精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，基于代謝組學(xué)技術(shù)，為準(zhǔn)確評價精胺促進動物腸道發(fā)育整體營養(yǎng)代謝效果提供了新途徑；動物腸道代謝物譜圖的變化可充分反映營養(yǎng)、個體、環(huán)境等方面的綜合影響，可及時、靈敏地反映動物精胺營養(yǎng)及其代謝狀況與腸道發(fā)育之間的相關(guān)性。本發(fā)明可篩選出與腸道精胺營養(yǎng)過程相關(guān)的生物標(biāo)志物，揭示精胺營養(yǎng)過程的本質(zhì)，對完善動物的消化吸收功能，優(yōu)化飼料配方，提高動物的健康生長具有重要的理論與實踐意義，同時填補了結(jié)合代謝組學(xué)評價動物腸道發(fā)育整體營養(yǎng)代謝狀況，提高動物腸道發(fā)育的空白。研究結(jié)果在養(yǎng)殖業(yè)有實際的應(yīng)用價值。
【專利說明】精胺調(diào)控晡乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物營養(yǎng)代謝評價【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動物營養(yǎng)研究的主要目的是揭示營養(yǎng)過程的本質(zhì)，闡明營養(yǎng)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化過程中的動態(tài)量變規(guī)律。營養(yǎng)代謝始終是營養(yǎng)科學(xué)研究的核心。遺傳信息由基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄物向功能蛋白質(zhì)傳遞，最終有代謝產(chǎn)物來體現(xiàn)的。代謝是機體內(nèi)、外環(huán)境多種因素綜合影響的結(jié)果，涉及到多種物質(zhì)的作用。多種物質(zhì)參與的生命表現(xiàn)或生物學(xué)特性，既相互交織或平行發(fā)生，又呈級聯(lián)因果關(guān)系。傳統(tǒng)的研究手段無法揭示生物系統(tǒng)復(fù)雜的代謝機制。代謝組學(xué)是唯一適合探索營養(yǎng)與代謝復(fù)雜關(guān)系的研究方法，為研究營養(yǎng)素對動物機體的作用提供新的研究途徑，可篩選出與表型相關(guān)的生物標(biāo)志物和潛在關(guān)鍵代謝分子。代謝組學(xué)是生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的動態(tài)整體。代謝組學(xué)則是關(guān)于生物內(nèi)源代謝小分子整體及其變化規(guī)律的科學(xué)，客觀反應(yīng)機體營養(yǎng)狀態(tài)、疾病與健康的關(guān)系。細(xì)胞、組織、器官中代謝小分子的量和動態(tài)變化能實時反映生理調(diào)控過程的終點。因此，代謝組學(xué)是研究生物反應(yīng)的“終點”，代謝組學(xué)分析所獲得的信息與生物的表型或整體狀況的距離最近，是生物學(xué)現(xiàn)象的最終表現(xiàn)。將生物體代謝看作為一個整體的營養(yǎng)代謝組，對探索研究代謝整體的動態(tài)穩(wěn)衡穩(wěn)向規(guī)律和本質(zhì)，提供了一個全新的網(wǎng)絡(luò)研究平臺。這種新的探索研究模式，無疑更接近客觀實際、更有利于簡明生命本質(zhì)、闡明生物營養(yǎng)機制，是系統(tǒng)性地對所有營養(yǎng)素進行整體性研究的全新思路。目前代謝組學(xué)主要對機體體液、細(xì)胞或組織等內(nèi)源性代謝物質(zhì)進行定性定量研究。其檢測方法主要利用核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)、色譜(液相色譜(LC)、氣相色譜(GC))儀器。用如此的方法，可以實時、動態(tài)檢測接近生理條件下代謝分子。NMR優(yōu)點包括客觀性、重復(fù)性好，樣品不需繁瑣處理，具有無創(chuàng)性，具有獨特的定性和定量優(yōu)勢；目前，用NMR來測定細(xì)胞、體液(尿液、血液等)或組織中代謝小分子物質(zhì)研究較多，方法也比較成熟。用此分析手段檢測代謝小分子的種類、含量、狀態(tài)及其變化，建立代謝組數(shù)據(jù)。而后使用多變量數(shù)據(jù)分析方法，確定和研究相關(guān)代謝物變化涉及的代謝途徑，進而聯(lián)系該變化規(guī)律，從代謝層面上闡述機體對營養(yǎng)素作用的動態(tài)應(yīng)答。
[0003]當(dāng)前，幼齡動物腸道發(fā)育不健全制約生長性能是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)難題之一。要進一步提高生長性能，解決此問題的關(guān)鍵在于:快速促進幼齡動物腸道發(fā)育，加速腸道各項生理功能提前成熟，增強動物抵抗力。腸道發(fā)育就是腸道組織細(xì)胞增殖、增生、分化與分泌等生理功能的完善。適宜劑量的精胺對新生動物腸道的生長發(fā)育、小腸上皮細(xì)胞的增值、分化、遷移及損傷細(xì)胞的修復(fù)起關(guān)鍵作用。運用代謝組學(xué)理論、技術(shù)、方法進一步提高動物腸道發(fā)育，完善其消化吸收功能，優(yōu)化飼料配方，提高動物健康生長具有重要的理論與實踐意義。
[0004]目前尚無精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育生物標(biāo)志物的相關(guān)報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，旨在解決現(xiàn)有缺少結(jié)合代謝組學(xué)評價動物腸道發(fā)育整體營養(yǎng)代謝狀況，完善動物消化吸收功能，提高其健康生長的問題。
[0006]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，該基于代謝組學(xué)評價精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的方法包括以下步驟:
[0007]步驟一，采用精胺唯一差異原則或者雙交換實驗設(shè)計；
[0008]步驟二，動物腸道組織正確采集與處理；
[0009]步驟三，NMR檢測獲得原始數(shù)據(jù)，并對譜圖進行相位校正、基線調(diào)整、定標(biāo)、歸一化處理；
[0010]步驟四，主成分分析、偏最小二乘法判別分析及對模型的驗證；
[0011]步驟五，正交偏最小二乘法判別分析；
[0012]步驟六，生物標(biāo)志物的獲得及鑒定；
[0013]步驟七，對潛在關(guān)鍵代謝分子進一步功能性驗證。
[0014]進一步，在步驟二中，動物腸道采集方法為:
[0015]動物麻醉后解剖，取出相應(yīng)的腸段后立即在液氮中速凍至少一小時，然后放入零下80度冰柜存放。
[0016]進一步，使用電子天平稱取腸道60mg左右，均取組織的同一部位，分別放置于2ml的EP管中，加入Iml體積濃度為66.7%甲醇溶液以及30顆直徑2mm左右碳化鎢圓珠，在組織破碎儀上進行90s的破碎，然后在冰浴超聲波清洗儀超聲3min，然后在4°C，14500g高速離心lOmin，吸取上清液另置于新的2ml的EP管中，再重復(fù)破碎提取過程2次，將上清集合用真空離心濃縮儀揮去有機溶劑后使用冷凍干燥儀冷凍干燥。
[0017]進一步，將冷凍干燥的組織提取物粉末加入600 μ L磷酸緩沖液，充分振蕩混勻后，12000rpm離心lOmin，取上清液加入到核磁共振管中檢測。
[0018]進一步，磷酸緩沖液，包含0.lMNaH2P04/K2HP04 和 0.01%NaN3, 50% 的 D2O, 5.0mMDSS,用作化學(xué)位移指示劑，S 0.0Oppm, 0.01%NaN3用作細(xì)菌防腐劑。
[0019]進一步,在步驟三中，腸道組織樣品檢測是在BrukerAvanceII600MHz下進行,采用預(yù)飽和的1DN0ESY脈沖序列，取如下參數(shù):譜寬9，590Hz，混合時間0.ls，馳豫延遲時間2s，采樣點數(shù)49178 ;在馳豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰，譜儀偏置設(shè)置在水峰的位置。
[0020]進一步，NMR檢測技術(shù)獲得譜圖，并對譜圖進行處理；
[0021]使用Mestrenova8.1.2軟件,對所得NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖，進行相位校正、基線校正及定標(biāo)等處理，所有譜圖在傅立葉變換時均乘以增寬因子為IHz的指數(shù)窗函數(shù)及提高信噪比，對0.7 - 9.5ppm區(qū)間內(nèi)的譜圖按每段0.002ppm的寬度進行分段積分，同時排除包含溶劑峰部分δ 4.54?5.20以及甲醇物質(zhì)峰部分δ 1.15?1.20，δ 3.56?
3.63，將積分按每張譜的總積分強度歸一化。
[0022]進一步，將歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入版本11.0的Simca-p軟件分別進行主成分分析(PCA )、偏最小二乘判別分析(PLS-DA )和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA )。
[0023]進一步，綜合考慮組內(nèi)樣本數(shù)η，通過皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著性差異檢測，得到引起組間差異的代謝物，當(dāng)p〈0.05時，可以確定評估代謝物濃度具有顯著性變化，得出相應(yīng)的生物標(biāo)志物。結(jié)合層次聚類、Randomforest等方法,篩選出潛在的關(guān)鍵代謝分子。
[0024]進一步結(jié)合RT-PCR、RNA干擾等技術(shù)測定前面篩選到腸道發(fā)育調(diào)控潛在的關(guān)鍵代謝分子調(diào)節(jié)酶基因，進一步確認(rèn)此代謝分子的功能。
[0025]本發(fā)明提供精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，基于代謝組學(xué)技術(shù)，為準(zhǔn)確評價動物腸道發(fā)育整體營養(yǎng)代謝效果提供了新途徑；動物腸道代謝物譜圖的變化可充分反映營養(yǎng)、個體、環(huán)境等方面的綜合影響，可及時、靈敏地反映動物精胺營養(yǎng)及其代謝狀況與腸道發(fā)育之間的相關(guān)性。本發(fā)明可篩選出與腸道精胺營養(yǎng)過程相關(guān)的生物標(biāo)志物，揭示精胺營養(yǎng)過程的本質(zhì)，對完善動物的消化吸收功能，優(yōu)化飼料配方，提高動物的健康生長具有重要的理論與實踐意義，同時填補了結(jié)合代謝組學(xué)評價動物腸道發(fā)育整體營養(yǎng)代謝狀況，提高動物腸道發(fā)育的空白。研究結(jié)果在養(yǎng)殖業(yè)有實際的應(yīng)用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明實施例提供精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法流程圖；
[0027]圖2是本發(fā)明實施例提供短時間口服精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育代謝組主成分分析得分示意圖；
[0028]圖3是本發(fā)明實施例提供長時間口服精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育代謝組主成分分析得分示意圖；
[0029]圖4是本發(fā)明實施例提供短時間口服精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育代謝組偏最小二乘法判別分析得分示意圖；
[0030]圖5是本發(fā)明實施例提供長時間口服精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育代謝組偏最小二乘法判別分析得分示意圖；
[0031]圖6是本發(fā)明實施例提供短時間口服精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育代謝組正交偏最小二乘法判別分析得分示意圖；
[0032]圖7是本發(fā)明實施例提供長時間口服精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育代謝組正交偏最小二乘法判別分析得分示意圖。
【具體實施方式】
[0033]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0034]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0035]如圖1所示，本發(fā)明實施例的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育代謝組學(xué)方法包括以下步驟:
[0036]SlOl:采用精胺唯一差異原則或者雙交換實驗設(shè)計；
[0037]S102:動物腸道組織正確采集與處理；
[0038]S103:NMR檢測技術(shù)獲得原始數(shù)據(jù)，并對譜圖進行相位校正、基線調(diào)整、定標(biāo)、歸一化等處理；[0039]S104:主成分分析、偏最小二乘法判別分析及對模型的驗證；
[0040]S105:正交偏最小二乘法判別分析；
[0041]S106:生物標(biāo)志物的獲得及鑒定；
[0042]S107:對潛在關(guān)鍵代謝分子進一步功能性驗證。
[0043]通過以下具體實施例和實驗對本發(fā)明作進一步的說明:
[0044]實施例1:精胺對幼齡哺乳動物腸道發(fā)育的影響；
[0045]一、材料與方法:
[0046]1.實驗動物與實驗設(shè)計:
[0047]40只SD雌性健康哺乳仔鼠，分為對照組(生理鹽水)和處理組(精胺)，共4組。對8日齡的哺乳仔鼠灌胃精胺3天，7天，精胺劑量為0.2ymol/gBW，每個處理10個重復(fù)，每個重復(fù)I只哺乳仔鼠；
[0048]2.飼養(yǎng)管理:
[0049]所有哺乳仔鼠與母鼠單籠飼養(yǎng)于不銹鋼籠中，所有用具沖洗干凈后消毒，實驗期間室溫控制在20°C?25°C，相對濕度控制在40%?70%，自由采食和飲水，實驗期間觀察哺乳仔鼠與母鼠的采食、飲水和排糞、排尿規(guī)律及其精神狀態(tài)；
[0050]3.樣品的采集與保存:
[0051]實驗?zāi)┢?，哺乳仔鼠用乙醚麻醉后解剖，取對?yīng)的腸道放入預(yù)冷的EP管中，然后在液氮速凍至少I小時，然后轉(zhuǎn)入零下80度保存待測。
[0052]二、實驗結(jié)果:
[0053]有表1、表2可知，精胺顯著促進了哺乳仔鼠腸道的發(fā)育。
[0054]實施例2、精胺調(diào)控哺乳仔鼠腸道發(fā)育代謝組學(xué)研究方法
[0055]一、樣品前處理與數(shù)據(jù)采集:
[0056]1.樣品的準(zhǔn)備和檢測:
[0057]使用電子天平稱取腸道60mg左右，均取組織的同一部位，分別放置于2ml的EP管中，加入Iml體積濃素為66.7%甲醇溶液以及30顆直徑2_左右碳化鎢圓珠，在組織破碎儀上進行90s的破碎，然后在冰浴超聲波清洗儀超聲3min，然后在4°C，14500g高速離心IOmin,吸取上清液另置于新的2ml的EP管中，再重復(fù)破碎提取過程2次，將上清集合用真空離心濃縮儀揮去有機溶劑后使用冷凍干燥儀冷凍干燥。將冷凍干燥的組織提取物粉末加Λ 600 μ L 磷酸緩沖液(0.lMNaH2P04/K2HP04, 50% 的 D2O, pH7.4)，其中包含了 5.0mMDSS(用作化學(xué)位移指示劑，S 0.0Oppm)和0.01%NaN3 (用作細(xì)菌防腐劑)，充分振蕩表I精胺對哺乳
仔鼠小腸形態(tài)學(xué)的影響
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，該基于代謝組學(xué)技術(shù)評價精胺對動物腸道整體營養(yǎng)代謝狀況的方法包括以下步驟: 步驟一，采用精胺唯一差異原則或者雙交換實驗設(shè)計； 步驟二，動物腸道組織正確采集和處理； 步驟三，NMR檢測獲得原始數(shù)據(jù)，并對譜圖進行相位校正、基線調(diào)整、定標(biāo)、歸一化處理； 步驟四，主成分分析、偏最小二乘法判別分析及對模型的驗證； 步驟五，正交偏最小二乘法判別分析； 步驟六，生物標(biāo)志物的獲得及鑒定； 步驟七，對潛在關(guān)鍵代謝分子進一步功能性驗證。
2.如權(quán)利要求1所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，在步驟二中，動物腸道采集方法為: 動物麻醉后解剖，取出相應(yīng)的腸段后立即在液氮中速凍至少一小時，然后放入零下80度冰柜存放。
3.如權(quán)利要求2所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，使用電子天平稱取腸道組織60mg左右，均取組織的同一部位，分別放置于2ml的EP管中，加入1ml體積濃度為66.7%甲醇溶液以及30顆直徑2_左右碳化鎢圓珠，在組織破碎儀上進行90s的破碎，然后在冰浴超聲波清洗儀超聲3min，然后在4°C，14500g高速離心IOmin,吸取上清液另置于新的2ml的EP管中，再重復(fù)破碎提取過程2次，將上清集合用真空離心濃縮儀揮去有機溶劑后使用冷凍干燥儀冷凍干燥。
4.如權(quán)利要求3所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，將冷凍干燥的組織提取物粉末加入600 μ L磷酸緩沖液，充分振蕩混勻后，12000rpm離心IOmin ;取上清液加入到核磁共振管中檢測。
5.如權(quán)利要求4所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，磷酸緩沖液，包含0.lMNaH2P04/K2HP04和0.01%NaN3, 50%的D2O, 5.0mMDSS，用作化學(xué)位移指示劑，S 0.0Oppm,0.01%NaN3用作細(xì)菌防腐劑。
6.如權(quán)利要求1所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，在步驟三中，腸道組織樣品檢測是在BrukerAvanceII600MHz下進行，采用預(yù)飽和的1DN0ESY脈沖序列，取如下參數(shù):譜寬9，590Hz，混合時間0.ls，馳豫延遲時間2s，采樣點數(shù)49178 ;在馳豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰，譜儀偏置設(shè)置在水峰的位置。
7.如權(quán)利要求1所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，NMR檢測技術(shù)獲得譜圖，并對譜圖進行處理；
使用MeStren0Va8.1.2軟件，對所得NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖，進行相位校正、基線校正及定標(biāo)等處理，所有譜圖在傅立葉變換時均乘以增寬因子為IHz的指數(shù)窗函數(shù)及提高信噪比，對0.7 - 9.5ppm區(qū)間內(nèi)的譜圖按每段0.002ppm的寬度進行分段積分，同時排除包含溶劑峰部分δ 4.54~5.20以及甲醇物質(zhì)峰部分δ 1.15~1.20，δ 3.56~3.63，將積分按每張譜的總積分強度歸一化；然后將歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入版本11.0的Simca-p軟件分別進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)0
8.如權(quán)利要求1所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，綜合考慮組內(nèi)樣本數(shù)n，通過皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著性差異檢測，得到引起組間差異的代謝物，當(dāng)P〈0.05時，可以確定評估代謝物濃度具有顯著性變化，得出相應(yīng)的生物標(biāo)志物；結(jié)合層次聚類、Randomforest等方法,篩選出潛在的關(guān)鍵代謝分子。
9.如權(quán)利要求1所述的精胺調(diào)控哺乳動物腸道發(fā)育的代謝組學(xué)試驗方法，其特征在于，結(jié)合RT-PCR、RNA干擾等技術(shù)測定前面篩選到腸道發(fā)育調(diào)控潛在的關(guān)鍵代謝分子調(diào)節(jié)酶基因，進一步確認(rèn)此代謝分子的功能。
【文檔編號】G01N24/08GK103913478SQ201410140393
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】劉光芒, 賈剛, 陳小玲, 趙華, 汪靜 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)