用于表征循環(huán)免疫復(fù)合物的多重層析-免疫測定方法
【專利摘要】因此,本文中報道了用于分析/表征體內(nèi)形成的循環(huán)免疫復(fù)合物(CICs)的方法，所述方法包括獲自被施用至少一次藥物的哺乳動物的樣品的用于確定免疫復(fù)合物的重量/尺寸的尺寸排阻層析,任選地第二種非-SEC層析,和至少一種免疫測定,其中通過將免疫復(fù)合物尺寸和免疫測定結(jié)果/示值讀數(shù)關(guān)聯(lián)來表征免疫復(fù)合物。本文中還報道的是如本文報道的方法用于確定與改變的藥物動力學(xué)的相關(guān)性,用于確定功效的損失或降低,用于確定藥物的天然對應(yīng)物的中和作用,用于確定免疫和超敏反應(yīng)(包括血清病/III型超敏反應(yīng)/免疫復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病)的用途。
【專利說明】用于表征循環(huán)免疫復(fù)合物的多重層析-免疫測定方法
[0001] 本文報道了通過包括尺寸排阻層析(SEC)和免疫測定的多步驟方法用于檢測和表征生物基質(zhì)中的循環(huán)免疫復(fù)合物的(尺寸和組成)的方法。
_2] 發(fā)明背景
[0003]大多數(shù)生物治療劑可以誘導(dǎo)在安全和功效方面具有可能的后果的不需要的免疫應(yīng)答，其中這些響應(yīng)在頻率和嚴(yán)重度方面不同(Buttel，1.C.等，B1logicals39(2011) 100-109 ;C0MMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEAGuideline on Immunogenicity Assessment of B1technology-derived TherapeuticProteins (生物技術(shù)來源的治療性蛋白的免疫原性EMEA評估指南)，http://www.emea.europa.eu (2007))。
[0004]抗藥物抗體(ADA)的形成可以導(dǎo)致改變的藥物動力學(xué)，功效的損失或降低，天然對應(yīng)物(counterpart)的中和作用以及一般免疫和超敏反應(yīng)，包括血清病/III型超敏反應(yīng)/免疫復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病(Buttel, 1.C.等，B1logicals 39(2011) 100-109 ；⑶MMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP)，EMEA Guideline onImmunogenicity Assessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技術(shù)來源的治療性蛋白的免疫原性EMEA評估指南)，http:1Iwm.emea.europa.eu(2007))。
[0005]作為形成ADA-D復(fù)合物的結(jié)果，血清病樣綜合征是公知的不良事件并且對于多種臨床前研究中(Ponce, R.等，Regul.Toxicol.Pharmacol.54(2009) 164-182)和臨床實踐中(COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline onImmunogenicity Assessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技術(shù)來源的治療性蛋白的免疫原性EMEA評估指南)，http:1Iwm.emea.europa.eu (2007)；Dreyfus, D.H.等,Ann.Allergy Asthma Tmmunol.96 (2006) 624-627 ；Gamarra, R.M., J.Emerg.Med.30 (2006) 41-44 ；Goto, S.等,Int.J.Hemato1.89 (2009) 305-309 ；Hansel, T.T.等,Nat.Rev.藥物 Discov.9 (2010) 325-338 ；Pilette, C.等,J.Allergy Clin.1mmunol.120(2007)972-973 ；Tamilvanan, S.等，J.Drug Target 18(2010)489-498)的生物制品已有報道。
[0006]對于投入市場的藥物，臨床診斷主要反應(yīng)(比如血清病或嚴(yán)重過敏反應(yīng))特征。在施用相關(guān)HiAb后出現(xiàn)不良事件的情況下，所述反應(yīng)被歸因于抗體應(yīng)答(COMMITTEEFOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on ImmunogenicityAssessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技術(shù)來源的治療性蛋白的免疫原性EMEA評估指南)，http://www.emea.europa.eu(2007))。的確，僅可以找到研究ADA的形成并與臨床觀察到的信號相關(guān)聯(lián)的非常有限的數(shù)據(jù)(Goto，S.等，Int.J.Hematol.89(2009)305-309)。
[0007]考慮到免疫原性潛在的嚴(yán)重性，EMEA強調(diào)證實和表征ADA形成的重要性(COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP)，EMEA Guideline onImmunogenicity Assessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技術(shù)來源的治療性蛋白的免疫原性EMEA評估指南)，http:1Iwm.emea.europa.eu (2007))。
[0008]典型地使用被設(shè)計以檢測ADA的免疫測定進(jìn)行免疫原性的評估(Mire-Sluis，A.R.等，J.1mmunol.Methods 289 (2004) 1-16 ;Shankar, G.等，J.Pharm.B1med.Anal.48 (2008) 1267-1281 ；Koren, E.等，J.1mmunol.Methods 333 (2008) 1-9)。
[0009]然而，直到現(xiàn)在，ADA發(fā)生率的信息不能使臨床發(fā)現(xiàn)和改變的藥物動力學(xué)深入相關(guān)。
[0010]形成的ADA-藥物復(fù)合物的量和尺寸依賴于數(shù)個參數(shù)，例如ADA和藥物濃度 / 比例以及表位和效價(Abbas, A.K.和 Lichtman, A.H., Diseases caused byimmunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity,于:Saunders (2003)中；Murphy,K.等,Janeway's Immunob1logy,于:Garland Science, Taylor & FrancisGroup,LLC(2008)中)。
[0011]復(fù)合物尺寸和電荷是復(fù)合物清除或誘導(dǎo)不良事件的重要的決定因素。典型地，較大的復(fù)合物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，小的復(fù)合物通常不引發(fā)炎癥，然而中間尺寸的復(fù)合物可以結(jié)合補體并且可以引起組織損傷(Abbas, A.K.和Lichtman, A.H.，Diseases causedby immunity responses:Hypersensitivity and Autoimmunity,于:Saunders(2003)中；Murphy, K.等，Janeway’s Immunob1logy,于:Garland Science, Taylor & FrancisGroup,LLC (2008)中；Mannik, M.，Serum Sickness and pathophys1logy of immunecomplexes,于:Clinical Immunology:Principles and Practices, Rich R.R., FleisherT.A.S.B.D.，Shearer ff.T.，Strober ff.(編輯)1062-1071 (1996)中；Sicherer, S.H.，LeungD.Y.M., Serum Sickness,于:Nelsons textbook of pediatrics, Kliegman R.M., BehrmanR.E., Jenson H.B.J., Stanton B.F.(編輯)，Saunders Elsevier, pp.985-986 (2007)中。此外，復(fù)合物的電荷對于復(fù)合物的組織沉積是重要的因素(Abbas, A.K.和Lichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses:Hypersensitivity and Autoimmunity,于:Saunders(2003)中；Mannik, M., Serum Sickness and pathophys1logy of immunecomplexes,于:Clinical Immunology:Principles and Practices, Rich R.R., FleisherT.A.S.B.D.，Shearer ff.T.，Strober ff.(編輯)1062-1071 (1996)中)。
[0012]對于ADA應(yīng)答的深入評價，應(yīng)該就尺寸和電荷表征可能形成的ADA-藥物復(fù)合物。此外，如果藥物的內(nèi)源對應(yīng)物存在，則形成的ADA是否與這些分子交叉反應(yīng)和內(nèi)源對應(yīng)物是否也是復(fù)合物的一部分的信息是有價值的信息。此外，免疫復(fù)合物中抗原/藥物的結(jié)構(gòu)表征為發(fā)病機理提供信息。
[0013]Coyle等報道了在多發(fā)性硬化腦脊液中檢測和分離免疫復(fù)合物(Journal ofNeuroimmunology 15 (1987) 97-107)。由 Kneba, Μ.,等報道了與 ELISA 技術(shù)聯(lián)合的聚焦層析-用于分析免疫復(fù)合物的靈敏方法(J.1mmunol.Meth.61 (1983) 233-243)。Matousovic, K.,等報道了 IgA腎病患者的尿液中的包含IgA的免疫復(fù)合物(NephrologyDialysis Transplantat1n21 (2006) 2478-2484)。由 Rattan, B.，等報道了從牛痕病毒感染中存活下來的兔中的循環(huán)免疫復(fù)合物(Acta Vir.38(1994) 105-110)。在W02008/031532中報道了抗藥物抗體測定。Stubenrauch，K.，等，報道了以藥物耐受性評價通用免疫測定，以在來自施用人抗體后的稱猴的血清樣品中檢測免疫復(fù)合物(J.Pharm.B1med.Anal.52(2010)249-254)。在W02011/056590中報道了用于檢測抗-TNF藥物和自身抗體的測定。Wang Shui Long等報道了使用新的均相遷移率改變測定(homogeneous mobilityshift assay)對患者血清中對阿達(dá)木單抗(Adalimumab)的抗藥物抗體(ADA)的分析(Am.J.Gastroent.105 (Sup 1，2010) S444-S445。在 EP 2 354 792 中報道了用于檢測抗藥物抗體的方法。Lambert, P.H.，等報道了對于評價用于檢測血清中免疫復(fù)合物的十八種方法的WHO 協(xié)作研究(J.Clin.Lab.1mmunol.1 (1978) 1-15)。由 Levinson, S.S.等報道了用于測量循環(huán)免疫復(fù)合物的方法(Clin.1mmunol.Newsletter 3(1987)39-42)。
[0014]發(fā)明概沭
[0015]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以用于檢測和表征生物基質(zhì)中循環(huán)免疫復(fù)合物(例如包含針對給定藥物的ADA的復(fù)合物)的(尺寸和組成)的、包括使用與至少一種免疫測定聯(lián)合的尺寸排阻層析(SEC)的多步驟方法的方法，可以確定與改變的藥物動力學(xué)的關(guān)聯(lián)性、功效的損失或降低、天然對應(yīng)物的中和作用以及一般免疫和超敏反應(yīng)(包括血清病/III型超敏反應(yīng)/免疫復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病)。
[0016]如本文報道的一個方面是用于分析/表征體內(nèi)形成的循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)的方法，所述方法包括:
[0017]a)樣品的尺寸排阻層析，其用于確定免疫復(fù)合物的重量/尺寸，所述樣品獲自已經(jīng)被施用藥物至少一次的哺乳動物，
[0018]b)任選地第二種非-SEC層析，
[0019]c)至少一種免疫測定，和
[0020]d)任選地基于質(zhì)譜法的分析，
[0021]其中通過將免疫復(fù)合物尺寸和免疫測定或質(zhì)譜法測定結(jié)果/示值讀數(shù)(read-out)相關(guān)聯(lián)來表征所述免疫復(fù)合物。
[0022]如本文報道的一個方面是用于分析確定體內(nèi)形成的包含(外源)治療性多肽和內(nèi)源抗藥物抗體的循環(huán)復(fù)合的抗藥物抗體免疫復(fù)合物的方法，所述方法包括
[0023]a)樣品的尺寸排阻層析，其用于確定免疫復(fù)合物的重量/尺寸，所述樣品獲自已經(jīng)被施用藥物至少一次的哺乳動物，
[0024]b)任選地第二種非-SEC層析，
[0025]c)用于檢測抗藥物抗體的至少一種多相(heterogeneous)免疫測定，和
[0026]d)和任選地基于質(zhì)譜法的分析，
[0027]其中通過將免疫復(fù)合物尺寸和免疫測定或質(zhì)譜法測定示值讀數(shù)/結(jié)果相關(guān)聯(lián)來表征所述免疫復(fù)合物，
[0028]其中所述治療性多肽是合成的或非天然存在的治療性多肽。
[0029]在所有方面的一個實施方案中，所述樣品是血清或腦脊液。
[0030]在所有方面的一個實施方案中，所述免疫復(fù)合物是藥物特異的免疫復(fù)合物。
[0031]藥物特異的免疫復(fù)合物包括與其它非藥物分子一起的藥物。
[0032]在所有方面的一個實施方案中，所述免疫測定選自包括以下各項的組:抗藥物抗體檢測測定，中和藥物的抗體的檢測測定，藥物動力學(xué)測定(藥物定量測定)，抗體同種型測定，用于確定對內(nèi)源藥物對應(yīng)物(counterpart)的ADA交叉反應(yīng)性的測定(如果所述藥物包含也內(nèi)源存在于哺乳動物中的部分)，補體結(jié)合測定(結(jié)合的補體或?qū)τ谘a體的結(jié)合能力)，用于確定包含在免疫復(fù)合物內(nèi)的藥物的內(nèi)源對應(yīng)物的測定(如果所述藥物包含也內(nèi)源存在于哺乳動物中的部分)。
[0033]在所有方面的一個實施方案中，所述免疫測定是均相(homogeneous)免疫測定或多相免疫測定。在一個實施方案中，所述免疫測定是放射免疫測定(RIA)，或酶免疫測定(EIA, ELISA, EMIT),或熒光偏振免疫測定(FPIA)，或發(fā)光免疫測定(LIA)，或免疫放射免疫測定(IRMA)，或微珠酶免疫測定(MEIA)，或酶聯(lián)熒光測定(ELFA)，或凝集素酶免疫測定(LEIA)，或免疫熒光測定(IFA)，或電化學(xué)發(fā)光測定(ECLIA)，或免疫磁性電化學(xué)發(fā)光測定(MECL)，或化學(xué)發(fā)光斑點-免疫結(jié)合測定(CDIA)，或濁度測定，或顆粒增強免疫比濁測定。在一個實施方案中，所述免疫測定是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，或電化學(xué)發(fā)光測定(ECLIA)，或化學(xué)發(fā)光斑點-免疫結(jié)合測定(CDIA)，或熒光偏振免疫測定(FPIA)，或濁度測定，或顆粒增強免疫比濁測定。
[0034]在所有方面的一個實施方案中，所述第二種非-SEC層析是離子交換層析(陽離子-或陰離子交換層析)，或反相層析，或親水相互作用層析(HILIC)，或疏水相互作用層析(HIC)，或疏水性電荷相互作用層析(HCIC)，或限制訪問材料層析(restricted accessmaterial chromatography, (RAMC))。
[0035]在所有方面的一個實施方案中，所述尺寸排阻層析是以級分(in fract1ns)收集洗脫物的尺寸排阻層析。在一個實施方案中在免疫測定中分析各個級分。
[0036]在所有方面的一個實施方案中，進(jìn)一步通過以等分部分(in aliquots)收集洗脫物的第二種非-SEC層析分離尺寸排阻層析的級分中的至少一個。在一個實施方案中在免疫測定中分析各個級分。在一個實施方案中，通過第二種非-SEC層析分析尺寸排阻層析中的各個級分。
[0037]在所有方面的一個實施方案中所述級分是等分部分。
[0038]在所有方面的一個實施方案中所述免疫測定是酶聯(lián)免疫吸附測定。
[0039]在所有方面的一個實施方案中，所述至少一種免疫測定是一種，或兩種，或三種，或四種，或五種，或六種免疫測定。
[0040]在所有方面的一個實施方案中，所述免疫測定是抗藥物抗體免疫測定。
[0041]在所有方面的一個實施方案中，免疫測定中的至少一種是橋接(bridging)酶聯(lián)免疫吸附測定。
[0042]陽性橋接酶聯(lián)免疫吸附測定指所述抗藥物抗體是ADA-D復(fù)合物的一部分。在較高分子量級分中(即在尺寸排阻層析的初期洗脫級分中)檢測抗藥物抗體，指所述抗藥物抗體是較高分子量復(fù)合物的一部分。
[0043]在所有方面的一個實施方案中，酶聯(lián)免疫吸附測定中至少一種是用于檢測ADA-D復(fù)合物的復(fù)合物測定。在一個實施方案中，所述復(fù)合物測定包括藥物特異的捕獲抗體和作為檢測抗體的抗物種(ant1-species)特異性抗體。
[0044]在所有方面的一個實施方案中，免疫測定中至少一種是用于檢測結(jié)合于藥物和/或結(jié)合于藥物的內(nèi)源對應(yīng)物的抗藥物抗體的直接測定。在一個實施方案中，所述直接測定包括作為捕獲分子的固定化的藥物或藥物的內(nèi)源對應(yīng)物和作為檢測抗體的抗物種特異性抗體。
[0045]所述直接測定利用通過尺寸排阻層析移除游離抗藥物抗體后，結(jié)合于樣品中藥物和/或內(nèi)源對應(yīng)物的抗藥物抗體和固定化的藥物的平衡的建立。
[0046]在所有方面的一個實施方案中，所述藥物表面覆層(coating)是稠密的藥物表面覆層。
[0047]通過稠密的表面覆層，(使用抗藥物抗體的親和力)正好引起平衡向與表面結(jié)合的藥物結(jié)合的方向移動。
[0048]在所有方面的一個實施方案中，在免疫測定中將所述樣品孵育達(dá)16至32個小時的時間段。
[0049]如本文報道的一個方面是用于從ADA-D復(fù)合物分離藥物以增加隨后的ADA測定/免疫測定的藥物耐受性的方法。同樣如本文報道的方法可以用于增加免疫測定的藥物耐受性。
[0050]如本文報道的一個方面是用于表征體內(nèi)形成的抗藥物抗體-藥物(ADA-D)復(fù)合物的方法，所述方法包括
[0051]a)樣品的尺寸排阻層析，其用于確定ADA-D復(fù)合物的重量/尺寸，所述樣品獲自已經(jīng)被施用藥物至少一次的哺乳動物，
[0052]b)用于檢測抗藥物抗體的至少一種酶聯(lián)免疫吸附測定，
[0053]其中所述免疫復(fù)合物表征為
[0054]-通過陽性酶聯(lián)免疫吸附測定的和重量介于約150kDa和約400 kDa之間的低分子量復(fù)合物，
[0055]-通過陽性酶聯(lián)免疫吸附測定的和重量介于約400kDa和約1，500 kDa的中分子量復(fù)合物，或
[0056]-通過陽性酶聯(lián)免疫吸附測定的和重量介于約1，500kDa和約7，OOOkDa的高分子量復(fù)合物。
[0057]如本文報道的一個方面是如本文報道的方法用于將免疫復(fù)合物特性與改變的藥物動力學(xué)相關(guān)聯(lián)的用途。
[0058]如本文報道的一個方面是如本文報道的方法用于確定藥物功效的降低的用途。
[0059]如本文報道的一個方面是如本文報道的方法用于確定藥物的天然對應(yīng)物的中和作用的用途。
[0060]如本文報道的一個方面是如本文報道的方法用于確定針對藥物的免疫和超敏反應(yīng)的用途。
[0061]如本文報道的一個方面是如本文報道的方法用于確定IgG神經(jīng)纖維球沉積的用途。
[0062]在所有方面的一個實施方案中，所述免疫和超敏反應(yīng)是血清病/III型超敏反應(yīng)/免疫復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病。
[0063]如本文報道的一個方面是如本文報道的方法用于確定包含免疫復(fù)合物的自身免疫抗體的存在的用途。
[0064]如本文報道的一個方面是如本文報道的方法用于確定修飾的/復(fù)合的藥物的存在的用途主張。
[0065]在所有方面的一個實施方案中，所述藥物是人抗體或人源化抗體。
[0066]發(fā)明詳沭
[0067]定義
[0068]術(shù)語“抗藥物抗體”指針對藥物的抗原性區(qū)域的抗體。該抗原性區(qū)域可以是藥物的抗原性氨基酸序列，或藥物的糖結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，所述抗藥物抗體針對藥物的二級修飾，所述二級修飾由所述藥物抗體在非人細(xì)胞(比如，CHO細(xì)胞，HEK細(xì)胞，或BHK細(xì)胞)中的重組生產(chǎn)導(dǎo)致。通常，抗藥物抗體針對藥物的抗原性區(qū)域，所述抗原性區(qū)域由被施用所述藥物的動物的免疫系統(tǒng)識別。此種抗藥物抗體是“特異抗藥物抗體”。將藥物設(shè)計為包含盡可能少的抗原性區(qū)域。例如，可以將意在用于人的藥物在用于人患者之前人源化以最小化針對藥物的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。該免疫應(yīng)答將是針對此種人源化藥物的非人部分的抗藥物抗體的形式(參見例如Pan, Y.，等，F(xiàn)ASEB J.9 (1995) 43-49)。
[0069]術(shù)語“色原”指熒光或發(fā)光基團和染料。
[0070]術(shù)語“可檢測標(biāo)記”是指酶，NMR-活性基團或金屬顆粒，半抗原，比如，例如，洋地黃毒苷?？蓹z測標(biāo)記還可以是可光活化的交聯(lián)基團，例如疊氮或氮丙啶(azirine)基團?？梢酝ㄟ^電化學(xué)發(fā)光檢測的金屬螯合物也是優(yōu)選的信號發(fā)射基團，其中尤其優(yōu)選釕螯合物，例如釕(二吡啶)32+螯合物。例如，在EP 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511，和WO 92/14138中描述了合適的釕標(biāo)記基團。
[0071]術(shù)語“藥物”指可以施用于個體用于治療疾病的多肽(比如抗體或非抗體分子)。藥物(比如治療性多肽或治療性單克隆抗體)正被廣泛用于治療各種疾病，比如腫瘤疾病(例如包括非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’ s lymphoma),乳腺癌(breast cancer),和結(jié)直腸癌(colorectal cancer)的血液和實體腫瘤)，免疫疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，血管疾病，或感染性疾病。例如，? Levine, A.P.,等，Journal of the Royal Societyof Medicine 98 (2005) 145-152描述了此種藥物。此種藥物例如是針對CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250,⑶3，HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, Levis Y 抗原，IL-6受體，或 IGF-1 受體的抗體。還由 Groner, B.,等，Curr.Mol.Meth.4 (2004) 539-547 ;和Harris, Μ.，Lancet Oncol.5 (2004) 292-302 描述了治療性抗體。
[0072]術(shù)語“哺乳動物”指屬于脊椎動物綱的生物。在一個實施方案中，術(shù)語哺乳動物指靈長類，貓，狗，綿羊，大鼠，小鼠和兔。在一個實施方案中，術(shù)語哺乳動物，指靈長類目的各科的成員，包括絨猴和絹毛猴(絨科)，新世界猴(卷尾猴科)，舊世界猴(獼猴科)，侏儒和鼠狐猴(鼠狐猴科)，指猴(指猴科)，叢猴和嬰猴(嬰猴科)，長臂猿和小猿(lesserapes)(長臂猿科)，大狐猴，原狐猴，和親緣動物(大狐猴科)，真狐猴(狐猴科)，懶猴(懶猴科)，鼬狐猴(鼬狐猴科)，眼鏡猴(跗猴科)，以及其交叉。在一個實施方案中，所述哺乳動物選自包括絨猴和絹毛猴，舊世界猴，侏儒和鼠狐猴，長臂猿和小猿，真狐猴，以及其交叉的各科的成員的組。在該特定的實施方案中，與人類最接近的親緣動物，大猿(great apes),尤其黑猩猩，倭黑猩猩，大猩猩和紅毛猩猩的組是排除在外的。
[0073]術(shù)語〃樣品〃指來自已經(jīng)被施用藥物的哺乳動物的任何量的物質(zhì)。此種物質(zhì)包括但不限于來自該哺乳動物的全血，血清，或血漿，其是臨床前例行程序中最廣泛使用的樣品來源。在一個實施方案中，所述樣品是液體樣品，如唾液，尿液，滑液，全血，血漿，或血清。在一個實施方案中，所述樣品是全血，血漿，或血清。
[0074]術(shù)語〃固相〃意為非流體物質(zhì)，并且包括由比如聚合物，金屬(順磁的，鐵磁的顆粒)，玻璃，和陶瓷的材料制成的顆粒(包括微粒和珠子)；膠體物質(zhì)(比如二氧化硅，氧化鋁，和聚合物凝膠)；可以由聚合物，金屬，玻璃和/或陶瓷制成的毛細(xì)管；沸石和其它多孔物質(zhì)；電極；微量滴定板；固體條帶；和比色皿，管，或其它光譜計樣品容器。測定法的固相組分區(qū)別于測定可以接觸的惰性固體表面，因為"固相"包含其表面上的用于與捕獲抗體相互作用的至少一結(jié)構(gòu)部分(moiety)。固相可以是固定的組分，比如管，條帶，比色皿，或微量滴定板，或可以是非固定的組分，比如珠子和微粒。微粒還可以用作用于均相測定形式的固相?？梢允褂迷试S非共價或共價附著多肽和其它物質(zhì)的多種微粒。此種顆粒包括聚合物顆粒，比如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金顆粒，比如金納米顆粒和膠體金；和陶瓷顆粒，比如二氧化娃，玻璃，和金屬氧化物顆粒。參見例如Martin, C.R.，等，Analytical Chemistry-News&Features, 5 月 I 日，1998，322A-327A,其通過引用并入本文。
[0075]多重免疫復(fù)合物分析方法
[0076]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用用于檢測和表征生物基質(zhì)中針對施用的藥物的免疫復(fù)合物(尺寸和組成)的方法，所述方法包括使用與免疫測定聯(lián)合的尺寸排阻層析(SEC)的多步驟方法，可以獲得對改變的藥物動力學(xué)的關(guān)聯(lián)性，功效的損失或降低，天然對應(yīng)物的中和作用以及一般免疫和超敏反應(yīng)(包括血清病/III型超敏反應(yīng)/免疫復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病)。
[0077]因此，作為一個方面，本文中報道了用于分析/表征體內(nèi)形成的循環(huán)免疫復(fù)合物(CICs)的方法，所述方法包括:樣品的尺寸排阻層析，用于確定免疫復(fù)合物的重量/尺寸，所述樣品獲自已經(jīng)施用所述藥物至少一次的哺乳動物；任選地第二種非-SEC層析；和至少一種免疫測定，其中通過免疫復(fù)合物尺寸和免疫測定結(jié)果/示值讀數(shù)的關(guān)聯(lián)性來表征所述免疫復(fù)合物。
[0078]作為一個方面，本文中進(jìn)一步報道了用于表征體內(nèi)形成的抗藥物抗體-藥物(ADA-D)復(fù)合物的方法，所述方法包括:樣品的尺寸排阻層析，用于確定ADA-D復(fù)合物的重量/尺寸，所述樣品獲自已經(jīng)施用所述藥物至少一次的哺乳動物；和至少一種用于檢測抗藥物抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定，其中所述免疫復(fù)合物表征為通過陽性(positive)酶聯(lián)免疫吸附測定的和重量介于約150 kDa和約400 kDa之間的低分子量復(fù)合物，表征為通過陽性酶聯(lián)免疫吸附測定的和重量介于約400 kDa和約1,500 kDa之間的中分子量復(fù)合物，或表征為通過陽性酶聯(lián)免疫吸附測定的和重量介于約1，500 kDa和約7，000 kDa之間的高分子量復(fù)合物。
[0079]本文中還報道的是如本文報道的方法用于確定對改變的藥物動力學(xué)的關(guān)聯(lián)性，用于確定功效的損失或降低，用于確定藥物的天然對應(yīng)物的中和作用，用于確定免疫和超敏反應(yīng)(包括血清病/III型超敏反應(yīng)/免疫復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病)的用途。
[0080]例如，向哺乳動物施用藥物后，哺乳動物的免疫系統(tǒng)可以將施用的藥物識別為外來的并產(chǎn)生抗藥物抗體以中和施用的外來物質(zhì)。如果藥物包含相對哺乳動物是內(nèi)源的成分，則所述抗藥物抗體還可以針對藥物的該成分并且同樣也靶向哺乳動物中的內(nèi)源對應(yīng)物。
[0081]針對施用的治療性藥物的免疫應(yīng)答/AM形成/補體激活可以導(dǎo)致形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物(ADA-D復(fù)合物)的形成可以導(dǎo)致改變的藥物動力學(xué)性質(zhì)或臨床后遺癥，例如血清病樣綜合征。
[0082]免疫復(fù)合物性質(zhì)可以是誘導(dǎo)的后續(xù)影響的重要決定因素:
[0083]-復(fù)合物尺寸
[0084]大尺寸復(fù)合物的形成可以導(dǎo)致通過RES系統(tǒng)的增強的清除。
[0085]中尺寸復(fù)合物的形成可以導(dǎo)致補體結(jié)合，隨后是組織沉積和，，血清病“
[0086]小尺寸復(fù)合物的形成可以具有，，無“深入影響。
[0087]-復(fù)合物電荷
[0088]陽離子免疫復(fù)合物可以與細(xì)胞/組織膜(陰離子細(xì)胞表面)沉積/與細(xì)胞/組織膜(陰離子細(xì)胞表面)相關(guān)。
[0089]-復(fù)合物極性
[0090]-Clq -結(jié)合的或結(jié)合Clq的能力
[0091]因此，全面的免疫復(fù)合物表征是用于與體內(nèi)作用(藥物動力學(xué)改變和/或毒理學(xué)作用)相關(guān)聯(lián)的先決條件。
[0092]然而，例如抗藥物抗體(ADA)發(fā)生率的單獨信息，不能與臨床調(diào)查結(jié)果和改變的藥物動力學(xué)深入相關(guān)。
[0093]形成的免疫復(fù)合物(比如抗藥物抗體-藥物復(fù)合物(ADA-D復(fù)合物))的量和尺寸，依賴于數(shù)個參數(shù)，例如濃度/比例以及表位和效價。
[0094]復(fù)合物尺寸是復(fù)合物清除或不良事件的誘導(dǎo)的重要決定因素。典型地，較大的復(fù)合物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，小復(fù)合物通常不引發(fā)炎癥，然而中尺寸復(fù)合物可以抓住補體并可以引起組織損傷。
[0095]為了深入評價免疫應(yīng)答，應(yīng)該就尺寸表征可能形成的免疫復(fù)合物。此外，如果藥物的內(nèi)源對應(yīng)物存在，則例如形成的ADA是否與這些分子交叉反應(yīng)和內(nèi)源對應(yīng)物是否也是免疫復(fù)合物的一部分的信息是有價值的信息。
[0096]可以將信息與調(diào)查結(jié)果(比如由于免疫形成導(dǎo)致的改變的藥物動力學(xué)或不良事件)相關(guān)聯(lián)并且可以提供額外的信息以解釋以下差異，所述差異是例如無任何影響的免疫復(fù)合物陽性受試者和具有改變的藥物動力學(xué)或僅在一些免疫復(fù)合物陽性受試者中的臨床后遺癥或血清病樣綜合征的免疫復(fù)合物陽性受試者之間的差異。
[0097]為了確定已經(jīng)施用了藥物的哺乳動物中免疫復(fù)合物的形成和為了表征形成的免疫復(fù)合物，需要兩步驟方法。
[0098]如本文報道的方法可以用于表征任何免疫復(fù)合物，例如ADA-D復(fù)合物以及自身免疫復(fù)合物(自身免疫疾病，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis),狼瘡(lupus)
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[0099]尺寸排阻層析
[0100]第一步中，將形成的免疫復(fù)合物以其尺寸分離以確定復(fù)合物中組分的表觀數(shù)量。這可以通過洗脫物的尺寸排阻層析(SEC)和分級(在一個實施方案中等分)完成。
[0101]如果抗藥物抗體是IgG類的，其具有約150 kDa的分子量并且治療性多肽的分子量范圍介于約2.5 kDa (多肽藥物；由20個氨基酸殘基組成的多肽)和約250 kDa (藥物抗體；包括另外融合的效應(yīng)多肽或多特異性抗體的IgG類全長治療性抗體)，那么抗藥物抗體和藥物的1:1化學(xué)計量的復(fù)合物在小多肽藥物的情況下具有至少約150 kDa的分子量，并且在復(fù)合物藥物抗體的情況下具有高達(dá)約400 kDa的分子量。
[0102]分級時間的選擇限定尺寸信息的分辨率。
[0103]將可以是血清血漿(例如用于抗藥物抗體檢測)或滑液(比如類風(fēng)濕疾病中)的樣品(生物基質(zhì))用尺寸排阻層析分級。尺寸排阻層析提供第一信息:分析物(復(fù)合物)尺寸。
[0104]可以使用第二維度的層析，比如IEC分離來分析尺寸排阻層析的單個級分以確定復(fù)合物的電荷，或反相(RP)層析或HILIC分離以確定復(fù)合物的極性。
[0105]還可以分析尺寸排阻層析的各個級分的補體結(jié)合活性。
[0106]還可以使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析尺寸排阻層析的各個級分。
[0107]酶聯(lián)免疫吸附測定
[0108]尺寸排阻層析洗脫物的分級使SEC分析能夠多重化，因為可以進(jìn)行不同的免疫測定以確定不同復(fù)合物，比如
[0109]-橋接型(bridging-type)-ELISA( “經(jīng)典的ADA篩選測定):檢測較高分子量級分中的ADA，表明ADA是較高分子級分的一部分。
[0110]-復(fù)合型-測定:利用藥物特異的捕獲和抗物種的檢測對ADA-D復(fù)合物的檢測是臨床前研究中用于mAbs的通用方法(參見例如W02006/066912，W0 2008/031532，二者都通過引用并入本文)
[0111]-直接型-測定:通過使用固定化的藥物和抗物種的特異檢測，進(jìn)行結(jié)合于藥物和/或結(jié)合于內(nèi)源對應(yīng)物的ADA的檢測
[0112]在用于各個測定的一個實施方案中，通過分析空白或理想地劑量給藥前(pre-dose)的樣品來評估特定截點。
[0113]對于截點的定義和對于不同板間的半定量結(jié)果比較，應(yīng)該在限定的時間之后讀出ELISA信號(在一個實施方案中通過在MTP上使用陽性對照監(jiān)測)。
[0114]對于熟練技術(shù)人員而言，免疫測定是公知的。在相關(guān)教科書中概述了用于進(jìn)行此種測定的方法以及實際應(yīng)用和程序。相關(guān)教科書的實例是Tijssen, P.，Preparat1nof enzyme-antiboy or other enzyme-macromolecule conjugates (于:"Practiceand theory of enzyme immunoassys", Burdon, R.H.和 v.Knippenberg, P.H.(編輯)，Elsevier，阿姆斯特丹(1990) pp.221-278中)和涉及免疫學(xué)檢測方法的"Methods inEnzymology^, Colowick, S.P.和 Caplan, N.0.(編輯)，Academic Press 的各卷，尤其是卷70，73，74，84，92，和 121)。
[0115]例如，由Hage, D.S.，在 Anal.Chem.71 (1999) 294R-304R 中描述了不同免疫測定的原理。Lu，B.，等，在Analyst.121 (1996) 29R-32R中，報道了定向固定化抗體用在免疫測定中。例如，由 Wilchek, M.Bayer, E.A., Methods Enzymol.184(1990)467-469 報道了親和素-生物素-介導(dǎo)的免疫測定。
[0116]在第二步中，基于其組成表征分離的復(fù)合物的尺寸，例如確認(rèn)抗藥物抗體的存在和確定抗藥物抗體的特異性。在一個實施方案中，所述第二步包括至少一種酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。
[0117]通常，ELISA包括捕獲分子和示蹤分子。通常將所述捕獲分子固定化/結(jié)合于固相。通常將示蹤分子綴合于可檢測標(biāo)記，其中所述可檢測標(biāo)記可以是直接可檢測標(biāo)記或間接可檢測標(biāo)記。
[0118]為了確定抗藥物抗體的存在，可以使用不同ELISA形式:
[0119]-夾心-ELISA
[0120]在一個實施方案中，使用綴合于固相的藥物作為捕獲分子并使用綴合于可檢測標(biāo)記的藥物作為示蹤分子。
[0121]在夾心-ELISA中，抗藥物抗體由于其雙價結(jié)構(gòu)在捕獲分子和示蹤分子之間形成橋。這種測定形式可以還可以稱為橋接-ELISA。
[0122]通過使用夾心_/橋接-ELISA，可以檢測抗藥物抗體。對覆蓋不同于其分子量的重量范圍(例如對于IgG-1gG復(fù)合物，不同于約300 kDa)的SEC級分中的ADA的檢測表明ADA是較高分子量復(fù)合物的一部分。
[0123]-復(fù)合型-ELISA
[0124]在一個實施方案中，藥物特異性抗體用作捕獲分子并且綴合于可檢測標(biāo)記的抗物種特異性抗體抗體用作示蹤分子。
[0125]在一個實施方案中，綴合于固相的藥物用作捕獲分子并且綴合于可檢測標(biāo)記的抗物種特異性抗體抗體用作示蹤分子。
[0126]在一個實施方案中，綴合于固相的抗物種特異性抗體抗體用作捕獲分子并且綴合于可檢測標(biāo)記的藥物用作示蹤分子。
[0127]在一個實施方案中，綴合于固相的抗物種特異性抗體抗體用作捕獲分子并且綴合于可檢測標(biāo)記的藥物特異性抗體用作示蹤分子。
[0128]在復(fù)合型-ELISA中，可以檢測抗藥物抗體-藥物復(fù)合物。
[0129]在臨床前樣品分析中，可以使用藥物特異的捕獲抗體和抗物種的特異檢測抗體。
[0130]在臨床樣品分析中，可以使用藥物特異的捕獲分子，比如抗獨特型抗體，和抗物種的特異檢測抗體。
[0131]該測定提供ADA是否結(jié)合于藥物或不結(jié)合于藥物的信息。這通過使用ADA-D復(fù)合物的不同組分用于捕獲復(fù)合物(通過與藥物或抗藥物抗體的相互作用)和用于檢測捕獲的復(fù)合物(假使與藥物的相互作用已被用于捕獲復(fù)合物，則通過與抗藥物抗體的特異相互作用或假使抗藥物抗體已被用于捕獲復(fù)合物，則通過與藥物的特異相互作用)實現(xiàn)。
[0132]因為抗藥物抗體通常是由已經(jīng)被施用藥物的哺乳動物產(chǎn)生的全長抗體，因此，抗藥物抗體包括特異于哺乳動物的恒定區(qū)。因此，利用物種特異恒定區(qū)的存在，物種特異的抗體可以用于特異結(jié)合(捕獲或檢測)抗藥物抗體，而不考慮抗藥物抗體的結(jié)合特異性。
[0133]-直接型-ELISA
[0134]在一個實施方案中，綴合于固相的藥物用作捕獲分子并且綴合于可檢測標(biāo)記的抗物種特異性抗體抗體用作示蹤分子。
[0135]在一個實施方案中，綴合于固相的藥物的內(nèi)源對應(yīng)物用作捕獲分子并且綴合于可檢測標(biāo)記的抗物種特異性抗體抗體用作示蹤分子。
[0136]通過使用包括固定化的藥物內(nèi)源對應(yīng)物和用于檢測的抗物種抗體的直接型-ELISA，可以檢測抗藥物抗體并具體說明ADA是否結(jié)合于藥物或內(nèi)源對應(yīng)物。此外，可能通過使用物種和亞型特異的抗體確定抗藥物抗體的抗體同種型。
[0137]通過信號相對尺寸矩陣進(jìn)行結(jié)果的評價。
[0138]在一個實施方案中，將所述樣品與捕獲分子和/或示蹤分子孵育達(dá)16小時至32小時的時間段。
[0139]橋接型-ELISA是使用雙抗原橋接免疫測定，用于對哺乳動物樣品中藥物⑶和針對藥物的抗體(抗藥物抗體，ADA)的免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫學(xué)確定的方法。
[0140]所述免疫復(fù)合物進(jìn)一步縮寫為ADA-D復(fù)合物。
[0141]在一個實施方案中，樣品中ADA-D復(fù)合物的免疫學(xué)確定使用包括捕獲抗體和示蹤抗體的雙抗原橋接免疫測定，其特征在于一個抗體是特異結(jié)合哺乳動物的Ig的抗體，并且另一個抗體是特異結(jié)合藥物的抗體。
[0142]在確定過程中，抗-哺乳動物Ig抗體，ADA-D復(fù)合物，和抗藥物抗體之間形成復(fù)合物并且形成的復(fù)合物的量與ADA-D復(fù)合物，藥物和/或ADA的濃度相關(guān)。
[0143]在一個實施方案中，可以進(jìn)行用于檢測形成的ADA-D復(fù)合物的直接樣品分析。在此種測定中，僅在如果樣品既包含藥物也包含抗藥物抗體時發(fā)現(xiàn)陽性信號。
[0144]在一個實施方案中，將樣品與預(yù)定量的藥物抗體預(yù)孵育之后進(jìn)行所述樣品分析。在此種測定中，不依賴于樣品中藥物的存在/缺乏，如果樣品包含抗藥物抗體，則發(fā)現(xiàn)陽性信號。
[0145]在一個實施方案中，通過經(jīng)由藥物的氨基酸骨架的N-末端和/或ε-氨基基團(賴氨酸)，不同賴氨酸的ε-氨基基團，羧基-，巰基-，羥基-和/或酚官能團和/或藥物的糖結(jié)構(gòu)的糖醇基團的化學(xué)結(jié)合，進(jìn)行藥物與其綴合伴侶的綴合。
[0146]在一個實施方案中，將捕獲抗體或藥物通過被動吸附綴合于固相并且因此在至少兩個不同抗體位點綴合于固相。例如由Butler, J.Ε.，在“Solid Phases in Immunoassay”，第 205-225 頁；Diamandis, Ε.P.和 Christopoulos, Τ.K.(編輯):1mmunoassays (1996)Academic Press San Diego 中描述了被動吸附。
[0147]在一個實施方案中，將捕獲抗體或藥物通過特異結(jié)合對固定化。此種結(jié)合對(第一組分/第二組分)為，例如，鏈霉親和素或親和素/生物素，抗體/抗原(參見，例如，Hermanson, G.T.,等，B1conjugate Techniques, Academic Press, 1996),凝集素 / 多糖，類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，激素/激素受體，酶/底物，IgG/蛋白A和/或G，等。在一個實施方案中，將捕獲抗體或藥物綴合于生物素并且通過固定化的親和素或鏈霉親和素進(jìn)行固定。
[0148]在一個實施方案中，將示蹤抗體綴合于可檢測標(biāo)記。在一個實施方案中，將示蹤抗體通過特異性結(jié)合對綴合。此種結(jié)合對(第一組分/第二組分)是，例如，鏈霉親和素或親和素/生物素，抗體/抗原(參見，例如，Hermanson, G.T.，等，B1conjugateTechniques, Academic Press, 1996)，凝集素/多糖，類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，激素/激素受體，酶/底物，IgG/蛋白A和/或G，等。在一個實施方案中，將示蹤抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地黃毒苷的抗體綴合于可檢測標(biāo)記。備選地，將示蹤抗體綴合于電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，如釕二吡啶復(fù)合物。
[0149]在一個實施方案中，所述方法使用雙抗原橋接免疫測定，用于對猴物種樣品中的針對藥物的抗體(抗藥物抗體，ADA)進(jìn)行免疫學(xué)確定。
[0150]在一個實施方案中，所述方法使用包括捕獲分子和示蹤分子的雙抗原橋接免疫測定，進(jìn)行哺乳動物樣品中ADA的免疫學(xué)確定，其特征在于捕獲分子或示蹤分子之一是特異結(jié)合哺乳動物IgG的抗體并且各自另一個分子是藥物。
[0151]在一個免疫學(xué)確定ADA的實施方案中，捕獲分子是藥物并且示蹤分子是特異結(jié)合哺乳動物的IgG的抗-哺乳動物IgG抗體，樣品源自/獲自所述哺乳動物。在一個免疫學(xué)確定ADA的實施方案中，捕獲分子是特異結(jié)合哺乳動物的IgG的抗-哺乳動物IgG抗體，樣品源自/獲自所述哺乳動物，并且示蹤分子是藥物。在確定的過程中，在藥物，ADA，和抗-哺乳動物IgG抗體之間形成復(fù)合物并且形成的復(fù)合物的量與ADA濃度相關(guān)。在一個免疫學(xué)確定ADA的實施方案中，所述抗-哺乳動物IgG抗體是單克隆抗體(抗-哺乳動物IgG mAb)ο
[0152]多肽(比如藥物多肽或藥物抗體)包含一些反應(yīng)部分，比如，例如，氨基基團(賴氨酸，α-氨基基團)，硫醇基團(胱氨酸，半胱氨酸，和甲硫氨酸)，羧酸基團(天冬氨酸，谷氨酸)和糖醇基團?？梢詫⑦@些用于偶聯(lián)結(jié)合伴侶，如表面，蛋白，聚合物(比如例如PEG,纖維素或聚苯乙烯)，酶，或結(jié)合對的成員(參見例如Aslam M.，和Dent, A., B1conjuat1n MacMillan Ref.Ltd.(1999)50-100)。
[0153]多肽的最常見反應(yīng)基團之一是氨基酸賴氨酸的脂肪族ε -胺。通常，幾乎所有多肽包含豐富的賴氨酸。賴氨酸胺在PH 8.0 (pKa = 9.18)以上是相當(dāng)良好的親核物質(zhì)，并且因此容易和有規(guī)則地與多種試劑反應(yīng)以形成穩(wěn)定的鍵。多肽另一種常見反應(yīng)基團是來自包含硫的氨基酸胱氨酸和其還原產(chǎn)物半胱氨酸(cysteine)(或半胱氨酸(half cystine))的硫醇?xì)埢?。半胱氨酸包含游離的硫醇基團，其比胺更親核并且通常是蛋白質(zhì)中最具有反應(yīng)性的官能團。硫醇通常在中性PH下具有反應(yīng)性，并且因此可以在胺存在的條件下選擇性地偶聯(lián)于其它分子。因為巰基基團相對具有反應(yīng)性，所以具有這些基團的多肽它們常以具有如二硫基團或二硫鍵的其氧化形式存在。此外，對于胱氨酸和半胱氨酸，一些多肽還具有氨基酸甲硫氨酸，其在硫醚鍵中包含硫。文獻(xiàn)報道了使用一些硫醇化交聯(lián)試劑(比如Traut’s試劑(2-亞氨基硫醇烷)，琥珀酰亞胺基(乙?；?乙酸酯(SATA)，或硫代琥珀酰亞胺基6-[3-(2_吡啶基二硫)丙酰氨基]己酸酯(硫代(sulfo)-LC-STOP))以提供通過反應(yīng)性氨基基團引入多個巰基基團的有效途徑?；钚怎?，尤其N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯，是最常使用的用于修飾胺基團的試劑。在含水環(huán)境中反應(yīng)的最適PH為pH 8.0至9.0。異硫氰酸酯是胺-修飾試劑并且與蛋白質(zhì)形成硫脲鍵。它們在含水溶液(最佳為PH 9.0至9.5)中與多肽胺反應(yīng)。醛與脂肪族和芳香族胺，肼，和酰肼在溫和含水條件下反應(yīng)，形成亞胺中間體(席夫堿)。可以將席夫堿用溫和或強烈的還原劑(比如硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉)選擇性還原以得到穩(wěn)定的烷基胺鍵。其它用于修飾胺的試劑是酸酐。例如，二乙三胺五乙酸酐(DTPA)是雙功能螯合劑，其包含兩個胺-反應(yīng)性酸酐基團。其可以與蛋白質(zhì)的N-末端和ε-胺基團反應(yīng)以形成酰胺鍵。酸酐環(huán)打開以產(chǎn)生多價的，能夠在配位絡(luò)合物中緊密結(jié)合金屬的金屬螯合臂。
[0154]多肽中另一種常見反應(yīng)基團是羧酸(天冬氨酸，谷氨酸)。多肽在天冬氨酸和谷氨酸的C-末端位置和側(cè)鏈內(nèi)包含羧酸基團。對于綴合，通常通過使用水溶性的碳二亞胺將羧酸基團轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性酯并與親核試劑(比如胺，酰肼，或肼)反應(yīng)。含胺試劑應(yīng)該是弱堿性的以在多肽上其它胺存在的情況下選擇性地與活化的羧酸反應(yīng)。多肽交聯(lián)可以在將PH提聞到8.0以上時發(fā)生。
[0155]可以將過碘酸鈉用于將碳水化合物部分的糖的醇部分氧化為醛。可以將各個醛基團與如對羧酸描述的胺，酰肼，或肼反應(yīng)。
[0156]硫醇-反應(yīng)性試劑是將偶聯(lián)于多肽上的硫醇基團、形成硫醚-偶聯(lián)的產(chǎn)物的那些。這些試劑在弱酸性到中性PH下快速反應(yīng)，并且因此可以在胺基團存在的條件下被選擇性反應(yīng)。鹵乙?；苌?，例如碘乙酰胺，形成硫醚鍵并且是用于硫醇修飾的試劑。反應(yīng)在本身存在或由還原多肽的不同位置處的胱氨酸的二硫鍵產(chǎn)生的半胱氨酸基團處發(fā)生。進(jìn)一步有用的試劑是馬來酰亞胺。馬來酰亞胺與硫醇-反應(yīng)性試劑的反應(yīng)基本上與碘乙酰胺相同。馬來酰亞胺在弱酸性到中性pH下快速反應(yīng)。
[0157]胺，酰肼，和肼是醛和羧酸-反應(yīng)性試劑(形成酰胺，腙，或烷基胺鍵)。可以在通過水溶性碳二亞胺激活羧基基團后將胺，酰肼，和肼偶聯(lián)于多肽的羧酸。含胺試劑必須是弱堿性的，以便其在更高堿性的賴氨酸ε-胺的存在下選擇性地與碳二亞胺激活的多肽反應(yīng)以形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在與醛基團的反應(yīng)中，所述反應(yīng)可以通過高碘酸鹽氧化多肽上的碳水化合物殘基在多肽上產(chǎn)生，形成席夫堿中間體，其可以通過用氰基硼氫化鈉(溫和和選擇性的)或硼氫化鈉(強的)水溶性還原劑還原中間體而被還原為烷基胺。
[0158]圖1中，顯示藥物ADA-D復(fù)合物形成的動力學(xué)(Img藥物和Img ADA)?？梢钥闯觯S時間增加，形成更高級的復(fù)合物，例如從1:1藥物:ADA-復(fù)合物開始，通過1:2藥物:ADA復(fù)合物，到1:3藥物:ADA復(fù)合物(時間點O分鐘，50分鐘，100分鐘，160分鐘，200分鐘)。通過加入進(jìn)一步的ADA，樣品的組成可以進(jìn)一步被轉(zhuǎn)變?yōu)榻档土藛误w藥物峰的較高分子量復(fù)合物(圖2)。
[0159]圖3中顯示典型的重構(gòu)的SEC示意圖(y-軸是ELISA的0D)和以如本文報道的方法獲得的ELISA結(jié)果。圖4顯示樣品201的重構(gòu)的SEC的放大，其中將Y-軸保持不變。從而可以看到樣品組成中的差異。
[0160]本文中使用以下縮寫:
[0161]ABTS 2，2’-連氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯(6)] 二-銨
[0162]Ab 抗體
[0163]ADA 抗藥物抗體
[0164]Bi生物素
[0165]CoA 分析證書
[0166]Conc.濃度
[0167]CPP 獼猴合并的空白血漿
[0168]Dil.稀釋度
[0169]ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定
[0170]HRP 辣根過氧化物酶
[0171]mAb 單克隆抗體
[0172]MTP 微量滴定板
[0173]OD 光密度
[0174]PBS 磷酸鹽緩沖鹽水
[0175]rpm 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)
[0176]RT 室溫(+15 至+25°C )
[0177]RTU 即用的
[0178]SA 鏈霉未和素
[0179]SEC 尺寸排阻層析
[0180]提供以下實施例以幫助理解本發(fā)明，其真實范圍列于后附的權(quán)利要求中。應(yīng)當(dāng)理解可以在陳述的方法中在不脫離本發(fā)明的實質(zhì)下進(jìn)行改動。
[0181]附圖簡沭
[0182]圖1藥物ADA-D復(fù)合物形成的動力學(xué)(Img藥物和Img ADA)。
[0183]圖2進(jìn)一步加入ADA的如在圖1中顯示的動力學(xué)。
[0184]圖3典型的重構(gòu)SEC示意圖和以如本文報道的方法獲得的ELISA結(jié)果。
[0185]圖4如在圖3中顯示的重構(gòu)的SEC的放大。
[0186]圖5五只猴的血漿中施用的藥物的濃度進(jìn)程(劑量=100mg/kg,重復(fù)施用，在研究的第17天施用)。
[0187]圖6IgG沉積陽性動物(半定量評價)。
[0188]實施例1
[0189]稱猴(cynomolgus monkey)研究的樣品分析
[0190]為了檢測包含針對施用的藥物的抗藥物抗體(ADA)的復(fù)合物，分析獲自獼猴研究的二十七個血漿樣品。此外，進(jìn)行復(fù)合物尺寸的評估。
[0191]使用包括尺寸排阻層析(SEC)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的兩步驟方法進(jìn)行分析。
[0192]通過SEC，接著將SEC流出物分級(I分鐘級分)，實現(xiàn)可能的復(fù)合物的尺寸_依賴性分離，其使得SEC分析多重化成為可能，因為可以通過不同的ELISA分析各個級分。通過兩種不同的ELISA，實現(xiàn)針對施用的藥物的ADA的檢測和收集的級分中ADA-D復(fù)合物的存在的檢測。一種被設(shè)計為使用用于捕獲的生物素化的藥物和抗-獼猴IgG特異檢測抗體來檢測ADA (ADA測定)，第二種測定被設(shè)計為通過使用藥物特異的捕獲分子和抗-獼猴IgG特異性檢測抗體來檢測ADA-D復(fù)合物。
[0193]從主要組和康復(fù)組(recovery group)動物收集稱猴血衆(zhòng)樣品。組1:安慰劑組(樣品01，02，03，04，05，06)，組2:基本劑量(樣品07，08，09，10，11，12)，組3:兩倍基本劑量(樣品 13，14，15，16，17，18)，組 4:四倍基本劑量(樣品 19，20，21，22，23，24，25，26，27)。
[0194]分級時間的選擇限定尺寸信息的分辨率。分級大小為I分鐘。將一些級分的ELISA結(jié)果組合以將信息精簡為“高，中和低分子量級分”。
[0195]SEC:
[0196]在B1Suite 450 (具有從約20.000至約7.000.000 Da的分子量范圍的13 μ mSEC柱)上分離獼猴血漿樣品。為了避免蛋白質(zhì)在柱頂上不需要的沉淀，將獼猴血漿與乙醇混合(與流動相的乙醇組成相當(dāng))，然后離心I分鐘(獼猴血漿:乙醇(95wt-% )的比例為約16:1 ;20，800rcf.離心I分鐘)。將20 μ I樣品注入HPLC系統(tǒng)(Agilent 1100)。在280nm波長監(jiān)控UV蹤跡。使用在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液中的5 %乙醇作為流動相，進(jìn)行等度(isocratic)分離(0.5ml/min流速,達(dá)25分鐘,此后0.75ml/分鐘達(dá)13分鐘,和0.5ml/分鐘最后2分鐘)ο
[0197]將SEC分離的流出物分級以使能夠通過ELISA檢測。在一個實施方案中，收集分級-時間為I分鐘的十二個連續(xù)的級分，覆蓋從9分鐘(外水體積)至21分鐘的洗脫時間。
[0198]在下表中給出各個級分相應(yīng)的計算的分子量。
[0199]表
[0200]級分J保留時M—J分子M.......................................................[分鐘] PcDa]
19-10>7000-3515
2〗0-113515-2285
311-122285-1486
412-13__1486-966
513-14966-628
614-15628-408
715-16408-265
816-17265-173
917-.18173-112
1018-19__H 2-73_
1119-2073-47
12120-2147-31
[0201]ADA-測定:
[0202]在較高分子量SEC級分(大于150kDa (其相當(dāng)于IgG/ADA單體的重量))中ADA的檢測表明，ADA是較高分子量復(fù)合物的一部分。通過使用ADA測定分析收集的級分，進(jìn)行ADA檢測。復(fù)合物尺寸表征是基于SEC保留時間。通過分析各個級分中ADA-D復(fù)合物(ADA-藥物復(fù)合物)的存在，實現(xiàn)復(fù)合物組成的表征。
[0203]為了檢測ADA和ADA-D復(fù)合物，建立了兩種順序的ELISA方法。
[0204]為了 ADA檢測，將SA-MTP的孔用生物素化的藥物(D_Bi ；c = I μ g/ml)包被I小時。將包被溶液移除后，將孔用具有0.05%吐溫20的IxPBS洗滌三次，將SEC-級分的等分部分加入并在MTP中震蕩孵育過夜。將孔用具有0.05%吐溫20的IxPBS洗滌三次后，加入洋地黃毒苷化的(digoxigenylated)抗-稱猴 Fe 抗體 ?Cyno Fc>_Dig, c = 0.1 μ g/ml)并震蕩孵育一小時。用具有0.05%吐溫20的IxPBS洗滌孔三次后，加入綴合于HRP(多)Fab片段的抗-洋地黃毒苷抗體(5mU)并震蕩孵育一小時。將孔用具有0.05%吐溫20的IxPBS洗滌三次后，加入ABTS溶液并且監(jiān)控顯色(測量波長405nm ;參考波長490nm)。
[0205]為了 ADA-D復(fù)合物檢測，將SA-MTP孔用生物素化的抗藥物抗體(〈藥物>_Bi ；c =
2μ g/ml)震蕩包被I小時。移除包被溶液后，將孔用具有0.05%吐溫20的IxPBS洗滌三次，加入SEC-級分的等分部分并且在MTP中震蕩孵育一小時以用于復(fù)合物檢測。移除溶液后，將孔用具有0.05%吐溫20的IxPBS洗滌三次，加入洋地黃毒苷化的抗-獼猴Fe抗體(<Cyno-Fc>-Dig)溶液(c = 0.1 μ g/ml)并震蕩孵育I小時。將溶液移除后，將孔用具有
0.05 %吐溫20的IxPBS洗滌三次，加入抗-洋地黃毒苷抗體-HRP綴合物(多)Fab片段溶液(5mU)并震蕩孵育。將孔用具有0.05%吐溫20的IxPBS洗滌三次后，加入ABTS溶液并且監(jiān)控顯色(測量波長405nm ;參考波長490nm)。
[0206]基于OD信號的截止值是基于研究安慰劑樣品的分析定義的，在所述截止值以上的SEC級分結(jié)果被定義為對于ADA (ADA測定)或ADA-D復(fù)合物(ADA-D測定)的存在為陽性。
[0207]ADA測定和ADA-D測定的結(jié)果顯示于下表中(ELISA結(jié)果列為安慰劑樣品的級分的分析的OD值(上部:ADA測定；下部:ADA-D測定))。
[0208]^.
[0209]ADA 測定
[0210]級分/保留時間[分鐘]
[0211]
~|9-10~IlO-1l 111-12112-13 |l3-14~|l4-15 |l5-16|l6-17
? 0.07~ 0.08~ 0.09 0.10~07ΤΙ 0.09~ 0.10 07ΤΙ
20.08~ 0.13~ 0.14 0.13~0ΤΤ3 0.13~0ΤΤ2 0.14
30.10~07?2~0ΓΤ2 0ΤΤ2~0ΤΤ2 --2~0ΤΤ2 0.13
40.08~ 0.08~ 0.08 0.10~ 0.10 0.10~ 0.10 0ΤΤ2
50.08~ 0.07~ 0.09 0.09~ 0.10 0.10~ 0.10 0ΤΤ2
60.07~ 0.07~ 0.08 0ΤΤ2~ 0.09 0.10~ 0.09 0ΓΤΙ
[0212]ADA-D 測定
[0213]級分/保留時間[分鐘]
[0214]
~|9-10~IlO-1l 111-12112-13 |l3-14~|l4-15 |l5-16|l6-17
?0.04~0.03~0.030.04~0030.03~0.040.04
20.04~ 0.04~ 0.050.08~07050.04~ 0.050706
30.03~ 0.04~ 0.040.04~ 0.040.04~ 0.040.04
40.03~ 0.03~ 0.030.03~ 0.030.03~ 0.030.04
50.03~ 0.03~ 0.030.03~ 0.030.03~ 0.040.04
60.04~ 0.03~ 0.030.04~ 0.040.04~ 0.040.04
[0215]基于這些數(shù)據(jù)，對于ADA測定，定義截止值為OD彡0.20，并且對于ADA-D測定，定義截止值為OD ^ 0.10，其代表分析的級分中約兩倍的平均空白信號。
[0216]為了進(jìn)一步半定量評價，定義在下表中給出的值(對于ADA-測定(左)和ADA-D測定(右)的截止值(OD))。
[0217]表.
[0218]
信號結(jié)果__信號丨ο。丨I
低T 0.20 IIJf1-;低T.0.10 IlJtt
0,20^ 1,00 Wl性0.10-0.75
_(iIiIri1V)_(tfriv)
,WrJ- 1.00 ,丨性Π
_ (iUfTf'/) _ (iWjfTi'J.) I
[0219]分析了二十七種獲自研究的獼猴血漿樣品，以檢測包含針對施用的藥物的抗藥物抗體(ADA)的復(fù)合物。此外，進(jìn)行復(fù)合物尺寸的評估。
[0220]組合級分1-3的結(jié)果并作為高分子量復(fù)合物級分給出，級分4-6為中分子量復(fù)合物級分，并且級分7-8為低分子量復(fù)合物級分。在下表中提供研究樣品的級分分析的ELISA結(jié)果的概覽(左:ADA測定；右:ADA-D測定；組I為安慰劑組；組2為基本劑量；組3為兩倍基本劑量；組4為四倍基本劑量)。
[0221]表.
[0222]
【權(quán)利要求】
1.一種用于確定體內(nèi)形成的循環(huán)復(fù)合的抗藥物抗體的方法，所述循環(huán)復(fù)合的抗藥物抗體包含(外源的)治療性多肽和內(nèi)源的抗藥物抗體，所述方法包括: a)樣品的尺寸排阻層析，其用于確定免疫復(fù)合物的重量/尺寸，所述樣品來自已經(jīng)被施用藥物至少一次的哺乳動物， b)任選地第二種非-SEC層析， c)用于檢測所述抗藥物抗體的至少一種多相免疫測定，和 d)任選地基于質(zhì)譜法的分析， 其中通過將免疫復(fù)合物尺寸和免疫測定或質(zhì)譜法測定示值讀數(shù)/結(jié)果相關(guān)聯(lián)來表征所述免疫復(fù)合物， 其中所述治療性多肽是合成的或非天然存在的治療性多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述樣品是血清或腦脊液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的方法，其特征在于所述尺寸排阻層析是以級分收集洗脫物的尺寸排阻層析。
4.根據(jù)在前權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于將所述尺寸排阻層析的級分中的至少一個進(jìn)一步通過以級分收集洗脫物的第二種非-SEC層析分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項所述的方法，其特征在于在免疫測定中分析各個級分。
6.根據(jù)在前權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于所述免疫測定是抗藥物抗體免疫測定。
7.根據(jù)在前權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于所述免疫測定中至少一種是橋接酶聯(lián)免疫吸附測定。
8.根據(jù)在前權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于所述免疫測定中至少一種是用于檢測ADA-D復(fù)合物的復(fù)合物測定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述復(fù)合物測定包括藥物特異的捕獲抗體和作為檢測抗體的抗物種特異性抗體。
10.根據(jù)在前權(quán)利要求任一項所述的方法，其特征在于所述免疫測定中至少一種是用于檢測抗藥物抗體的直接測定，所述抗藥物抗體結(jié)合于所述藥物和/或結(jié)合于所述藥物的內(nèi)源對應(yīng)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述直接測定包括作為捕獲分子的固定化藥物或所述藥物的內(nèi)源對應(yīng)物和作為檢測抗體的抗物種特異性抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項所述的方法用于將免疫復(fù)合物特性與改變的藥物動力學(xué)相關(guān)聯(lián)的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項所述的方法用于確定藥物功效降低的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項所述的方法用于確定藥物的天然對應(yīng)物的中和作用的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項所述的方法用于確定針對藥物的免疫和超敏反應(yīng)的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于所述免疫和超敏反應(yīng)是血清病/III型超敏反應(yīng)/免疫復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病。
【文檔編號】G01N33/564GK104136923SQ201380011056
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月8日
【發(fā)明者】烏韋·達(dá)爾, 格雷戈爾·約爾丹, 羅蘭·施塔克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司