基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法，其包括以下步驟：步驟一，金電極的預處理，3mm直徑的金電極依次經(jīng)P3000、P5000的碳化硅砂紙打磨，氧化鋁粉拋光，無水乙醇和雙蒸水各5min的超聲清洗；步驟二，將預處理的金電極與不同濃度的黑色素瘤生物標記物S100B或生物學樣本30℃溫育2.5小時；同時將2.5μM信號肽溶液與氯化銅30℃條件下按濃度比1∶1溫育以形成信號肽-銅離子復合物；與靶蛋白或生物學樣本溫育后的金電極經(jīng)雙蒸水沖洗，隨后與信號肽-銅離子復合物溶液30℃條件下溫育2.5小時，隨后即可記錄下銅離子的輸出信號。本發(fā)明具有良好的靈敏性和特異性，并具有簡單低耗等優(yōu)點。
【專利說明】基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種標記物的檢測方法，特別是涉及一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為一種極具侵襲力和高死亡率的腫瘤，黑色素瘤的特征主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)移方式的不可預測性和高度的復發(fā)和死亡風險，即使在手術(shù)治療后，患者的復發(fā)和死亡的風險仍然存在。因此，及時監(jiān)測腫瘤的進展和復發(fā)非常重要。近年來的研究結(jié)果表明，S100B(靶蛋白)是一種獨立的黑色素瘤生物標記物，它不僅與腫瘤的分期、疾病的進展和復發(fā)密切相關(guān)，而且還能提供黑色素瘤患者的預后信息并預測相應的治療效果。基于黑色素瘤生物標記物S100B這些獨特的生物學意義，目前已有相關(guān)文獻報道:作為黑色素瘤的生物標記物，S100B明顯優(yōu)于乳酸脫氫酶LDH，盡管乳酸脫氫酶是目前唯一應用于黑色素瘤臨床實踐的標記物。
[0003]檢測黑色素瘤患者外周血S100B的含量是實現(xiàn)上述生物學意義的基礎(chǔ)。目前已有的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫發(fā)光分析法(LIA)等，這些方法都依賴于高親和力的抗體去識別靶蛋白S100B。依賴抗體識別靶蛋白具有一定的局限性，主要體現(xiàn)在:(1)抗體作為一種蛋白，具有較復雜的化學結(jié)構(gòu)，因而不能通過人工合成實現(xiàn)。(2)抗體的生產(chǎn)需要細胞株或者動 物，生產(chǎn)過程復雜且生產(chǎn)周期較長；(3)抗體相對價貴且不穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法，其具有良好的靈敏性和特異性，并具有簡單低耗等優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題的:一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟:
[0006]步驟一,金電極的預處理,3mm直徑的金電極依次經(jīng)P3000、P5000的碳化娃砂紙打磨，I μ m、0.3 μ m的氧化鋁粉拋光，無水乙醇和雙蒸水各5min的超聲清洗；隨后將電極浸泡在水虎魚溶液5min及50%的硝酸30min ;最后由0.5M的硫酸電化學激活金電極；經(jīng)上述處理的金電極首先與50 μ L信號肽溶液4°C條件下孵育16小時,隨后室溫條件下將電極浸泡在100 μ MMNH溶液3小時占位，以阻斷電極表面的非特異性吸附；
[0007]步驟二，將預處理的金電極與不同濃度的黑色素瘤生物標記物S100B或生物學樣本30°C溫育2.5小時；同時將2.5μ M信號肽溶液與氯化銅30°C條件下按濃度比1:1溫育以形成信號肽-銅離子復合物；與靶蛋白或生物學樣本溫育后的金電極經(jīng)雙蒸水沖洗，隨后與信號肽-銅離子復合物溶液30°C條件下溫育2.5小時，隨后即可記錄下銅離子的輸出信號。
[0008]優(yōu)選地，所述金電極浸在Iml含有過量鄰苯二胺和Iul HCL的底物溶液中50°C水浴30min ;之后即可在底物反應溶液中記錄下具電化學活性的磷酸二銨的輸出信號。[0009]本發(fā)明的積極進步效果在于:S100B的生物識別和信號輸出都通過簡單的多肽實現(xiàn)。目前越來越多的文獻認為多肽具有很多優(yōu)點，這些優(yōu)點使得在某些情況下，多肽是一種比抗體更合適的選擇。首先，很多多肽都能與相應的靶蛋白特異性的結(jié)合，這種結(jié)合具有高度的親和力，因而可以實現(xiàn)對靶蛋白的生物識別；其次，多肽的化學結(jié)構(gòu)簡單明確，因而可以直接人工合成；再次，因為多肽具有簡單的化學結(jié)構(gòu)，因而我們可以根據(jù)不同的需要對多肽進行進一步的修飾；最后，通過與某些金屬離子結(jié)合，多肽可以作為信號輸出的載體，這與相對傳統(tǒng)的檢測方法的信號輸出方式相比，更加簡單易行。我們在與靶蛋白特異性結(jié)合的多肽上修飾了一個GHK基序，這個基序可以作為銅離子的螯合劑，銅離子具有電化學活性，因而螯合了銅離子的多肽可以將生物識別轉(zhuǎn)換為電輸出信號。此外，銅離子還能作為鄰苯二胺氧化的催化劑，反應生成同樣具有電化學活性的二氨基吩嗪。建立在催化基礎(chǔ)上的電化學信號放大策略使得本方法的檢測靈敏性明顯提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明的檢測原理示意圖。
[0011]圖2a為本發(fā)明的捕獲肽修飾的電極分別經(jīng)不同濃度S100B、2.5 μ M絡(luò)合了銅離子的信號肽孵育后得到的SWV信號圖。圖2b為3nM S100B組和空白對照組分別掃描得到DAP的CV信號曲線。
[0012]圖3a為檢測不同濃度S100B得到的DAP的SWV信號圖。圖3b顯示的是SWV的信號峰值與S100B濃度的對數(shù)值呈線性相關(guān)
[0013]圖4為DAP的SWV信號圖用以顯示本方法對S100B、BSA和空白對照的選擇性。
[0014]圖5檢測手術(shù)前 后黑色素瘤患者血樣本得到的DAP的SWV信號圖。
[0015]圖6a捕獲肽與3nM S100B孵育不同時間得到的DAP的SWV信號曲線。圖6b圖顯示的是不同孵育時間得到的信號峰值。
[0016]圖7a結(jié)合了 S100B的電極與絡(luò)合了銅離子的信號肽孵育不同時間得到的DAP的SWV信號曲線。余實驗步驟和條件均同圖6a。圖7b圖顯示的是不同孵育時間得到的信號峰值。
[0017]圖8a表示電極上銅離子催化含不同濃度OPD的底物溶液得到的DAP的SWV信號曲線。余實驗步驟和條件均同圖6a。圖8b顯示的是不同(PD濃度得到的信號峰值。Errorbar代表了平均標準偏差(η = 3)。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合圖1至圖8給出本發(fā)明較佳實施例，以詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0019]識別肽[k(MUA)-KRLRRSAHARKETEFLRLKRTRLGLE、凍干粉、純度>95% ]和信號肽[D(GHK)-KRLRRSAHARKETEFLRLKRTRLGLE、凍干粉、純度> 95% ]訂購于上?？齐纳锛夹g(shù)公司，重組人S100B蛋白(純度>95%)購于義翹神州生物公司，TCEP、MNH和BSA購于sigma公司，Spectra/Pro7標準級再生纖維素透析膜購于spectrum公司，其它試劑均為分析純，未經(jīng)額外處理，識別肽和信號肽凍干粉溶于20mM Tris-Hcl (pH7.5)。靶蛋白S100B凍干粉溶于含ImM TCEP (pH7.5)的20mM Tris-Hcl溶液，再根據(jù)實驗需要配置成不同濃度。所有溶液都用雙蒸水配置而成，雙蒸水是通過一個Mill1-Q的純化系統(tǒng)產(chǎn)生，其特異性阻抗大于 18M Ω cm。
[0020]本發(fā)明基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法包括以下步驟:
[0021]步驟一，金電極的預處理，3mm直徑的金電極依次經(jīng)P3000、P5000的碳化硅砂紙打磨，I μ m、0.3 μ m的氧化鋁粉拋光，無水乙醇和雙蒸水各5min的超聲清洗；隨后將電極浸泡在水虎魚溶液(濃硫酸:30 % H202 = 3:1) 5min及50 %的硝酸30min ;最后由0.5M的硫酸電化學激活金電極；經(jīng)上述處理的金電極首先與50 μ L信號肽溶液4°C條件下孵育(含
2.5 μ M信號肽和5mM TCEP，pH7.5) 16小時，隨后室溫條件下將電極浸泡在100 μ M MNH溶液(ρΗ7.5)3小時占位，以阻斷電極表面的非特異性吸附；
[0022]步驟二，將預處理的金電極與不同濃度的黑色素瘤生物標記物S100B或生物學樣本30°C溫育2.5小時(孵育前應在孵育體系中加入氯化鈣到終濃度為5mM，以便于靶蛋白和多肽的結(jié)合)；同時將2.5μΜ信號肽溶液與氯化銅30°C條件下按濃度比1:1溫育以形成信號肽-銅離子復合物；與靶蛋白或生物學樣本溫育后的金電極經(jīng)雙蒸水沖洗，隨后與信號肽-銅離子復合物溶液30°C條件下溫育2.5小時，隨后即可記錄下銅離子的輸出信號。為了將信號放大，提高檢測的靈敏性，將上述處理的金電極浸在Iml含有過量0PD(鄰苯二胺，2.5mg)和Iul HCL (鹽酸)的底物溶液中50°C水浴30min ;之后即可在底物反應溶液中記錄下具電化學活性的DAP(磷酸二銨)的輸出信號。
[0023]所有的電化學測定使用的都是CHI660D電化學工作站及傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，包括:飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為對電極，金電極為工作電極。為避免氧氣還原的干擾，檢測前使用的緩沖溶液均經(jīng)氮氣流除氧lOmin。絡(luò)合銅離子的SWV信號是在20mMTris-Hcl緩沖液(pH7.5)中掃描得到。實驗參數(shù)分別是:掃描范圍:0.4~-0.1V，階躍電勢:4mV，頻率，15Hz,振幅，25mV。生成的二氨基吩嗪的CV和SWV信號是在底物反應溶液中掃描得到，實驗參數(shù)如下:CV，掃描范圍，-0.24~-0.6V，速率，100mV/s。SWV，掃描范圍:-0.2~-0.6V，階躍電勢:4mV，頻率，15Hz，振幅，25mV。
[0024]圖1闡釋了以多肽為基礎(chǔ)SlOOB檢測方案的原理。SlOOB能以1: 2方式結(jié)合2條特異性肽。我們在其中一條多肽末端修飾MUA,將其固定在電極表面以識別靶蛋白SIOOB，而在另一條多肽的末端修飾了 GHK基序用以輸出電化學信號。這兩條肽被分別命名為識別肽和信號肽。在靶蛋白SlOOB存在的情況下，識別肽能特異性的識別并結(jié)合靶蛋白。隨后引入已經(jīng)與銅離子溫育的信號肽，已固定在電極組裝層面的靶蛋白可以進一步結(jié)合引入的信號肽，從而形成一個多肽-蛋白-多肽的復合物。信號肽氨基末端上GHK基序絡(luò)合的銅離子可以輸出相應的電化學信號，該信號與S100B的濃度是成比例的。為了提高本檢測方法的靈敏性，絡(luò)合的銅離子作為鄰苯二胺氧化反應的催化劑生成具有電化學活性的產(chǎn)物二氨基吩嗪，從而實現(xiàn)以催化為基礎(chǔ)的信號放大的目的。因為絡(luò)合銅離子的量與靶蛋白S100B的量是成比例的，生成的二氨基吩嗪的量與S100B的量也是成比例的，綜上所述，我們可以構(gòu)建出一種基于多肽的S100B檢測策略。
[0025] 采用方波伏安法(SWV)和循環(huán)伏安法(CV)來驗證本檢測方法的可行性。我們首先驗證了絡(luò)合銅離子的電化學信號，結(jié)果如圖2a所示:在沒有靶蛋白的情況下，從0.4V到-0.1V的掃描范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)任何信號。隨著靶蛋白濃度的增加，來自絡(luò)合銅離子的典型的SWV信號峰值也依次增加，提示多肽-蛋白-多肽的復合物的形成。隨后我們將絡(luò)合的銅離子用作鄰苯二胺氧化反應的催化劑，結(jié)果如圖2b所示:我們得到了反應生成的二氨基吩嗪的CV信號。此外我們還將空白對照代替靶蛋白重復實驗，結(jié)果未顯示出任何CV信號峰值。這是由于識別肽沒有結(jié)合靶蛋白，自然也沒有了靶蛋白結(jié)合信號肽等后續(xù)的化學事件。我們的實驗結(jié)果證實我們的檢測方法是可行的。
[0026]對部分實驗條件進行了優(yōu)化。首先，我們研究了識別肽與靶蛋白的溫育時間，2.5小時的溫育時間是最佳的。其次，我們對靶蛋白與信號肽的溫育時間也進行了摸索，2.5小時條件下靶蛋白與信號肽能充分結(jié)合，最后，為了使銅離子的催化能力發(fā)揮到最佳，我們對底物鄰苯二胺的量進行了評估，為了保證OPD的充分轉(zhuǎn)化，我們在隨后的實驗中選用了過量的 OPD (2.5mg/ml)
[0027]為了評估本檢測方法定量檢測靶蛋白S100B的可行性，我們引入了不同濃度的靶蛋白并記錄下相應的電化學信號，結(jié)果如圖3a所示:隨S100B濃度的不斷增加，典型的SWV的信號峰值也逐漸增加。兩者在0.1-25.6nM范圍內(nèi)存在一個很明顯的正相關(guān)，檢測下限是
0.1nM。對于每種靶蛋白濃度，我們至少重復三次獨立實驗，平均相對標準偏差< 5%，表明這種S100B的量化檢測方法具有良好的可重復性。
[0028]為了驗證本方法的特異性，我們進行了一系列的對照試驗，研究了 BSA和空白對照情況下所得到的信號數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示:與典型S100B的SWV峰值相比，盡管BSA的濃度(300nM)遠遠大于靶蛋白的濃度(3nM)，BSA組顯示出無意義的背景信號，而空白對照組則幾乎沒有顯示出信號反應，提示本體系的特異性良好。
[0029]對于黑色素瘤患者，S100B是一個非常有價值的標記物，將我們的方法應用于黑色素瘤患者血清S100B水平的檢測是很關(guān)鍵的。為此，我們采集了治療前后黑色素瘤患者的血樣本，并對其中S100B的含量進行了分析。結(jié)果見圖4:術(shù)前患者的血樣本顯示出一個明顯的信號峰值，提示血清中具有較高濃度的S100B，經(jīng)過有效的治療，術(shù)后患者的血清顯示信號峰值的明顯下降。這些數(shù)據(jù)表明我們的檢測方法在臨床樣本中是可行的。
[0030]綜上所述，我們設(shè)計了一種S100B檢測方法，人們可以根據(jù)不同的需要對簡單多肽進行相應的修飾，我們充分地利用了這一點，在信號肽上修飾了一個銅離子絡(luò)合基序，從而實現(xiàn)了信號的產(chǎn)生和放大。本檢測方法具有良好的敏感性、選擇性，以及操作的簡單性。對臨床患者的血樣本,也同樣具有較好的可行性。
[0031]本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改型和改變。因此，本發(fā)明覆蓋了落入所附的權(quán)利要求書及其等同物的范圍內(nèi)的各種改型和改變。
【權(quán)利要求】
1.一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟: 步驟一，金電極的預處理，3mm直徑的金電極依次經(jīng)P3000、P5000的碳化硅砂紙打磨，1μ m、0.3 μ m的氧化招粉拋光,無水乙醇和雙蒸水各5min的超聲清洗；隨后將電極浸泡在水虎魚溶液5min及50%的硝酸30min ;最后由0.5M的硫酸電化學激活金電極；經(jīng)上述處理的金電極首先與50 μ L信號肽溶液4°C條件下孵育16小時,隨后室溫條件下將電極浸泡在100 μ MMNH溶液3小時占位，以阻斷電極表面的非特異性吸附； 步驟二，將預處理的金電極與不同濃度的黑色素瘤生物標記物S100B或生物學樣本30°C溫育2.5小時；同時將2.5 μ M信號肽溶液與氯化銅30°C條件下按濃度比1:1溫育以形成信號肽-銅離子復合物；與靶蛋白或生物學樣本溫育后的金電極經(jīng)雙蒸水沖洗，隨后與信號肽-銅離子復合物溶液30°C條件下溫育2.5小時，隨后即可記錄下銅離子的輸出信號。
2.如權(quán)利要求1所述的基于多肽的黑色素瘤生物標記物的檢測方法，其特征在于，所述金電極浸在Iml含有過量鄰苯二胺和Iul HCL的底物溶液中50°C水浴30min ;之后即可在底物反應溶液中記錄下具電化學活性的磷酸二銨的輸出信號。
【文檔編號】G01N27/26GK104020194SQ201410117664
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】殷詠梅, 李根喜, 王曉盈, 仇金榮 申請人:殷詠梅