一種快速檢測血漿中豬附紅細(xì)胞體的膠體金試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括底層的支撐層和中間層的吸附層，吸附層固定在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、紅細(xì)胞過濾膜、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。在所述的纖維素膜層中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線，采用這種結(jié)構(gòu)的試紙條具有特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，減少投資和檢測成本，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，能廣泛應(yīng)用于基層對于豬附紅細(xì)胞體的檢測。
【專利說明】一種快速檢測血漿中豬附紅細(xì)胞體的膠體金試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及了一種豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]豬附紅細(xì)胞體病(eperythrozoonosis)是由豬附紅細(xì)胞體(Mycoplasma suis, Μ.SUis)寄生于豬紅細(xì)胞表面、血漿、骨髓及腦脊液所引起的一種人獸共患病，一般呈隱性感染，在豬群中的感染率高達(dá)90%以上，急性發(fā)病時一般表現(xiàn)為貧血、黃疸、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、母豬流產(chǎn)等癥狀。附紅細(xì)胞體在伯杰氏手冊中被劃分為立克次氏體，但目前國際上根據(jù)對其16sRNA的序列的研究，普遍認(rèn)為其屬于支原體。附紅細(xì)胞體是1928年被Schilling和Dinger同時在嚙齒類動物中發(fā)現(xiàn)；1932年Doyle等(1932)在印度報道了豬的附紅細(xì)胞體?。?950年Splitter(1950)正式命名引起豬黃疸型貧血病的附紅細(xì)胞體為豬附紅細(xì)胞體；據(jù)報道發(fā)現(xiàn)附紅細(xì)胞體對豬的感染率可達(dá)到90% (張守發(fā)等，2003)。迄今為止，該病遍布美、歐、亞、非等世界各地。上世紀(jì)八十年代在中國首次發(fā)現(xiàn)M.suis，近幾年引起大規(guī)模的爆發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長期以來，由于M.suis無法在體外進(jìn)行長期連續(xù)培養(yǎng)(Nonaka N等，1996)以及M.suis本身的一些特殊性，在很大程度上限制了對M.suis的研究。至今，還沒有該病的疫苗在生產(chǎn)或臨床中應(yīng)用。
[0003]根據(jù)豬的臨床癥狀可對豬附紅細(xì)胞體病做出初步診斷，最后確診該病還有賴于實驗室檢查。目前，對M.suis的檢測方法主要方法有:(I)采用血液鏡檢技術(shù):臨床上多以采集豬末梢血液壓滴玻片法或血液圖片染色鏡檢法來檢測血漿中和紅細(xì)胞上的附紅細(xì)胞體，但該方法準(zhǔn)確性和敏感性均較低，主觀臆斷性大；(2)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中的特異抗體，此方法比鏡檢法簡便、特異、敏感，但由于需要大量的試劑和儀器，需要專業(yè)技術(shù)人員的操作等因素，使得該方法不便于普遍推廣應(yīng)用，尤其不適合基層人員的現(xiàn)場應(yīng)用。因此，迫切需要研發(fā)一種比ELISA更簡便、快速而實用的豬附紅細(xì)胞體的快速診斷方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的諸多不足之處，本發(fā)明提供了一種全新的膠體金試紙條，具體涉及了一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括底層的支撐層和中間層的吸附層，吸附層固定在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、紅細(xì)胞過濾膜、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。在所述的纖維素膜層中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線，采用這種結(jié)構(gòu)的試紙條具有特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，減少投資和檢測成本，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，能廣泛應(yīng)用于基層對于豬附紅細(xì)胞體的檢測。
[0005]本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案是:
[0006]一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括支撐層和吸附層，吸附層固定在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、紅細(xì)胞過濾膜、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。在所述的纖維素膜層中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線，所述的纖維素膜層一端嵌入金標(biāo)抗體纖維層，另一端嵌入吸水材料層中。
[0007]其中，所述的支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑料條制成；
[0008]所述的測試端的樣品吸附纖維層用玻璃纖維制成；
[0009]所述的金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的高純度的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體:豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體；
[0010]所述的纖維素膜層用硝酸纖維素膜或純纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；
[0011 ] 所述的吸水材料層用吸水紙制成；
[0012]上述的各種材料以及紅細(xì)胞過濾膜均為市購。
[0013]而檢測線中所采用的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體為豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，該單克隆抗體利用2012年6月15日公開在中國知網(wǎng)碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫中的《應(yīng)用重組MSGl蛋白檢測豬附紅細(xì)胞體抗體的ELISA方法的建立及其單克隆抗體的制備》的研究內(nèi)容制備獲得的。
[0014]本發(fā)明所述膠體金試紙條的制備方法如下:具體步驟: [0015]I)在纖維素膜層的不用位置上分別包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體和羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗，分別形成檢測線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為0.5-2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液按l-2ul/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線，將包被濃度為0.5-2mg/ml的羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗按l_2ul/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥30-60min，從而制備得到檢測線和質(zhì)控線；
[0016]其中所述的0.5-2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液為將抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體用PH為8.5,0.02M的PBS緩沖液稀釋獲得的；
[0017]2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在100ml沸騰的0.01-0.02wt%氯金酸水溶液中加入l_3ml的0.1_^^%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在10-25nm左右的膠體金；
[0018]通過直接混合的方式以0.2!1101/1的K2CO3溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至8.0-9.5，以1:1000-1500的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000 水溶液;至 PEG10000 的終濃度為 0.05-0.lwt%，4°C、3000rpm 離心 30min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、10000-13000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體；
[0019]其中所采用的10wt9^^PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用雙蒸水把它稀釋成10wt%的水溶液獲得的；之后利用上述獲得的10wt%的PEG10000溶液加入到標(biāo)記后的膠體金溶液中，利用膠體金溶液對其進(jìn)行稀釋，使PEG10000的最終濃度變成0.05-0.lwt%即可；
[0020]按mg/ml為 1:10-1000 的的比例用含 0.l_2wt%BSA 的 0.001-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥；[0021 ] 3 )按前述順序采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)抗體纖維層、吸水材料層、紅細(xì)胞過濾膜和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試紙條中采用了抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體作為檢測線的包被物，較之享有的多克隆抗體檢測的敏感性和特異性更高；另外，本發(fā)明采用了金標(biāo)抗體纖維層，這樣更有利于豬附紅細(xì)胞體與包被在金標(biāo)抗體纖維層中的單克隆抗體的結(jié)合，并且金標(biāo)抗體纖維層更有利于金標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的釋放，大大縮短了檢測時間；
[0023]除此之外，發(fā)明人在該試紙條的制備過程中用pH為8.5，0.02M的PBS緩沖液作為稀釋液，較之現(xiàn)有的常規(guī)稀釋液可以保持抗體本身的活性，增加抗體的穩(wěn)定性，從而提高檢測的敏感性；而在金標(biāo)抗體溶液制備過程中加入了 PEG10000作為保護(hù)劑，有利于增加金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性，可以進(jìn)一步延長試紙條的使用期限，從而取得更好的價值。
[0024]利用上述的試紙條，可用來檢測豬的血漿樣品，由于檢測線和質(zhì)控線能夠產(chǎn)生特異功能，從而滿足廣大基層檢測的需求，在試紙條的檢測線和質(zhì)控線位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶為陽性結(jié)果；僅試紙條的質(zhì)控線位置上出現(xiàn)一條紫紅色條帶為陰性結(jié)果；在試紙條的檢測線和質(zhì)控線位置上均未出現(xiàn)紫紅色條帶為無效結(jié)果。
[0025]綜上所述，采用這種結(jié)構(gòu)的試紙條具有特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，減少投資和檢測成本，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，能廣泛應(yīng)用于基層對于豬附紅細(xì)胞體的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明所述試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027]圖中I為樣品吸附纖維層，2為紅細(xì)胞過濾膜，3為金標(biāo)抗體纖維層，4為檢測線，5為質(zhì)控線，6為纖維素膜層，7為吸水材料層，8為支撐層。
【具體實施方式】
[0028]實施例1
[0029]一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括支撐層8和吸附層，吸附層固定在支撐層8上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層1、紅細(xì)胞過濾膜2、金標(biāo)抗體纖維層3、纖維素膜層6及吸水材料層7，在所述的纖維素膜層6中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線4和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線5 ;所述的纖維素膜層6 —端嵌入金標(biāo)抗體纖維層3，另一端嵌入吸水材料層7中。
[0030]其中，所述的支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑料條制成；
[0031]所述的測試端的樣品吸附纖維層用玻璃纖維制成；
[0032]所述的金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的高純度的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，該單克隆抗體利用2012年6月15日公開在中國知網(wǎng)碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫中的《應(yīng)用重組MSGl蛋白檢測豬附紅細(xì)胞體抗體的ELISA方法的建立及其單克隆抗體的制備》的研究內(nèi)容制備獲得的；
[0033]所述的纖維素膜層用硝酸纖維素膜或純纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；
[0034]所述的吸水材料層用吸水紙制成；
[0035]上述的各種材料以及紅細(xì)胞過濾膜均為市購。[0036]而檢測線中所采用的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體也為選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，
[0037]本發(fā)明所述膠體金試紙條的制備方法如下:
[0038]具體步驟如下:
[0039]I)在纖維素膜層的不用位置上分別包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體和羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗，分別形成檢測線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為0.5-2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液按l-2ul/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線，將包被濃度為0.5-2mg/ml的羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗按l_2ul/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥30-60min，從而制備得到檢測線和質(zhì)控線；
[0040]其中所述的0.5-2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液為將抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體用PH為8.5,0.02M的PBS緩沖液稀釋獲得的；
[0041]2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在100ml沸騰的0.01-0.02wt%氯金酸水溶液中加入l_3ml的0.1_^^%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在10-25nm左右的膠體金；
[0042]通過直接混合的方式以0.2!1101/1的K2CO3溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至8.0-9.5，以1:1000-1500的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000 水溶液;至 PEG10000 的終濃度為 0.05-0.lwt%，4°C、3000rpm 離心 30min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、10000-13000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體；
[0043]其中所采用的10wt%的PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用雙蒸水把它稀釋成10wt%的水溶液獲得的；之后利用上述獲得的10wt%的PEG10000溶液加入到標(biāo)記后的膠體金溶液中，利用膠體金溶液對其進(jìn)行稀釋，使PEG10000的最終濃度變成0.05-0.lwt%即可；`
[0044]按mg/ml為 1:10-1000 的的比例用含 0.l_2wt%BSA 的 0.001-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥；
[0045]3 )按前述順序采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)抗體纖維層、吸水材料層、紅細(xì)胞過濾膜和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
[0046]實施例2
[0047]一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括支撐層8和吸附層，吸附層固定在支撐層8上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層1、紅細(xì)胞過濾膜2、金標(biāo)抗體纖維層3、纖維素膜層6及吸水材料層7，在所述的纖維素膜層6中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線4和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線5 ;所述的纖維素膜層6 —端嵌入金標(biāo)抗體纖維層3，另一端嵌入吸水材料層7中。
[0048]其中，所述的支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑料條制成；
[0049]所述的測試端的樣品吸附纖維層用玻璃纖維制成；
[0050]所述的金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的高純度的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，該單克隆抗體利用2012年6月15日公開在中國知網(wǎng)碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫中的《應(yīng)用重組MSGl蛋白檢測豬附紅細(xì)胞體抗體的ELISA方法的建立及其單克隆抗體的制備》的研究內(nèi)容制備獲得的；
[0051]所述的纖維素膜層用硝酸纖維素膜或純纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；
[0052]所述的吸水材料層用吸水紙制成；
[0053]上述的各種材料以及紅細(xì)胞過濾膜均為市購。
[0054]而檢測線中所采用的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體也為選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，
[0055]本發(fā)明所述膠體金試紙條的制備方法如下:
[0056]具體步驟如下:
[0057]I)在纖維素膜層的不用位置上分別包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體和羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗，分別形成檢測線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液按2ul/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線，將包被濃度為2mg/ml的羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗按2ul/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥60min，從而制備得到檢測線和質(zhì)控線；
[0058]其中所述的2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液為將抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體用PH為8.5, 0.02M的PBS緩沖液稀釋獲得的；
[0059]2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在100ml沸騰的0.02wt%氯金酸水溶液中加入3ml的lwt%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在25nm左右的膠體金；
[0060]通過直接混合的方式以0.2!1101/1的K2CO3溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至8.0-9.5，以1:1500的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的終濃度為0.lwt%，4°C、3000rpm離心30min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、13000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體；
[0061]其中所采用的10wt9^^PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用雙蒸水把它稀釋成10wt%的水溶液獲得的；之后利用上述獲得的10wt%的PEG10000溶液加入到標(biāo)記后的膠體金溶液中，利用膠體金溶液對其進(jìn)行稀釋，使PEG10000的最終濃度變成0.05-0.lwt%即可；
[0062]按mg/ml為1:1000的的比例用含2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥；
[0063]3 )按前述順序采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)抗體纖維層、吸水材料層、紅細(xì)胞過濾膜和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
[0064]實施例3
[0065]一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括支撐層8和吸附層，吸附層固定在支撐層8上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層1、紅細(xì)胞過濾膜2、金標(biāo)抗體纖維層3、纖維素膜層6及吸水材料層7，在所述的纖維素膜層6中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線4和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線5 ;所述的纖維素膜層6 —端嵌入金標(biāo)抗體纖維層3，另一端嵌入吸水材料層7中。[0066]其中，所述的支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑料條制成；
[0067]所述的測試端的樣品吸附纖維層用玻璃纖維制成；
[0068]所述的金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的高純度的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，該單克隆抗體利用2012年6月15日公開在中國知網(wǎng)碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫中的《應(yīng)用重組MSGl蛋白檢測豬附紅細(xì)胞體抗體的ELISA方法的建立及其單克隆抗體的制備》的研究內(nèi)容制備獲得的；
[0069]所述的纖維素膜層用硝酸纖維素膜或純纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成； [0070]所述的吸水材料層用吸水紙制成；
[0071]上述的各種材料以及紅細(xì)胞過濾膜均為市購。
[0072]而檢測線中所采用的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體也為選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，
[0073]本發(fā)明所述膠體金試紙條的制備方法如下:
[0074]具體步驟如下:
[0075]I)在纖維素膜層的不用位置上分別包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體和羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗，分別形成檢測線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為0.5mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液按lul/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線，將包被濃度為0.5mg/ml的羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗按lul/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥30min，從而制備得到檢測線和質(zhì)控線；
[0076]其中所述的0.5mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液為將抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體用PH為8.5,0.02M的PBS緩沖液稀釋獲得的；
[0077]2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在100ml沸騰的0.01wt%氯金酸水溶液中加入Iml的0.lwt%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在IOnm左右的膠體金；
[0078]通過直接混合的方式以0.2mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至8.0-9.5，以1:1000的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的終濃度為0.05wt%, 4°C >3000rpm離心30min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、1000Orpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體；
[0079]其中所采用的10wt9^^PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用雙蒸水把它稀釋成10wt%的水溶液獲得的；之后利用上述獲得的10wt%的PEG10000溶液加入到標(biāo)記后的膠體金溶液中，利用膠體金溶液對其進(jìn)行稀釋，使PEG10000的最終濃度變成0.05-0.lwt%即可；
[0080]按mg/ml為1:10的的比例用含0.lwt%BSA的0.001mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥；
[0081 ] 3 )按前述順序采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)抗體纖維層、吸水材料層、紅細(xì)胞過濾膜和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
[0082]實施例4
[0083]一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括支撐層8和吸附層，吸附層固定在支撐層8上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層1、紅細(xì)胞過濾膜2、金標(biāo)抗體纖維層3、纖維素膜層6及吸水材料層7，在所述的纖維素膜層6中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線4和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線5 ;所述的纖維素膜層6 —端嵌入金標(biāo)抗體纖維層3，另一端嵌入吸水材料層7中。
[0084]其中，所述的支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑料條制成；
[0085]所述的測試端的樣品吸附纖維層用玻璃纖維制成；
[0086]所述的金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的高純度的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，該單克隆抗體利用2012年6月15日公開在中國知網(wǎng)碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫中的《應(yīng)用重組MSGl蛋白檢測豬附紅細(xì)胞體抗體的ELISA方法的建立及其單克隆抗體的制備》的研究內(nèi)容制備獲得的；
[0087]所述的纖維素膜層用硝酸纖維素膜或純纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；
[0088]所述的吸水材料層用吸水紙制成；
[0089]上述的各種材料以及紅細(xì)胞過濾膜均為市購。
[0090]而檢測線中所采用的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體也為選自豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體，
[0091]本發(fā)明所述膠體金試紙條的制備方法如下: [0092]具體步驟如下:
[0093]I)在纖維素膜層的不用位置上分別包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體和羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗，分別形成檢測線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為lmg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液按1.5ul/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線，將包被濃度為1.5mg/ml的羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗按1.5ul/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥40min，從而制備得到檢測線和質(zhì)控線；
[0094]其中所述lmg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液為將抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體用pH為8.5,0.02M的PBS緩沖液稀釋獲得的；
[0095]2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在100ml沸騰的0.02wt%氯金酸水溶液中加入2ml的0.5wt%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在15nm左右的膠體金；
[0096]通過直接混合的方式以0.2!1101/1的K2CO3溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至8.0-9.5，以1:1300的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的終濃度為0.08wt%, 4°C >3000rpm離心30min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、12000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體；
[0097]其中所采用的10wt9^^PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用雙蒸水把它稀釋成10wt%的水溶液獲得的；之后利用上述獲得的10wt%的PEG10000溶液加入到標(biāo)記后的膠體金溶液中，利用膠體金溶液對其進(jìn)行稀釋，使PEG10000的最終濃度變成0.05-0.lwt%即可；
[0098]按mg/ml為1:100的的比例用含lwt%BSA的0.lmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥；[0099]3 )按前述順序采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)抗體纖維層、吸水材料層、紅細(xì)胞過濾膜和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
[0100]試驗例I
[0101]2013年10月山東省萊蕪市某養(yǎng)豬場發(fā)生以貧血、黃疸、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大為主要發(fā)病特征的傳染病，經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室顯微鏡圖片和PCR方法檢查診斷為豬附紅細(xì)胞體感染；
[0102]發(fā)明人采集病死豬的血漿，利用本發(fā)明實施例1-4制備的試紙條逐條進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陽性，與經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室顯微鏡圖片和PCR方法檢查診斷完全一致，證明本發(fā)明所提供的試紙條不需要任何的設(shè)備，就可以進(jìn)行臨床樣本的檢測，且特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，能廣泛應(yīng)用于基層對于豬附紅細(xì)胞體的檢測。
[0103]試驗例2
[0104]2013年11月新泰市某養(yǎng)豬場發(fā)生以病豬通體發(fā)白、高燒、淋巴結(jié)腫大為主要特征的疾病，經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室PCR檢測為豬附紅細(xì)胞體感染陽性。
[0105]發(fā)明人采集病死豬的血漿，利用本發(fā)明實施例1-4制備的試紙條逐條進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陽性，與經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室PCR方法檢查診斷完全一致，證明本發(fā)明所提供的試紙條不需要任何的設(shè)備，就可以進(jìn)行臨床樣本的檢測，且特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，能廣泛應(yīng)用于基層對于豬附紅細(xì)胞體的檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種血漿中豬附紅細(xì)胞體的快速檢測膠體金試紙條，包括支撐層(8)和吸附層，吸附層固定在支撐層(8)上，其特征在于:吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層(I)、紅細(xì)胞過濾膜(2)、金標(biāo)抗體纖維層(3)、纖維素膜層(6)及吸水材料層(7)，在所述的纖維素膜層(6)中部有一條包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體的檢測線(4)和一條包被羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線(5);所述的纖維素膜層6—端嵌入金標(biāo)抗體纖維層(3)，另一端嵌入吸水材料層(7)中； 所述膠體金試紙條的制備方法如下:具體步驟: 1)在纖維素膜層的不用位置上分別包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體和羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗，分別形成檢測線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為0.5-2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液按l-2ul/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線，將包被濃度為0.5-2mg/ml的羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗按l_2ul/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥30-60min，從而制備得到檢測線和質(zhì)控線； 2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在100ml沸騰的0.01-0.02wt%氯金酸水溶液中加入l_3ml的0.l-lwt%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在10-25nm左右的膠體金； 通過直接混合的方式以0.2mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至8.0-9.5，以1:1000-1500的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的終濃度為0.05-0.lwt%，4°C、3000rpm離心30min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、10000-13000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體； 按mg/ml為I =10-10`00的的比例用含0.l_2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥； 3)按前述順序采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)抗體纖維層、吸水材料層、紅細(xì)胞過濾膜和樣品吸附纖維層既得目標(biāo)試紙條。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于:所述的支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑料條制成；所述的測試端的樣品吸附纖維層用玻璃纖維制成；所述的金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的高純度的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體:豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體；所述的纖維素膜層用硝酸纖維素膜或純纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述的吸水材料層用吸水紙制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于:所述檢測線中所采用的為抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體:豬附紅細(xì)胞體MSGl單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1所述膠體金試紙條的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: 1)在纖維素膜層的不用位置上分別包被抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體和羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗，分別形成檢測線和質(zhì)控線；具體步驟為:將包被濃度為0.5-2mg/ml的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體溶液按l-2ul/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線，將包被濃度為0.5-2mg/ml的羊抗鼠或兔抗鼠IgG的二抗按l_2ul/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質(zhì)控線，37°C下干燥30-60min，從而制備得到檢測線和質(zhì)控線； 2)金標(biāo)抗體纖維層的制備，具體步驟為:以檸檬酸鈉還原法制備金溶液，即在100ml沸騰的0.01-0.02wt%氯金酸水溶液中加入l_3ml的0.l-lwt%檸檬酸三鈉溶液，可獲得直徑在10-25nm左右的膠體金； 通過直接混合的方式以0.2mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)上述獲得的膠體金pH至8.0-9.5，以1:1000-1500的標(biāo)記比例將待標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體加入到上述調(diào)整pH之后的膠體金中，標(biāo)記20min后，再向上述標(biāo)記后的膠體金溶液中加入10wt%的PEG10000水溶液；至PEG10000的終濃度為0.05-0.lwt%，4°C、3000rpm離心30min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、10000-13000rpm離心30min,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體； 按mg/ml為I =10-1000的的比例用含0.l_2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，將上述稀釋后的金標(biāo)抗體液按50ul/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4°C低溫真空干燥； 3)按前述順序采用現(xiàn)有工藝和設(shè)備組裝支撐層、纖維素膜層、金標(biāo)抗體纖維層、吸水材料層、紅細(xì)胞過濾膜和樣品吸附纖維`層既得目標(biāo)試紙條。
【文檔編號】G01N33/577GK103698522SQ201310714094
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月21日
【發(fā)明者】劉建柱, 孟凱 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)