗體交聯(lián)在聚苯乙烯膠乳微球表面，當(dāng)血液中的PCT與PCT抗體反應(yīng)時，帶動聚苯乙烯膠乳微球聚集產(chǎn)生一定濁度，而濁度與血液中的PCT含量在一定范圍成正比，可以用全自動生化儀在400-800nm波長下檢測血液中PCT的含量。
[0008]作為優(yōu)化，所述試劑Rl中的緩沖液I選自Ifepes緩沖液、Tris-HCl緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼砂緩沖液中的一種或幾種，其pH為7.0?9.0，濃度為25?500mmol/L ;所述試劑R2中的緩沖液2選自PBS緩沖液、硼砂緩沖液、甘氨酸緩沖液、Ifepes緩沖液、GOODS緩沖液、MOPS緩沖液中的一種或幾種，其pH為7.0?9.0，濃度為25 ?500mmol/L。
[0009]作為優(yōu)化，所述試劑Rl中的穩(wěn)定劑I選自KCl、NaCl、CaCl中的一種或者幾種，其質(zhì)量濃度為0.5%?10% ;所述試劑R2中的穩(wěn)定劑2采用離子穩(wěn)定劑和懸浮穩(wěn)定劑配合使用；其中離子穩(wěn)定劑為NaCl、KCl、Na2C03、Na2SCM或者K2S04，懸浮穩(wěn)定劑為PEG8000、蔗糖、甘油或者葡萄糖。
[0010]上述技術(shù)方案中穩(wěn)定劑I選自KCl、NaCl、CaCl中的一種或者幾種，其質(zhì)量濃度為
0.5%?10%，這樣的穩(wěn)定劑I具有價格低廉、原料易得的優(yōu)點(diǎn)。穩(wěn)定劑2采用離子穩(wěn)定劑和懸浮穩(wěn)定劑配合使用；其中離子穩(wěn)定劑為NaCl、KCl、Na2C03、Na2SCM或者K2S04，懸浮穩(wěn)定劑為PEG8000、蔗糖、甘油或者葡萄糖；其中優(yōu)選NaCl和蔗糖配合使用，這樣可以保持體系長期穩(wěn)定。
[0011]作為優(yōu)化，所述試劑Rl中的防腐劑I為疊氮鈉、硫柳汞或者ProClin300 ;所述試劑R2中的防腐劑2為疊氮鈉、硫柳汞或ProClin300。這樣的防腐劑I和2具有優(yōu)良的防腐殺菌性能。
[0012]作為優(yōu)化，所述試劑Rl中的增凝劑為PEG8000或者葡聚糖。優(yōu)選PEG8000，是由于PEG8000屬于非離子型水溶性聚合物，在水中的溶解性比較大，可以調(diào)節(jié)試劑Rl的粘度，促進(jìn)抗原和抗體分子結(jié)合為復(fù)合物。
[0013]作為優(yōu)化，所述試劑R2中的聚苯乙烯乳膠微球的表面官能團(tuán)為氨基、羧基、酰肼、醒基或環(huán)氧基，聚苯乙烯乳膠微球的的粒徑在100?600nm。優(yōu)選表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球，這是由于聚苯乙烯膠乳微球表面為羧基的官能團(tuán)很容易被EDC活化，從而快速與PCT抗體結(jié)合，增加偶聯(lián)效果，保證測試結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。
[0014]作為優(yōu)化，所述試劑R2中的PCT抗體為鼠抗人PCT抗體、山羊抗人降鈣素原IgG抗體或兔抗人降鈣素原IgG抗體的一種或者幾種。
[0015]作為優(yōu)化，所述試劑Rl中的保護(hù)劑I為牛血清白蛋白；所述試劑R2中的保護(hù)劑2為牛血清白蛋白。本技術(shù)方案中的保護(hù)劑I和2可以保護(hù)聚苯乙烯膠乳顆粒表面的PCT抗體的活性。
[0016]作為優(yōu)化,所述EDTA的濃度為10?100mmol/L。
[0017]作為優(yōu)化，所述降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，采用如下方法制備: (1)試劑Rl的制備:
在緩沖液I中加入穩(wěn)定劑1、增凝劑、防腐劑1、保護(hù)劑I和EDTA，攪拌混合均勻，即得試劑Rl ;
(2)試劑R2的制備:
步驟一:將PCT抗體進(jìn)行4°C透析，再用緩沖液將PCT抗體稀釋至2mg/ml，得到PCT抗體稀釋液；將聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水離心、洗滌3次；
步驟二:用緩沖液將經(jīng)過步驟一洗滌后的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%，再加入質(zhì)量濃度為0.01%-0.1%的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后15000rpm離心洗滌以除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)30min，再加入終止液終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液15000rpm離心，用緩沖液2洗滌沉淀，重復(fù)離心洗滌3次，最后加入緩沖液2、防腐劑、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
1.采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，當(dāng)血液中的PCT與PCT抗體反應(yīng)時，帶動了聚苯乙烯膠乳聚集產(chǎn)生一定的濁度，而濁度與血液中的PCT含量在一定范圍內(nèi)成正比，可以在400?SOOnm的波長下進(jìn)行檢測，檢測更為方便，容易在臨床中應(yīng)用。
[0019]2.聚苯乙烯膠乳微球的表面官能團(tuán)為氨基、羧基、酰肼或者環(huán)氧基等，其表面的官能團(tuán)可以和抗體表面的氨基等結(jié)合形成共價偶聯(lián)結(jié)構(gòu)，使PCT抗體牢固的結(jié)合在膠乳微球表面，保證了 R2的穩(wěn)定性，延長了試劑有效期。
[0020]3.采用粒徑為100?600nm的大顆粒聚苯乙烯膠乳顆粒，具有較大的粒徑，增加了血液中PCT和PCT抗體反應(yīng)時的濁度，從而增加測試反應(yīng)的靈敏度、縮短了反應(yīng)時間，其檢測范圍為0.24?80ng/ml。
[0021]4.試劑R2中采用離子穩(wěn)定劑和懸浮穩(wěn)定劑結(jié)合使用，使試劑的電荷平衡狀態(tài)，提高了降鈣素原PCT膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的穩(wěn)定性，使得降鈣素原PCT膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的穩(wěn)定性可達(dá)18個月。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明降鈣素原試劑盒實(shí)施例的校準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】和實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0024]實(shí)施例1:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取 23.83g Hepes,9g NaCl、15g PEG8000、0.5g 疊氮鈉、5g 牛血清白蛋白和 14.21gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0025](2)試劑R2的制備:
第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用lOOmmol/L的PBS緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗漆。
[0026]第二步:再用pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入50g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用用蒸懼水離心洗漆3次,再加入緩沖液2、50g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、9g NaCl和80g鹿糖,攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0027]實(shí)施例2:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取23.83g H印es、30g NaClUOOg PEG8000、0.5g疊氮鈉、50g牛血清白蛋白和 14.21gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0028](2)試劑R2的制備:
第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為500mmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用500mmol/L的PBS緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗漆。
[0029]第二步:再用pH為7.4、濃度為50011111101/1的？85緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入50g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用蒸懼水離心洗漆3次,再加入緩沖液2、50g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、9g NaCl和80g鹿糖,攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0030]實(shí)施例3:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取 23.83g H印es、20g NaCl、80g PEG8000、0.5g疊氮鈉、50g牛血清白蛋白和 14.21gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0031](2)試劑R2的制備:
第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為500mmol/L的Ifepes緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用500mmol/L的Hepes緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗滌。
[0032]第二步:再用pH為7.4、濃度為500mmol/L的Ifepes緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入60g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用蒸懼水離心洗漆3次,再加入緩沖液2、60g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、30g NaCl和80g蔗糖，攪拌混合均勻即得試劑R2。[0033]
實(shí)施例4:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取 23.83g H印es、50g NaCl、60g PEG8000、0.5g疊氮鈉、50g牛血清白蛋白和 14.21gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0034](2)試劑R2的制備:
第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用lOOmmol/L的PBS緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗漆。
[0035]第二步:再用pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入25g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用蒸餾水離心洗滌3次，再加入緩沖液2、30g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、20g NaCl和75g蔗糖，攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0036]實(shí)施例5:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取 20.9g M0PS、9g NaCl、50g PEG8000、0.5g 疊氮鈉、50g 牛血清白蛋白和 14.21gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0037](2)試劑R2的制備:
第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用lOOmmol/L的PBS緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗漆。
[0038]第二步:再用pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入25g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用蒸餾水離心洗滌3次，再加入緩沖液2、40g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、30g NaCl和50g鹿糖,攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0039]實(shí)施例6:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取 20.9g M0PS、20g NaCl、50g PEG8000、0.5g 疊氮鈉、25g 牛血清白蛋白和 14.21gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0040](2)試劑R2的制備: 第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用lOOmmol/L的PBS緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗漆。
[0041]第二步:再用pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入50g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用蒸懼水離心洗漆3次,再加入緩沖液2、50g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、40g NaCl和75g鹿糖,攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0042]實(shí)施例7:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取 20.9g M0PS、30g NaCl、60g PEG8000、0.5g 疊氮鈉、75g 牛血清白蛋白和 14.21gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0043](2)試劑R2的制備:
第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用lOOmmol/L的PBS緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗漆。
[0044]第二步:再用pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入50g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用蒸懼水離心洗漆3次,再加入緩沖液2、75g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、50g NaCl和75g蔗糖，攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0045]實(shí)施例8:
一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，包含如下制備步驟:
(I)試劑Rl的制備:
稱取 20.9g M0PS、50g NaCl、80g PEG8000、0.5g 疊氮鈉、50g 牛血清白蛋白和 7.05gEDTA溶于0.8L蒸餾水中，調(diào)pH至7.4，定溶IL即得試劑Rl。
[0046](2)試劑R2的制備:
第一步:在鼠抗人PCT抗體中加入pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析，中間換水3次后完成透析，采用lOOmmol/L的PBS緩沖液將鼠抗人PCT抗體稀釋至濃度為2mg/ml的鼠抗人PCT抗體稀釋液；將表面官能團(tuán)為羧基的聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水洗漆。
[0047]第二步:再用pH為7.4、濃度為lOOmmol/L的PBS緩沖液將上述洗滌過的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%。向IL上述膠乳稀釋液中加入0.0lg的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后離心并用PBS緩沖液洗滌除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的鼠抗人PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)Ih后，再加入75g牛血清白蛋白終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液于15000rpm的轉(zhuǎn)速下用蒸懼水離心洗漆3次,再加入緩沖液2、50g牛血清白蛋白、0.5g疊氮鈉、60g NaCl和75g鹿糖,攪拌混合均勻即得試劑R2。
[0048]測試結(jié)果:
對上述8個實(shí)施例制備的試劑用貝克曼AU480全自動生化儀進(jìn)行測試，測試波長為570nm，副波長800nm，取樣本或校準(zhǔn)品20uL，再加入150uL的試劑R1，37°C恒溫5min，然后加入試劑R2，20s后讀取吸光度Al，37°C孵育4分40秒后讀取吸光度A2，則反應(yīng)吸光度ΔΑ=Α2-Α1 ;首先使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多點(diǎn)定標(biāo)，并用樣條函數(shù)進(jìn)行計(jì)算，得到定標(biāo)曲線，如圖1所示。樣本通過其吸光度變化，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比即可得到樣本中PCT濃度。對上述8個實(shí)施例進(jìn)行了分析靈敏度、準(zhǔn)確度、精密性以及穩(wěn)定性等進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如表1所示:
表1:測試結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，包括試劑Rl和試劑R2兩種組分，所述試劑Rl主要由緩沖液1、穩(wěn)定劑1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護(hù)劑I組成；所述試劑R2主要由交聯(lián)PCT抗體的聚苯乙烯膠乳微球、緩沖液2、穩(wěn)定劑2、防腐劑2、保護(hù)劑2組成，其中聚苯乙烯膠乳微球與PCT抗體之間以共價交聯(lián)方式連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl中的緩沖液I選自Hepes緩沖液、Tris-HCl緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼砂緩沖液中的一種或幾種，其PH為7.0~9.0，濃度為25~500mmol/L ； 所述試劑R2中的緩沖液2選自PBS緩沖液、硼砂緩沖液、甘氨酸緩沖液、Hepes緩沖液、GOODS緩沖液、MOPS緩沖液中的一種或幾種，其pH為7.0~9.0，濃度為25~500mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl中的穩(wěn)定劑I選自KC1、NaCl, CaCl中的一種或者幾種，其質(zhì)量濃度為0.5%~10% ； 所述試劑R2中的穩(wěn)定劑2采用離子穩(wěn)定劑和懸浮穩(wěn)定劑配合使用；其中離子穩(wěn)定劑為NaCl、KCl、Na2C03、Na2S04或者K2S04，懸浮穩(wěn)定劑為PEG8000、蔗糖、甘油或者葡萄糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl中的防腐劑I為疊氮鈉、硫柳汞或者ProClin300 ； 所述試劑R2中的防腐劑2為疊氮鈉、硫柳汞或ProCl in300。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl中的增凝劑為PEG8000或者葡聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述`的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中的聚苯乙烯乳膠微球的表面官能團(tuán)為氨基、羧基、酰肼、醛基或環(huán)氧基，聚苯乙烯乳膠微球的的粒徑在100~600nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中的PCT抗體為鼠抗人PCT抗體、山羊抗人降鈣素原IgG抗體或兔抗人降鈣素原IgG抗體的一種或者幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl中的保護(hù)劑I為牛血清白蛋白；所述試劑R2中的保護(hù)劑2為牛血清白蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述EDTA的濃度為10~100mmol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，采用如下方法制備: (1)試劑Rl的制備: 在緩沖液I中加入穩(wěn)定劑1、增凝劑、防腐劑1、保護(hù)劑I和EDTA，攪拌混合均勻，即得試劑Rl ; (2)試劑R2的制備: 步驟一:將PCT抗體進(jìn)行4°C透析，再用緩沖液將PCT抗體稀釋至2mg/ml，得到PCT抗體稀釋液；將聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水離心、洗滌3次； 步驟二:用緩沖液將經(jīng)過步驟一洗滌后的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質(zhì)量濃度為1%，再加入質(zhì)量濃度為0.01%-0.1%的EDC，在室溫下攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后15000rpm離心洗滌以除去未反應(yīng)的EDC，然后加入步驟一得到的PCT抗體稀釋液，室溫下攪拌反應(yīng)30min，再加入終止液終止反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液15000rpm離心，用緩沖液2洗滌沉淀，重復(fù)離心洗滌3次，最后加入緩沖液2、 防腐劑、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑攪拌混合均勻即得試劑R2。
【文檔編號】G01N33/68GK103558400SQ201310601388
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】李民友, 潘能科, 高昂 申請人:重慶中元生物技術(shù)有限公司