一種以殼聚糖修飾的金納米通道膜分離組氨酸對映體的方法及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以殼聚糖修飾的金納米通道膜分離組氨酸對映體的方法，分別以聚碳酸酯膜和氧化鋁膜為基膜，采用化學(xué)沉積法制備金納米通道膜，再將殼聚糖自組裝至金納米通道孔壁上，形成表面具有手性位點選擇性的功能化納米通道膜，利用納米通道優(yōu)異的分離能力手性分離DL-組氨酸。檢測時采用銀溶膠作為表面增強拉曼的基底，增強對D-，L-組氨酸的SERS效應(yīng)，提高檢測該物質(zhì)的選擇性和靈敏度，對D-組氨酸和L-組氨酸同時進行檢測。本發(fā)明為構(gòu)建納米通道分離池與SERS檢測系統(tǒng)的偶聯(lián)裝置對手性物質(zhì)的分離檢測提供了更加快速便捷的方法，體現(xiàn)了其獨特的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種以殼聚糖修飾的金納米通道膜分離組氨酸對映體的方法及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及材料領(lǐng)域和傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種基于納米通道膜材料上的分子水平膜分離檢測技術(shù)，具體為基于納米通道結(jié)合表面增強拉曼散射光譜分離檢測組氨酸對映體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從1959年著名物理學(xué)家、諾貝爾獎獲得者Richard Feynman提出了納米技術(shù)概念，到現(xiàn)在納米技術(shù)經(jīng)歷了 50余年的發(fā)展，已經(jīng)成為現(xiàn)代科學(xué)(量子力學(xué)、介觀物理、分子生物學(xué)等)和現(xiàn)代技術(shù)(微電子、計算機技術(shù)和掃描隧道顯微鏡技術(shù)、核分析技術(shù)等)交叉結(jié)合的產(chǎn)物，是現(xiàn)代科學(xué)研究的前沿。
[0003]近年來，納米通道技術(shù)作為納米生物技術(shù)研究的領(lǐng)域重要分支，因其獨特的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，近年來在國際上得到廣泛關(guān)注，在基因測序、單分子分析、仿生離子通道設(shè)計和藥物裝載等研究中體現(xiàn)了獨特的優(yōu)越性。納米通道對手性物質(zhì)的分離檢測尚鮮見報導(dǎo)。在用納米通道技術(shù)模擬生物膜發(fā)展高靈敏、高選擇性分離手段，研制各種基底材料的納米通道等方面的研究，研究者們正面臨著重大的機遇和挑戰(zhàn)。
[0004]手性是自然界的一種普遍現(xiàn)象，構(gòu)成生物體的基本物質(zhì)單位如氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)、核酸等都是手性分子。手性分子是具有對映異構(gòu)體的外消旋混合物，它們在結(jié)構(gòu)上、物理化學(xué)性質(zhì)上極其相似，但是在藥力、毒性方面卻存在很大的差異。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單元，是人類和動物生命活動重要物質(zhì)。氨基酸是具有L型和D型的外消旋體，兩者在人體內(nèi)的活性差異很大，因此研究新的對映體氨基酸的拆分方法對人類健康，社會發(fā)展具有很深遠(yuǎn)的意義。
[0005]目前常見的對映體氨基酸拆分方法主要有化學(xué)拆分法、膜拆分法、色譜拆分法等。納米通道對其分離研究還較少。因此，發(fā)展基于納米通道的多通道手性傳感檢測技術(shù)是非常有意義的。常用分離氨基酸對映體的方法主要有高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法、高效液相色譜(HPIC)法、薄層色譜(TLC)法和氣相色譜(GC)法等。氨基酸對映體在色譜分離前通常需要進行衍生化。然而，這些方法檢測復(fù)雜、費時，儀器不易攜帶，需要試樣量較多，在連續(xù)監(jiān)測及現(xiàn)場測定中受到限制。
[0006]快速準(zhǔn)確而有效的分離、分析氨基酸對映體組分在當(dāng)代藥物化學(xué)、農(nóng)業(yè)化學(xué)、食品化學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域的研究中具有非常重要的意義，對于進一步了解生命活動的本質(zhì)也具有重要的意義。
[0007]表面增強拉曼散射技術(shù)(SERS)是一種表面測試技術(shù)，指當(dāng)一些分子吸附到經(jīng)特殊處理或制備的粗糙金屬或膠體表面(如金、銀等)時，它們的拉曼光譜信號強度一般比正常拉曼強度增加近IO 6倍。由于SERS具有很高的靈敏度，不僅能夠檢測到吸附在粗糙金屬表面的單分子層和亞單分子層的分子，而且能夠給出表面分子的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的信息，同時可有效地避免溶液相中相同物種的信號干擾，獲取高質(zhì)量的表面分子信號，SERS被認(rèn)為是一種很好的表面分析的手段，廣泛應(yīng)用于表面科學(xué)、分析科學(xué)和生物科學(xué)等領(lǐng)域。
[0008]本發(fā)明嘗試基于金納米通道膜技術(shù)，將納米通道技術(shù)與對映體拆分結(jié)合，對對映體的拆分進行新的探索。并且發(fā)展基于納米通道的多通道手性傳感檢測技術(shù)，構(gòu)建納米通道分離池與SERS檢測系統(tǒng)偶合裝置，將分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)有機的結(jié)合在一起，實現(xiàn)手性氨基酸的分離與測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于發(fā)明基于功能性納米通道陣列實現(xiàn)手性對映體組氨酸的分離方法。構(gòu)建納米通道分離池與SERS檢測系統(tǒng)偶合裝置，將分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)有機的結(jié)合在一起，實現(xiàn)手性組氨酸更加快速地分離與檢測。
[0010]為實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0011] 一種以殼聚糖修飾的金納米通道膜分離組氨酸對映體的方法，包括以下步驟:
[0012](I)殼聚糖修飾的金納米通道膜的制備:分別以聚碳酸酯膜和氧化鋁膜為基膜，采用化學(xué)沉積法，分別在上述膜的納米通道內(nèi)沉積金納米粒子，制得金納米通道膜，將殼聚糖自組裝至金納米通道孔壁上，形成表面具有手性位點選擇性的功能化納米通道；
[0013](2) D-, L-組氨酸的分離:以U形連通池作為組氨酸對映體分離的裝置，U形連通池分進樣池、透過池兩部分，將殼聚糖修飾的金納米通道膜置于進樣池和透過池中間，利用D-, L-組氨酸在殼聚糖修飾的金納米通道膜內(nèi)遷移速度的不同實現(xiàn)手性D-，L-組氨酸的分離。
[0014]步驟(1)所述殼聚糖修飾的金納米通道膜的具體制備過程如下:
[0015]采用化學(xué)沉積法，分別以50nm孔徑的多孔聚碳酸酯膜和IOOnm孔徑的多孔陽極氧化鋁膜為模板，在納米通道內(nèi)沉積金納米粒子，制得的金納米通道膜以25%質(zhì)量濃度硝酸溶液浸泡12h以去除表面上殘留的雜質(zhì)，取出用水沖洗三次，浸入在15mol/L的三巰基丙酸溶液中，6h后用去離子水沖洗5次，然后浸入摩爾比5:1的EDC-NHS溶液中，2h后用水沖洗干凈，將上述處理過的膜浸沒在0.4wt%的殼聚糖溶液中(pH=7.4) 24h，通過EDC-NHS交聯(lián)的殼聚糖自組裝在金納米通道膜上，用水沖洗干凈后備用；制備過程均在4°C條件下進行。
[0016]一種基于納米通道表面增強拉曼散射光譜檢測組氨酸對映體的方法，包括以下步驟:
[0017]以制備好的銀溶膠作為基底，取透過池溶液、銀溶膠和NaCl溶液混合均勻，用表面增強拉曼光譜測定透過池中D-組氨酸和L-組氨酸含量，考察殼聚糖修飾的金納米通道對D-組氨酸和L-組氨酸的分離效果。
[0018]通過EDC-NHS交聯(lián)的殼聚糖自組裝形成表面具有手性位點選擇性的功能化納米通道膜，利用納米通道優(yōu)異的分離能力手性分離DL-組氨酸，可以使組氨酸對映體很好的得到分離；與SERS檢測系統(tǒng)的進行偶聯(lián)之后，為更低濃度手性物質(zhì)的分離檢測提供了更加快速便捷的方法，體現(xiàn)了其獨特的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景。
[0019]本發(fā)明可以對組氨酸對映體進行分離，分離過程簡單，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明將表面增強拉曼(SERS)應(yīng)用于手性對映體的分析檢測中，為構(gòu)建納米通道分離池與SERS檢測系統(tǒng)的偶合裝置對手性物質(zhì)的快速即時靈敏的分離檢測開辟了廣闊的應(yīng)用前景。結(jié)果表明拉曼可以與納米通道進行偶聯(lián)在線即時分離檢測手性組氨酸對映體，并且能大大縮短檢測時間。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1內(nèi)徑為IOOnm的Al2O3膜為基底的納米通道膜沉積不同時間得到的金納米通道膜場效應(yīng)掃描電鏡(FESEM)圖，沉積時間:a，0h ;b，7h ;c，9h。
[0021 ] 圖2為D-組氨酸和L-組氨酸在50nm PC鍍金3h納米通道膜上修飾殼聚糖后遷移量隨時間的變化，(a)D-組氨酸，(b)L-組氨酸。
[0022]圖3為D-組氨酸、L-組氨酸在100nm_9h Al2O3-金納米通道上修飾殼聚糖后遷移量隨時間的變化，(a)D-組氨酸，(b)L-組氨酸。[0023]圖4為用表面增強拉曼光譜分別對10_nmol/L D-組氨酸、L-組氨酸以及D_，L-組氨酸混合物進行檢測，(a) 10-nmol/L D, L-組氨酸，(b) 10-nmol/LL-組氨酸，(c) 10-nmOl/LD-組氨酸，(d)未加入銀溶膠基底時。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該指出的是，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明描述的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0025]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。
[0026]實施例:
[0027]I金納米通道膜的制備
[0028]采用化學(xué)沉積法在50nm的多孔聚碳酸酯(PC)膜上和IOOnm的多孔陽極氧化鋁膜(AAO)上分別沉積金。將PC膜浸入無水甲醇中30min，以洗去基膜上吸附的雜質(zhì)，將AAO膜用30%過氧化氫浸泡24h。然后將清洗過的PC膜、AAO膜分別放入0.026mol/L SnCl2和0.007mol/L CF3C00H50%甲醇/水溶液中，置搖床中震搖45min，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，使Sn2+均勻地吸附在基膜及膜孔表面，將敏化后的膜取出用甲醇漂洗3次，然后將膜放入新制的
0.029mol/L Ag(NH3)2+溶液中15min，并持續(xù)通入氮氣，使膜表面充分活化。取出后用甲醇洗3次，水洗3次，每次3min。然后浸入濃度為7.9X 10_4mol/L亞硫酸金鈉沉積溶液(pH=10.00)中。在4°C下按要求沉積一定時間。最后，將沉積金后的納米通道膜用25%HN03浸12h除去未反應(yīng)的Ag，而后用超純水充分洗滌并浸泡一段時間，除去膜上吸附的硝酸根離子，最后吹干或者晾干備用即得到Au納米通道陣列膜。
[0029]2殼聚糖的修飾
[0030]將所制得的Au納米通道膜浸入在1%的三巰基丙酸溶液中，6h后用去離子水沖洗5次，然后浸入5:1的EDC-NHS溶液中2h，用水沖洗干凈，將活化的膜浸沒在0.4wt%的殼聚糖溶液中(pH=7.4) 24h，通過EDC-NHS交聯(lián)的殼聚糖自組裝在Au納米通道膜上，用水沖洗干凈后備用。實驗均在4°C條件下進行。
[0031]3組氨酸對映體分離效果的測定
[0032]采用U形池作為組氨酸對映體分離的裝置，U形池分進樣池、透過池兩部分，將納米通道膜置于進樣池和透過池中間，膜的有效透過面積為0.196cm2。
[0033]在U形連通池的進樣池中分別加入10_4mol/L D-組氨酸和10_4mol/LL_組氨酸各4mL,透過池中加入8mL水，間隔一定時間后用旋光儀對組氨酸對映體進行檢測，借此作為納米通道對組氨酸分離計算其分離度的數(shù)據(jù)。作滲透池中D-組氨酸和L-組氨酸的濃度隨時間變化的關(guān)系，所得直線斜率之比定義為兩種待測物的分離度。
[0034]圖2D-組氨酸(圖2曲線a)、L-組氨酸(圖2曲線b)在50nm PC鍍金3h納米通道膜上修飾殼聚糖后遷移量隨時間的變化。分離選擇在PH為7.59的條件下對10_4mol/L的D-，L-組氨酸對映體進行拆分。很顯然，D-組氨酸的遷移速率明顯大于L-組氨酸，殼聚糖功能化的金納米通道對D-，L-組氨酸對映體分離度為4.91。這是由于表面具有手性位點選擇性的殼聚糖功能化的金納米通道膜對手性組氨酸具有優(yōu)異的分離能力。
[0035]圖3為D-組氨酸(圖3曲線a)、L_組氨酸(圖3曲線b)在100nm_9hAl203-金納米通道上修飾殼聚糖后遷移量隨時間的變化。實驗得出分離度為4.14。實驗結(jié)果表明，基底膜的改變對手性組氨酸的分離并沒有很大的影響。
[0036]4銀溶膠的制備
[0037]用檸檬酸鈉還原法制備銀溶膠。取0.0255g的硝酸銀溶于150mL的超純水中，不斷攪拌硝酸銀溶液，將其加熱至沸騰后，取3mLl%的檸檬酸鈉溶液逐滴緩慢加入其中。檸檬酸鈉溶液滴加完成后，繼續(xù)加熱維持溶液在沸騰狀態(tài)下，同時繼續(xù)不斷攪拌，IOmin之后停止加熱，自然冷卻至室溫，得到呈灰色的銀溶膠。避光保存。
[0038]5表面增強拉 [0039]以制備好的銀溶膠作為基底，取透過池溶液200 μ L、100 μ L銀溶膠和60 μ L80mmol/L的NaCl，混合均勻，取10 μ L混合液滴在干凈的石英片上，用表面增強拉曼光譜測定透過池中D-組氨酸和L-組氨酸含量?？疾鞖ぞ厶切揎椀慕鸺{米通道對D-組氨酸和L-組氨酸的分離效果。結(jié)果表明拉曼可以與納米通道進行偶聯(lián)在線即時分離檢測手性組氨酸對映體，并且能大大縮短檢測時間。
[0040]組氨酸對映體分離檢測
[0041]采用U形池作為進樣池中組氨酸對映體濃度與滲透池中濃度關(guān)系的裝置，U形池分進樣池、透過池兩部分，將功能化殼聚糖的納米通道膜置于進樣池和透過池中間，膜的有效透過面積為0.196cm2。
[0042]分別將l(T4mol/L D-, L-組氨酸8mL置于進樣池中，透過池放置8m L/jC,每隔一小時用旋光儀檢測滲透池中D-組氨酸和L-組氨酸的含量，得到滲透池中D-，L-組氨酸滲透時間與滲透量的關(guān)系，所得直線斜率之比定義為兩種待測物的分離度。
[0043]圖4為用表面增強拉曼光譜分別對10_nmol/L D-組氨酸、L-組氨酸以及D_，L-組氨酸混合物進行檢測。從圖4d中可以看出銀溶膠起到了 SERS活性基底的作用，未加入活性基底無法檢測出組氨酸。由于D-組氨酸和L-組氨酸的空間位阻不同，與銀微粒作用不同，振動頻率不同，所以各自會出現(xiàn)自己的特征峰。L-組氨酸在lOOOcnT1左右有其特征峰(圖4b)，D-組氨酸在1590cm—1左右有其特征峰(圖4c)，而在D_，L-組氨酸的混合溶液中通過SERS檢測可以同時看到D-組氨酸和L-組氨酸的特征峰存在(圖4a)，由此可以看出，通過表面增強拉曼光譜(SERS)可以同時檢測區(qū)分D-組氨酸和L-組氨酸。
【權(quán)利要求】
1.一種以殼聚糖修飾的金納米通道膜分離組氨酸對映體的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)殼聚糖修飾的金納米通道膜的制備:分別以聚碳酸酯膜和氧化鋁膜為基膜，采用化學(xué)沉積法，分別在上述膜的納米通道內(nèi)沉積金納米粒子，制得金納米通道膜，將殼聚糖自組裝至金納米通道孔壁上，形成表面具有手性位點選擇性的功能化納米通道； (2)D-, L-組氨酸的分離:以U形連通池作為組氨酸對映體分離的裝置，U形連通池分進樣池、透過池兩部分，將殼聚糖修飾的金納米通道膜置于進樣池和透過池中間，利用D-, L-組氨酸在殼聚糖修飾的金納米通道膜內(nèi)遷移速度的不同實現(xiàn)手性D-，L-組氨酸的分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述殼聚糖修飾的金納米通道膜的具體制備過程如下: 采用化學(xué)沉積法，分別以50nm孔徑的多孔聚碳酸酯膜和IOOnm孔徑的多孔陽極氧化鋁膜為模板，在納米通道內(nèi)沉積 金納米粒子，制得的金納米通道膜以25%質(zhì)量濃度硝酸溶液浸泡12h以去除表面上殘留的雜質(zhì)，取出用水沖洗三次，浸入在15mol/L的三巰基丙酸溶液中，6h后用去離子水沖洗5次，然后浸入摩爾比5:1的EDC-NHS溶液中，2h后用水沖洗干凈，將上述處理過的膜浸沒在0.4wt%的殼聚糖溶液中(pH=7.4)24h，通過EDC-NHS交聯(lián)的殼聚糖自組裝在金納米通道膜上，用水沖洗干凈后備用；制備過程均在4°C條件下進行。
3.一種基于納米通道表面增強拉曼散射光譜檢測組氨酸對映體的方法，包括以下步驟: 以制備好的銀溶膠作為基底，取透過池溶液、銀溶膠和NaCl溶液混合均勻，用表面增強拉曼光譜測定透過池中D-組氨酸和L-組氨酸含量，考察殼聚糖修飾的金納米通道對D-組氨酸和L-組氨酸的分離效果。
【文檔編號】G01N21/65GK103896846SQ201410078954
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】黃杉生, 柳悅, 謝利, 馬騰飛, 楊樂樂 申請人:上海師范大學(xué)