苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中藥注射液的鑒別方法，特別是涉及一種利用GC-MS測定苦碟子注射液糖類成分的測定方法。其步驟如下：（a）樣品的制備，樣品前處理方法。（b）標(biāo)準(zhǔn)品的制備，醛糖類成分衍生化方法，酮糖類成分衍生化方法。(c)色譜條件氣質(zhì)分析儀，GC-MS-QP2010SE毛細(xì)管柱。(d)測定分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液糖類成分指紋圖譜。本方法采用衍生化法使苦碟子中難以檢測的糖類成分更加準(zhǔn)確的檢測出來。
【專利說明】苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥注射液的鑒別方法，特別是涉及一種利用GC-MS測定苦碟子 注射液糖類成分的測定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 苦碟子為菊科苦荬菜屬多年生草本植物。近年來隨著中藥越來越受重視，苦碟子 的化學(xué)成分、藥理活性和臨床研究應(yīng)用等方面的研究都取得了重大進(jìn)展。苦碟子注射液為 淺黃棕色至黃棕色的澄明液體，臨床上用于冠心病、心絞痛、腦血栓、腦梗塞等。
[0003] 苦碟子的化學(xué)成分比較復(fù)雜，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其成分主要有萜類、黃酮類和香豆素類、 甾醇等。其中主要活性成分，由于受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等因素的影響，不同產(chǎn)地苦碟子 所制成的注射液所含成分詫異很大。研究報(bào)道，從各種動(dòng)植物中提取的多糖具有免疫調(diào)節(jié)、 抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗病毒、抗輻射、降血脂、降血糖、美容等廣泛的作用。
[0004] 苦碟子注射液（曾用名：碟脈靈注射液）列入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品（國藥準(zhǔn)字 Z20025450)，由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
[0005] 處方：抱莖苦荬菜lOOOg，制成1000ml。
[0006] 制法：取抱莖苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小時(shí)，第二次0. 5小時(shí)，合并煎液， 濃縮至每Iml相當(dāng)于原生藥0. 5g，放冷至40°C以下，在攪拌下加10%氧化I丐乳調(diào)節(jié)pH值至 10,放置12小時(shí)，離心，離心沉淀物稱重，懸浮于5. 3倍量95%乙醇中（使含醇量達(dá)80%)，力口 50%硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3 - 4,充分?jǐn)嚢枋狗磻?yīng)完全，離心，離心液加40%氫氧化鈉溶液 中和pH值至7. 0,濾過，濾液回收乙醇，并揮盡乙醇，用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原生 藥4g，置-5°C以下放置12小時(shí)以上，濾過，濾液加0. 1 - 0. 2%藥用活性炭粉末，煮沸15分 鐘，置-5°C以下放置24小時(shí)以上，濾過，濾液加注射用水稀釋至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至7. 0 - 7. 5,濾過，灌封，滅菌即得。性狀：本品為淺黃棕色至黃棕色的澄明液體。
[0007] 含量測定：本品每IOml含總黃酮以無水蘆?。–27H3tlO 16)計(jì)，不得少于4. Omg。含抱 莖苦荬菜以腺苷（CltlH12N5O 4)計(jì)，不得少于0. 025mg。
[0008] 功能主治：活血止痛，清熱祛瘀。用于瘀血閉阻的胸痹，證見：胸悶、心痛，口苦，舌 暗紅或存瘀斑等。適用于冠心病、心絞痛見上述病狀者。亦可用于腦梗塞者。
[0009] 用法用量：靜脈滴注，一次10 - 40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0. 9%氯化鈉注射 液稀釋至250 - 500ml后應(yīng)用；14天為一療程；或遵醫(yī)囑。
[0010] 規(guī)格：每支裝（I) 10ml，（2) 20ml，（3) 40ml。
[0011] 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦碟子中含有糖類成分，但是在現(xiàn)有的文獻(xiàn)和報(bào)道中卻并沒有有關(guān) 此物質(zhì)的質(zhì)量檢測方法。本發(fā)明就提供了一種苦碟子注射液中糖類物質(zhì)的含量測定的方 法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的現(xiàn)狀，提供一種苦碟子注射液中糖類成分的含 量測定方法，該方法為苦碟子注射中糖類成分的檢測提供了樣品前處理方法以及糖類成分 GC-MS的檢測方法，通過該方法的分析，不僅可以明確苦碟子注射液中糖類成分的組成，還 能對其含量進(jìn)行測定，該方法的建立可為苦碟子注射液質(zhì)量控制提供依據(jù)。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法，其步驟如 下： (a)樣品的制備 樣品前處理方法：取苦碟子注射液過HyperS印C18柱后，置于具塞圓底燒瓶中，IM HCl調(diào)pH為1，減壓抽真空后70°C水浴3h，冷卻后加入10% NaOH調(diào)pH至中性，精密量取 每5ml于每支離心管中，冷凍干燥備用。而苦碟子注射液中富含有黃酮苷和核苷類成分，為 避免其中糖配基的干擾，建立了苦碟子注射液進(jìn)行前處理方法，除去其中的苷類成分，使該 方法能夠?qū)Ｒ恍缘姆治隹嗟幼⑸湟褐械奶穷惓煞?。本方法中樣品前處理步驟簡單易于操 作，所得樣品的重復(fù)性良好，適用于成批藥物的大量檢測。
[0014] 稱取上述干燥物置于10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500 μ 1吡啶， 在901：水浴中振蕩反應(yīng)301^11，取出冷至室溫，加入50(^1乙酸酐，于901：水浴中繼續(xù)進(jìn)行 乙?；磻?yīng)30min，冷卻后即得衍生物。
[0015] 稱取冷凍干燥物2mg定溶于IOml容量瓶中，然后稀釋到0· 04mg/ml和0· 5mg/ml， 精密移取lml，冷凍干燥，加入0. 6ml吡啶、IOOmg鹽酸羥胺，混勻，放入90°C水浴中加熱反 應(yīng)30 min，取出后冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二硅胺，在90°C下繼續(xù)反應(yīng)30min加入 0. Iml三甲基氯娃燒，10000r/min離心15min，取上清液直接進(jìn)樣分析。
[0016] (b)標(biāo)準(zhǔn)品的制備 醛糖類成分衍生化方法：分別稱取市面上購買的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳 糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品置于10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500μ1吡啶，在90°C 水浴中振蕩反應(yīng)30min，取出冷至室溫，加入500 μ 1乙酸酐，于90°C水浴中繼續(xù)進(jìn)行乙酰化 反應(yīng)30min，冷卻后即得衍生物。
[0017] 酮糖類成分衍生化方法：分別稱取果糖標(biāo)準(zhǔn)品2mg定溶于IOml容量瓶中，然后稀 釋到0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密移取lml，冷凍干燥，加入0. 6ml批陡、IOOmg鹽酸輕胺， 混勻，放入90°C水浴中加熱反應(yīng)30 min，取出后冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二硅胺，在 90°C下繼續(xù)反應(yīng)30min加入0. Iml三甲基氯娃燒，10000r/min離心15min，取上清液直接進(jìn) 樣分析。
[0018] (C)色譜條件 氣質(zhì)分析儀：GC-MS-QP2010SE毛細(xì)管柱：Rtx-5 MS 0. 25 mmX30 m，0. 25 μ m ;載氣：高 純氦氣He，99. 999%;進(jìn)樣口溫度：280°C ;柱流速：1.0mv/min ;進(jìn)樣量：1μ I ;分流比：30:1 ; 氣化室溫度：280°C ;柱前壓73. OkPa氣-質(zhì)接口溫度：270°C ;離子源：EI源；離子源溫度 200°C ;電子能量：70ev ;溶劑延遲時(shí)間5min，質(zhì)量掃描范圍45 - 550amu。
[0019] (d)測定 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液 糖類成分指紋圖譜。
[0020] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是：1、整體性、宏觀性和模糊性。本發(fā)明克服了使用GC-MS測定苦碟 子中糖類成分難以檢測的缺點(diǎn)。在以往對苦碟子注射液的研究中，對其核苷類、黃酮類、以 及有機(jī)酸類成分研究較多，而這些類型成分含量只占苦碟子注射液干重的60%，為了更加全 面的分析苦碟子注射液中的化學(xué)成分，進(jìn)一步提升苦碟子注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對其中含量 高于干重20%的糖類成分進(jìn)行了分析。而苦碟子注射液中富含有黃酮苷和核苷類成分，為 避免其中糖配基的干擾，建立了苦碟子注射液進(jìn)行前處理方法，除去其中的苷類成分，使該 方法能夠?qū)Ｒ恍缘姆治隹嗟幼⑸湟褐械奶穷惓煞帧?、本方法采用衍生化法使苦碟子中難 以檢測的糖類成分更加準(zhǔn)確的檢測出來。3、本方法中樣品前處理步驟簡單易于操作，所得 樣品的重復(fù)性良好，適用于成批藥物的大量檢測。衍生化操作簡便、適用，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定 性良好；GC-MS檢測參數(shù)的設(shè)置能夠保證該方法精密度，適用于苦碟子注射液中糖類成分 的測定。
[0021] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是苦碟子注射液醛糖類成分的GC-MS指紋圖譜及色譜峰指認(rèn)。
[0023] 圖2是苦碟子注射液醛糖類成分GC-MS指紋圖譜空白對照。
[0024] 圖3是苦碟子注射液酮糖類成分的GC-MS指紋圖譜及色譜峰指認(rèn)。
[0025] 圖4是苦碟子注射液酮糖類成分GC-MS指紋圖譜空白對照。
[0026] 圖5是10批苦碟子注射劑醛糖類成分GC-MS指紋圖譜。
[0027]

【具體實(shí)施方式】 苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法： 1、儀器與試藥 1. 1儀器 GC-MS-QP2010SE (SHIMADZU 公司，日本）。
[0028] HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋(金坊市盛藍(lán)儀器制造有限公司）。
[0029] SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。
[0030] 冷凍干燥機(jī)（FD5-2. 5,日本）。
[0031] BT12?型分析天平（德國Sartorius公司）。
[0032] 高速離心機(jī)（TG16-WS長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。
[0033] 1. 2 材料 D-無水葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所110833-200904)。
[0034] D-阿洛糖對照品（天津一方科技有限公司101205003)。
[0035] D-半乳糖對照品（中國藥品生物檢定所100226-200404)。
[0036] D-甘露糖對照品（中國藥品生物制品檢定所140651-200602)。
[0037] D-阿拉伯糖對照品(天津一方科技有限公司）。
[0038] 肌醇對照品(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。
[0039] D-果糖對照品(天津市元立化工有限公司）。
[0040] 吡啶(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。
[0041] 乙酸酐(天津市江天化工有限公司）。
[0042] 鹽酸羥胺(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。
[0043] 六甲基二硅胺(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。
[0044] 三甲基氯硅烷(成都市科龍化工試劑廠)。
[0045] NaOH (分析純，天津化學(xué)試劑批發(fā)公司）。
[0046] HCl (分析純，天津化學(xué)試劑批發(fā)公司）。
[0047] pH試紙(天津市鵬達(dá)化學(xué)試劑有限公司）。
[0048] HyperSep C18 固相萃取小柱（Thermo 公司）。
[0049] 苦碟子注射液（吉林通化華夏藥業(yè)有限公司，批號(hào)：110601，111011，111105， 111218,120109,120209,120312,120438,120532,120625)。
[0050] 2、方法與結(jié)果 指紋圖譜測定 (a)樣品的制備： 樣品前處理方法：取苦碟子注射液過HyperSep C18柱（Thermo公司）后，置于具塞圓 底燒瓶中，IM HCl調(diào)pH約為1，減壓抽真空后70°C水浴3h，冷卻后加入10% NaOH調(diào)pH至 中性，精密量取每5ml于每支離心管中，冷凍干燥備用。用C18柱除去注射液中黃酮苷等苷 類成分，避免糖配基類對糖類成分的干擾；HCl水解多糖成為單糖，便于分析多糖的單糖組 成；取適量凍干以便于精密量取供試品溶液保證取樣的精密度，便于樣品儲(chǔ)存不易變質(zhì)，利 于后續(xù)衍生化反應(yīng)的進(jìn)行。
[0051] 稱取上述干燥物置于10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500 μ 1吡啶， 在901：水浴中振蕩反應(yīng)301^11，取出冷至室溫，加入50(^1乙酸酐，于901：水浴中繼續(xù)進(jìn)行 乙酰化反應(yīng)30min，冷卻后即得衍生物。
[0052] 稱取冷凍干燥物2mg定溶于IOml容量瓶中，然后稀釋到0· 04mg/ml和0· 5mg/ml， 精密移取lml，冷凍干燥，加入0. 6ml吡啶、IOOmg鹽酸羥胺，混勻，放入90°C水浴中加熱反 應(yīng)30 min，取出后冷卻至室溫，加入0. 3mlHMDS (六甲基二硅胺)，在90°C下繼續(xù)反應(yīng)30min 加入0. ImlTMCS (三甲基氯娃燒)，10000r/min離心15min，取上清液直接進(jìn)樣分析。
[0053] (b)標(biāo)準(zhǔn)品的制備 醛糖類成分衍生化方法：分別稱取市面上購買的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳 糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品置于10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500μ1吡啶，在90°C 水浴中振蕩反應(yīng)30min，取出冷至室溫，加入500 μ 1乙酸酐，于90°C水浴中繼續(xù)進(jìn)行乙?；?反應(yīng)30min，冷卻后即得衍生物。
[0054] 酮糖類成分衍生化方法：分別稱取果糖標(biāo)準(zhǔn)品2mg定溶于IOml容量瓶中，然后稀 釋到0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密移取lml，冷凍干燥，加入0. 6ml批陡、IOOmg鹽酸輕胺， 混勻，放入90°C水浴中加熱反應(yīng)30 min，取出后冷卻至室溫，加入0. 3mlHMDS (六甲基二硅 胺），在90°C下繼續(xù)反應(yīng)30min加入0. ImlTMCS (三甲基氯硅烷)，lOOOOr/min離心15min， 取上清液直接進(jìn)樣分析。
[0055] 為增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)值，更加可靠的分析苦碟子注射液中糖類成分的含量，本方法選 用衍生化法增強(qiáng)單糖類成分的質(zhì)譜相應(yīng)。單糖分為醛糖和酮糖，由于其結(jié)構(gòu)的差異，在衍生 化過程中對衍生化試劑的反應(yīng)有所差異，醛糖所含種類較多，酮糖主要為果糖，因此在檢測 過程中分別對苦碟子注射液中的醛糖和酮糖進(jìn)行反應(yīng)，分別進(jìn)行GC-MS分析及含量測定， 保證對糖類成分分析的完整性。
[0056] (C)色譜條件 氣質(zhì)分析儀：GC-MS-QP2010SE (SHIMADZU)毛細(xì)管柱：Rtx-5 MS 0.25 mmX30 m，0.25 μ m (SHIMADZU);載氣：高純 He (99. 999%);進(jìn)樣口溫度：280°C ;柱流速：1. Omv/min ;進(jìn)樣 量：1以1;分流比：30:1 ;氣化室溫度：2801：;柱前壓73.0迚&氣-質(zhì)接口溫度：2701： ;離 子源：EI源；離子源溫度200°C ;電子能量：70ev ;溶劑延遲時(shí)間5min，質(zhì)量掃描范圍45 - 550amu WC-MS條件的設(shè)置適用于多種單糖類成分衍生物的分析，能夠全面反應(yīng)苦碟子注射 液中糖類成分的組成。
[0057] (d)測定 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液 糖類成分指紋圖譜。見圖1 一 4。圖1中：A表示對照品醛糖的色譜峰圖譜，B表示樣品中 醛糖成分色譜峰譜圖。圖3中：A表示對照品果糖的色譜峰譜圖，B表示樣品中果糖成分色 譜峰譜圖。
[0058] 對 10 批苦碟子注射液（110601，111011，111105,111218,120109,120209,120312， 120438,120532,120625)進(jìn)行分析，得到指紋圖譜(參見圖5)，以葡萄糖為參照各個(gè)共有峰 相對保留時(shí)間和相對峰面積如表2和3所示，其相似度結(jié)果如表4所示。
[0059] 表210批苦碟子注射液醛糖類成分GC-MS指紋圖譜共有峰相對保留時(shí)間（以葡萄 糖的色譜峰作為參照）

【權(quán)利要求】
1. 一種苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法，其特征在于步驟如下： (a)樣品的制備 樣品前處理方法：取苦碟子注射液過HyperS印C18柱后，置于具塞圓底燒瓶中，IMHCl調(diào)pH為1，減壓抽真空后70°C水浴3h，冷卻后加入10% NaOH調(diào)pH至中性，精密量取每 5ml于每支離心管中，冷凍干燥備用； 稱取上述干燥物置于10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500iil吡啶，在 90°C水浴中振蕩反應(yīng)30min，取出冷至室溫，加入500 ill乙酸酐，于90°C水浴中繼續(xù)進(jìn)行乙 ?；磻?yīng)30min，冷卻后即得衍生物； 稱取冷凍干燥物2mg定溶于IOml容量瓶中，然后稀釋到0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密 移取lml，冷凍干燥，加入0. 6ml吡啶、IOOmg鹽酸羥胺，混勻，放入90°C水浴中加熱反應(yīng)30 min，取出后冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二娃胺，在90°C下繼續(xù)反應(yīng)30min加入0. Iml 三甲基氯娃燒，l〇〇〇〇r/min離心15min，取上清液直接進(jìn)樣分析； (b) 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 醛糖類成分衍生化方法：分別稱取市面上購買的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳 糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品置于10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500 ill吡啶，在90°C 水浴中振蕩反應(yīng)30min，取出冷至室溫，加入500 乙酸酐，于90°C水浴中繼續(xù)進(jìn)行乙?；? 反應(yīng)30min，冷卻后即得衍生物； 酮糖類成分衍生化方法：分別稱取果糖標(biāo)準(zhǔn)品2mg定溶于IOml容量瓶中，然后稀釋到 0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密移取lml，冷凍干燥，加入0. 6ml批陡、IOOmg鹽酸輕胺，混勻， 放入90°C水浴中加熱反應(yīng)30 min，取出后冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二硅胺，在90°C下 繼續(xù)反應(yīng)30min加入0. Iml三甲基氯娃燒，10000r/min離心15min，取上清液直接進(jìn)樣分 析； (c) 色譜條件 氣質(zhì)分析儀：GC-MS-QP2010SE毛細(xì)管柱：Rtx-5 MS 0. 25 mmX30 m，0. 25 ii m ;載氣：高 純氦氣He，99. 999%;進(jìn)樣口溫度：280°C ;柱流速：1.0mv/min ;進(jìn)樣量：liil ;分流比：30:1 ; 氣化室溫度：280°C ;柱前壓73. OkPa氣-質(zhì)接口溫度：270°C ;離子源：EI源；離子源溫度 200°C ;電子能量：70ev ;溶劑延遲時(shí)間5min，質(zhì)量掃描范圍45 - 550amu ; (d) 測定 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液 糖類成分指紋圖譜。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104316630SQ201410021654
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】王暉, 張艷君, 李遇伯, 劉東輝, 陳 峰 申請人:通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司