專利名稱：修飾的精氨酸脫亞胺酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶、治療癌癥的方法，和治療和/或抑制轉(zhuǎn)移性病癥的方法。
背景技術(shù)：
惡性黑素瘤(階段3)和肝癌是在診斷一年內(nèi)殺死大多數(shù)患者的致命性疾病。美國(guó)每年大約有16,000人死于這些疾病。在美國(guó)黑素瘤的發(fā)病率正迅速地增長(zhǎng)，在其他國(guó)家，如澳大利亞其增長(zhǎng)速率甚至更高。在世界上肝炎流行的地方，肝癌的發(fā)病率更高，例如，在日本和臺(tái)灣，肝癌是首要的癌癥之一。急需對(duì)這些疾病進(jìn)行有效治療。
已有用選擇性去除必需氨基酸的方法來(lái)治療某些癌癥。最為著名的例子是利用L-天冬酰胺酶降低天冬酰胺的水平以治療急性成淋巴細(xì)胞白血病。最常用的L-天冬酰胺酶分離自大腸桿菌。但由于該酶所固有的抗原性和短循環(huán)半衰期使在臨床應(yīng)用中受到限制，參見(jiàn)Y.K.Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)。用聚乙二醇共價(jià)修飾的大腸桿菌L-天冬酰胺酶抗原性得以降低，循環(huán)半衰期得以延長(zhǎng)，參見(jiàn)Park，Anticancer Res.，同上；Y.Kamisald等，J Pharmacol.Exp.Ther.，216410-414(1981)；和Y.Kamisaki等，Gann.，7347-474(1982)。盡管已付出了許多努力試圖鑒定出其他用于治療癌癥的必需氨基酸降解酶，但沒(méi)有獲得成功，主要是因?yàn)橥ㄟ^(guò)限定去除必需氨基酸產(chǎn)生許多嚴(yán)重的副作用。
已有報(bào)道稱降解非必需氨基酸如精氨酸的酶，可能是控制某些癌癥的有效方法。例如，從惡臭假單胞菌(Pseudomonas pudita)中分離的精氨酸脫亞胺酶(ADI)，參見(jiàn)J.B.Jones，″精氨酸脫亞胺酶對(duì)鼠白血病成淋巴細(xì)胞的影響(The Effect of Arginine Deiminase on MurineLeukemic Lymphoblasts)″，博士論文，The University of Oklahoma，第1-165頁(yè)(1981)。盡管可在體外可有效地殺死腫瘤細(xì)胞，但由惡臭假單胞菌(P.pudita)中分離的ADI沒(méi)能在體內(nèi)顯示出功效，這是因?yàn)槠湓谥行詐H下幾乎不表現(xiàn)酶活性，并被迅速地從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液循環(huán)中清除。下述文獻(xiàn)中描述了來(lái)自精氨酸支原體(Mycoplasmaarginini)的精氨酸脫亞胺酶，參見(jiàn)例如Takaku等，Int.J.Cancer，51244-249(1992)和美國(guó)專利No.5,474,928，其所公開(kāi)的內(nèi)容在此引入作為參考。然而，這種異源蛋白質(zhì)的治療用途涉及到抗原性的問(wèn)題。也有描述稱利用聚乙二醇通過(guò)氰尿酰氯連接基團(tuán)對(duì)精氨酸支原體(Mycoplasme arginini)的精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾，參見(jiàn)Takaku等，Jpn.J Cancer Res.，841195-1200(1993)。但由于從氰尿酰氯連接基團(tuán)中釋放出氰化物，上述修飾后的蛋白在代謝中是有毒的。
目前需要既能降解非必需氨基酸，又不產(chǎn)生與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題的組合物。本發(fā)明涉及這些及其他重要目的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該精氨酸脫亞胺酶經(jīng)總重均分子量為約1,000到約50,000的聚乙二醇直接地或通過(guò)一種生物相容性連接基團(tuán)修飾。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及治療癌癥的方法，所述的癌癥包括例如肉瘤、肝癌和黑素瘤。本發(fā)明還涉及治療和/或抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。
本發(fā)明的這些及其他方面將在以下發(fā)明詳述部分予以闡明。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1表示精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列，所述的氨基酸序列克隆自精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)(上部的氨基酸序列SEQ IDNO1，稱作ADIPROT)、關(guān)節(jié)炎支原體(Mycoplasma arthritides)(中部的氨基酸序列SEQ ID NO2，稱作ARTADIPRO)和人型支原體(Mycoplasma hominus)(底部的氨基酸序列SEQ ID NO3，稱作HOMADIPRO)。
圖2A和2B表示單劑量天然精氨酸脫亞胺酶和經(jīng)聚乙二醇(如分子量5,000)修飾的精氨酸脫亞胺酶對(duì)小鼠血清精氨酸水平和血清瓜氨酸水平的作用。
圖3表示當(dāng)PEG10,000通過(guò)不同的連接基團(tuán)與ADI共價(jià)連接時(shí)對(duì)血清精氨酸水平的影響。
圖4表示用單劑量的PEG-ADI注射小鼠時(shí)，連接基團(tuán)和聚乙二醇的分子量對(duì)其中瓜氨酸產(chǎn)量的影響。
圖5A和5B表示由ADI-SS-PEG5,000引起的血清精氨酸和瓜氨酸水平的劑量反應(yīng)。圖5C和5D表示由ADI-SS-PEG20,000引起的血清精氨酸和瓜氨酸水平的劑量反應(yīng)。
圖6表示天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性。
圖7表示用ADI-SS-PEG5,000、ADI-SS-PEG12,000或ADI-SS-PEG20,000治療對(duì)注射了SK-mel 2人黑素瘤細(xì)胞的小鼠中的腫瘤大小的影響。
圖8表示用ADI-PEG20,000治療對(duì)注射了SK-mel 28、SK-mel 2或M24-met人黑素瘤細(xì)胞的小鼠中的腫瘤大小的影響。
圖9表示用ADI-PEG5,000、ADI-PEG12,000或ADI-PEG20,000治療對(duì)注射了人肝癌SK Hep1細(xì)胞的小鼠存活的影響。
圖10表示精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列，所述的氨基酸序列克隆自化膿鏈球菌(Steptococcus pyogenes)(上部的氨基酸序列SEQ IDNO6，稱作STRADIPYR)和肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)(底部的氨基酸序列SEQ ID NO7，稱作STRADIPNE)。
圖11表示精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列，所述的氨基酸序列克隆自布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(上部的氨基酸序列SEQ IDNO8，稱作BORADIBUR)和阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)(下部的氨基酸序列SEQ ID NO9，稱作BORADIAFZ)。
圖12表示Qiardiu intestinalis的氨基酸序列(上部的氨基酸序列SEQ ID NO10，稱作QIAADIINT)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)的氨基酸序列(中部的氨基酸序列SEQ ID NO11，稱作CLOADIPER)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的氨基酸序列(下部的氨基酸序列SEQ ID NO12，稱作BACADILIC)。
圖13表示糞腸球菌(Enterococcus faecalis)(上部的氨基酸序列SEQ ID NO13，稱作ENTADIFAE)和清酒乳芽孢桿菌(Lactobacillussake)的氨基酸序列(下部的氨基酸序列SEQ ID NO14，稱作LACADISAK)。
發(fā)明詳述正常細(xì)胞的生長(zhǎng)不需要精氨酸，這是因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^(guò)精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂解酶催化兩步反應(yīng)從瓜氨酸合成精氨酸。相反，黑素瘤、肝細(xì)胞瘤和一些肉瘤不表達(dá)精氨基琥珀酸合酶；所以，它們是精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。這個(gè)代謝差異可用來(lái)開(kāi)發(fā)對(duì)治療這些癌癥安全而有效的治療劑。精氨酸脫亞胺酶催化精氨酸向瓜氨酸轉(zhuǎn)化，可用于去除精氨酸。因此，精氨酸脫亞胺酶可用于治療黑素瘤、肝細(xì)胞瘤和一些肉瘤。
存在于微生物中的天然精氨酸脫亞胺酶是抗原性的且可被迅速地從患者的血液循環(huán)中清除。這些問(wèn)題可由經(jīng)聚乙二醇(PEG)共價(jià)修飾的精氨酸脫亞胺酶克服。經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾的精氨酸脫亞胺酶(有或者沒(méi)有連接基團(tuán))以下簡(jiǎn)稱″ADI-PEG″。與天然精氨酸脫亞胺酶相比，ADI-PEG保留了其大部分的酶活性、少得多的抗原性，大大延長(zhǎng)了循環(huán)半衰期，并在治療腫瘤方面更加有效。
″聚乙二醇″或″PEG″指支鏈或直鏈形式的環(huán)氧乙烷和水的縮合聚合物的混合物，由通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少為4。″聚乙二醇″或″PEG″與表示其近似平均分子量的數(shù)字后綴一起出現(xiàn)。例如，PEG5,000指總重均分子量約為5,000的聚乙二醇；PEG12,000指總重均分子量約為12,000的聚乙二醇；以及PEG20,000指總重均分子量約為20,000的聚乙二醇。
″黑素瘤″可能是一種由皮膚及其他器官，包括口腔、食管、肛管、陰道、柔腦膜和/或結(jié)膜或眼睛的黑素細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)展而來(lái)的惡性或良性腫瘤。術(shù)語(yǔ)″黑素瘤″包括例如肢端-雀斑(acral-lentiginous)黑素瘤、無(wú)黑色素性黑素瘤、良性幼態(tài)(juvenile)黑素瘤、惡性雀斑樣黑素瘤、惡性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、指甲下黑素瘤和表面?zhèn)鞑バ院谒亓觥?br> ″肝細(xì)胞瘤″可能是一種肝惡性或良性腫瘤，包括例如肝細(xì)胞癌。
″患者″指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。
″生物相容性″通常指這樣的物質(zhì)或化合物，它們不損害生物學(xué)功能、不產(chǎn)生任何程度的不可接受的毒性，包括過(guò)敏和病態(tài)。
本說(shuō)明書中使用下述的縮寫形式PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脫亞胺酶；SS，琥珀酸琥珀酰亞胺酯；SSA，琥珀酰亞胺基琥珀酰胺；SPA，丙酸琥珀酰亞胺酯；和NHS，N-羥基琥珀酰亞胺。
本發(fā)明是基于一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)，即經(jīng)聚乙二醇修飾的ADI對(duì)治療某些類型的癌癥和抑制癌擴(kuò)散具有顯著的效果。在通過(guò)或不通過(guò)連接基團(tuán)的情況下ADI可與聚乙二醇共價(jià)相連，在優(yōu)選的實(shí)施方案中利用了連接基團(tuán)。
在本發(fā)明中，精氨酸脫亞胺酶基因可從任何來(lái)源，包括如微生物、重組生物技術(shù)或其任意組合中衍生、克隆或產(chǎn)生。例如，精氨酸脫亞胺酶可從支原體屬(Mycoplasma)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、疏螺旋體屬(Borrelia)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Qiardia的微生物中克隆得到。所述精氨酸脫亞胺酶優(yōu)選克隆自肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、人型支原體(Mycoplasma hom、inus)、精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)、化膿鏈球菌(Steptococcuspyogenes)、肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、Qiardiaintestinalis、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳芽孢桿菌(Lactobacillus sake)或其任意組合。具體說(shuō)來(lái)，用于本發(fā)明的精氨酸脫亞胺酶可具有圖1和10-13所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，優(yōu)選地，所述精氨酸脫亞胺酶克隆自支原體屬的微生物。更優(yōu)選地，所述精氨酸脫亞胺酶克隆自精氨酸支原體(Mycoplasnia arginini)、人型支原體(Mycoplasma hominus)和關(guān)節(jié)炎支原體(Mycoplasnia arthritides)或其任意組合。具體說(shuō)來(lái)，用于本發(fā)明的精氨酸脫亞胺酶可具有圖1所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚乙二醇(PEG)具有總重均分子量為約1,000到約50,000；更優(yōu)選從約3,000到約40,000，更優(yōu)選從約5,000到約30,000；更優(yōu)選從約8,000到約30,000；更優(yōu)選從約11,000到約30,000；更優(yōu)選從約12,000到約28,000；更優(yōu)選從約16,000到約24,000；更優(yōu)選從約18,000到約22,000；更優(yōu)選從約19,000到約21,000以及最優(yōu)選約20,000。通常，具有30,000或更高分子量的聚乙二醇很難溶解，致使制劑產(chǎn)量大大降低。聚乙二醇可以是支鏈或直鏈的，優(yōu)選直鏈。通常，提高聚乙二醇的分子量降低ADI的免疫原性。具有本實(shí)施方案中描述的分子量的聚乙二醇可與ADI，以及任選與一種生物相容的連接基團(tuán)連接以治療癌癥，包括例如黑素瘤、肝細(xì)胞瘤和肉瘤，優(yōu)選黑素瘤。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚乙二醇具有總重均分子量約1,000到約50,000；優(yōu)選約3,000到約30,000；更優(yōu)選從約3,000到約20,000；更優(yōu)選從約4,000到約12,000；更優(yōu)選從約4,000到約10,000；更優(yōu)選從約4,000到約8,000；更優(yōu)選從約4,000到約6,000；最優(yōu)選約5,000。聚乙二醇可以是支鏈或直鏈的，優(yōu)選直鏈。具有本實(shí)施方案中描述的分子量的聚乙二醇可與ADI，以及任選與一種生物相容的連接基團(tuán)連接以治療癌癥，包括例如肝細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞瘤和肉瘤，優(yōu)選肝細(xì)胞瘤。
用于將ADI共價(jià)連接到PEG上的連接基因可以是任意的生物相容性連接基團(tuán)。如上所述，″生物相容的″指那些無(wú)毒的可在體外或體內(nèi)使用而不引起損傷、小恙、疾病或死亡的化合物或基團(tuán)。PEG可以通過(guò)例如醚鍵、酯鍵、硫醇鍵或酰胺鍵與連接基團(tuán)相連。合適的生物相容性連接基團(tuán)包括例如酯基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羥基、碳水化合物、琥珀酰亞胺基團(tuán)(包括例如琥珀酸琥珀酰亞胺酯(SS)、丙酸琥珀酰亞胺酯(SPA)、羧甲基化琥珀酰亞胺(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))、環(huán)氧基團(tuán)、氧基羰基咪唑基(包括例如羰基二咪唑基(CDI))、硝基苯基(包括例如碳酸硝基苯酯(NPC)或碳酸三氯苯酯(TPC))、trysylate基團(tuán)、醛基、異氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基團(tuán)、半胱氨酸基團(tuán)、組氨酸基團(tuán)或伯胺。優(yōu)選地，所述生物相容性連接基團(tuán)是酯基和/或琥珀酰亞胺基。更優(yōu)選地，該連接基團(tuán)是SS、SPA、SCM、SSA或NHS；更優(yōu)選SS、SPA或NHS，最優(yōu)選SS或SPA。
或者，ADI可通過(guò)氨基、巰基、羥基或羧基直接與PEG偶聯(lián)(即沒(méi)有連接基團(tuán))。
利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，可將ADI通過(guò)生物相容性連接基團(tuán)共價(jià)連接于PEG，參見(jiàn)例如，Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；以及Zaplipsky和Lee，Polyethylene Glycol ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris編，Plenum Press，NY，Chapter 21(1992)，其所公開(kāi)的內(nèi)容在此引入作為參考。
將PEG連接到ADI上可延長(zhǎng)ADI的循環(huán)半衰期。通常，PEG與ADI的伯胺相連。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知，在精氨酸脫亞胺酶上選擇聚乙二醇連接位點(diǎn)取決于該蛋白質(zhì)活性結(jié)構(gòu)域內(nèi)每一位點(diǎn)的作用。PEG可在基本上不損失酶活性的前提下連接到精氨酸脫亞胺酶的伯胺上。例如，由精氨酸支原體、關(guān)節(jié)炎支原體和人型支原體中克隆的ADI具有約17個(gè)可經(jīng)該程序修飾的賴氨酸。換句話說(shuō)，這17個(gè)賴氨酸都是使ADI通過(guò)生物相容性連接基團(tuán)與PEG相連的可能位點(diǎn)，所述的生物相容性連接基團(tuán)如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS。PEG也可與ADI在其他位點(diǎn)相連，根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
有1到約30個(gè)PEG分子可與ADI共價(jià)相連。優(yōu)選地，ADI經(jīng)約7到約15個(gè)PEG分子修飾，更優(yōu)選經(jīng)約9到約12個(gè)PEG分子修飾。換句話說(shuō)，精氨酸脫亞胺酶上約30％到約70％的伯氨基被PEG修飾，優(yōu)選約40％到約60％，更優(yōu)選約45％到約55％，最優(yōu)選精氨酸脫亞胺酶上約50％的伯氨基被PEG修飾。當(dāng)PEG共價(jià)連接到ADI末端時(shí)，優(yōu)選只利用了一個(gè)PEG分子。增加ADI上的PEG數(shù)目可延長(zhǎng)該酶的循環(huán)半衰期。然而，增加ADI上的PEG數(shù)目降低該酶的比活性。因此，需要在兩者之間達(dá)成平衡，根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明中，最優(yōu)選的生物相容性連接基團(tuán)的共同特征在于它們都是通過(guò)順丁烯二酰亞胺基團(tuán)與精氨酸脫亞胺酶的伯胺相連。一旦與精氨酸脫亞胺酶偶聯(lián)，SS-PEG有了鄰近PEG的酯鍵，這可使該位點(diǎn)對(duì)血清酯酶敏感，從而在體內(nèi)將PEG從ADI上釋放出來(lái)。SPA-PEG和PEG2-NHS不具有酯鍵，所以它們對(duì)血清酯酶不敏感。
在本發(fā)明中，特定的連接基團(tuán)似乎不影響PEG-ADI的循環(huán)半衰期或其特異酶活性。然而，在本發(fā)明中應(yīng)用生物相容性連接基團(tuán)非常重要。與蛋白相連的PEG可以是單鏈，如SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG，也可以用支鏈PEG，如PEG2-NHS。本發(fā)明中優(yōu)選的連接基團(tuán)結(jié)構(gòu)式如下闡述。

本發(fā)明的化合物之一的治療有效量是能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)的量。通常，治療以小劑量開(kāi)始，然后逐漸增加劑量直至達(dá)到所述環(huán)境下的最佳效果。通常，本發(fā)明的化合物的治療劑量可以是從約1到約200mg/kg，每周兩次到大約每?jī)芍芤淮巍＠?，所述劑量可以是約1mg/kg每周一次，相當(dāng)于2ml靜脈注射，到約20mg/kg每3天一次。ADI-SS-PEG5,000的最佳的劑量可以是約每周兩次，而ADI-SS-PEG20,000的最佳劑量可以是從一周大約一次到每?jī)芍艽蠹s一次。注射前，PEG-ADI可與磷酸鹽緩沖液或任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)溶液相混合。根據(jù)需要，所述的PEG-ADI制劑可以固體(冷干物)或液體劑型施用。
本發(fā)明的方法包括體外或體內(nèi)應(yīng)用。就體外應(yīng)用而言，包括細(xì)胞培養(yǎng)在內(nèi)，可將此處描述的化合物添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后溫育。應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的抗體生產(chǎn)工藝，本發(fā)明的化合物也可用于促進(jìn)單克隆和/或多克隆抗體產(chǎn)生。上述的單克隆和/或多克隆的抗體可用于多種診斷用途，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言也是顯而易見(jiàn)的。
在體內(nèi)施用本發(fā)明的化合物的途徑依所要達(dá)到的目的不同而有所不同。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到的，可通過(guò)下述方式施用本發(fā)明的PEG-ADI組合物，例如口服、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、腸胃外、靜脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肌內(nèi)、間質(zhì)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、滑膜內(nèi)、經(jīng)上皮和經(jīng)皮。
實(shí)施例通過(guò)下述的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例只是起說(shuō)明的作用，并不對(duì)本發(fā)明的范圍作任何限制。
實(shí)施例1重組ADI的產(chǎn)生精氨酸支原體(mycoplasnia arginini)(ATCC 23243)、人型支原體(mycoplasma hominus)(ATCC 23114)和關(guān)節(jié)炎支原體(mycoplasma arthritides)(ATCC 23192)的培養(yǎng)物從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville，Maryland獲得。
從精氨酸支原體(mycoplasnia arginini)、人型支原體(Mycoplasmahominus)和關(guān)節(jié)炎支原體(mycoplasma arthritides)中克隆出精氨酸脫亞胺酶并在大腸桿菌中表達(dá)，參見(jiàn)S.Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)，該文獻(xiàn)中所公開(kāi)的內(nèi)容在此以其全文引入作為參考。圖1給出了來(lái)自上述每一物種中的精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列。上部的氨基酸序列稱作ADIPROT來(lái)自于精氨酸支原體(mycoplasniaarginini)；中間的氨基酸序列稱作ARTADIPRO來(lái)自于關(guān)節(jié)炎支原體(mycoplasma arthritides)，以及下部的氨基酸序列稱作HOMADIPRO來(lái)自于人型支原體(Mycoplasma hominus)。每一氨基酸序列都有96％以上保守的序列。以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法表征每一蛋白質(zhì)的特異酶活性、Km、Vmax和最佳pH，表明它們彼此間在生物化學(xué)方面是不能區(qū)分的。用檸檬酸緩沖液(pH 5-6.5)、磷酸緩沖液(pH 6.5-7.5)和硼酸緩沖液(pH 7.5-8.5)確定最佳的pH。使酶與不同濃度的精氨酸一起溫育并測(cè)定瓜氨酸產(chǎn)量，由此確定Km和Vmax。不同酶的Km為約0.02到0.06μM，以及Vmax為約15-20μmol/分鐘/mg，這些值都在各自的標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍內(nèi)。
由源自己公開(kāi)的精氨酸支原體序列的引物對(duì)通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增精氨酸脫亞胺酶基因，參見(jiàn)例如T.Ohno等，Ihfect.Immun.，583788-3795(1990)，該文獻(xiàn)中所公開(kāi)的內(nèi)容在此以其全文引入作為參考SEQ ID NO4，5′-GGGATCCATGTCTGTATTTGACAGT-3′SEQ ID NO5，5′-TGAAAGCTTTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3′將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物以BamHI-HindIII片段的形式克隆到表達(dá)質(zhì)粒pQE16中。DNA序列分析表明通過(guò)PCR擴(kuò)增出的來(lái)自精氨酸支原體的片段與Ohno等，Infect.Immun.，同上中所公開(kāi)的精氨酸脫亞胺酶基因具有同樣的序列。在基因于大腸桿菌中表達(dá)前，通過(guò)寡核苷酸定點(diǎn)誘變將ADI基因中的5個(gè)編碼色氨酸的TGA密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)門GG，參見(jiàn)J.R.Sayers等，Biotechniques，13592-596(1992)。重組ADI以包涵體的形式表達(dá)，所述包含體占總細(xì)胞蛋白的10％。
來(lái)自上述三種支原體中的各物種的蛋白具有95％的同源性，且易于通過(guò)柱層析純化。從1公升發(fā)酵液中可純化出大約200mg純蛋白。重組ADI在37℃下能穩(wěn)定約兩星期，而在4℃下至少能保存8個(gè)月。應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)定出該蛋白對(duì)精氨酸具有高親合力(0.04μM)，最佳生理pH為約7.2到約7.4。
實(shí)施例2重組ADI的復(fù)性與純化使帶有較少修飾的ADI蛋白復(fù)性，參見(jiàn)Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)，該文獻(xiàn)中所公開(kāi)的內(nèi)容在此以其全文引入作為參考。將100g細(xì)胞漿重懸于800ml的10mM K2PO4、pH7.0，1mM EDTA(緩沖液1)中，在細(xì)胞微流量計(jì)(Microfluidizer)(Microfluidics Corporation，Newton，MA)中通過(guò)兩次以使細(xì)胞破裂。添加Triton-100達(dá)終濃度4％(v/v)。所述勻漿在4℃下攪拌30分鐘，然后以13,000g離心30分鐘。收集沉淀，將其重懸于1升含有0.5％ TritonX-100的緩沖液1中。用具有100kD截留率的中空纖維柱(Microgon Inc.，Laguna Hills，CA)對(duì)5倍體積的變性緩沖液(50mM Tris HCl、pH 8.5，10mM DTT)透濾上述溶液。加入鹽酸胍達(dá)終濃度6M，將所述溶液在4℃下攪拌15分鐘。使所得溶液于再折疊緩沖液1(10mM K2PO4、pH7.0)中稀釋100倍，并在15℃下攪拌48小時(shí)，15,000xg離心去除顆粒狀物。
將所得的上清液經(jīng)事先用再折疊緩沖液平衡過(guò)的Q Sepharose FastFlow(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)濃縮。用含有0.2M NaCl的再折疊緩沖液洗脫ADI。經(jīng)SDS-PAGE分析，由上述純化過(guò)程生成的ADI蛋白質(zhì)純度高于95％。從1kg細(xì)胞漿中可純化出8g純的復(fù)性的ADI蛋白，相當(dāng)于每公升發(fā)酵產(chǎn)物200mg純化的ADI。
用Oginsky等，Meth.Enzymol.，(1957)3639-642中描述的微修飾法測(cè)定ADI活性。將0.1M Na2PO4、pH 7.0(BUN試驗(yàn)緩沖液)中的10μl樣品置于96孔微滴定板中，添加40μl BUN試驗(yàn)緩沖液中的0.5mM精氨酸，蓋上培養(yǎng)板，于37℃下溫育15分鐘。添加20μl完全的BUN試劑(Sigma Diagnostics)，將滴定板在100℃下溫育10分鐘。將所述滴定板冷卻到22℃，并用微滴定板讀數(shù)儀(Molecular Devices，Inc)在490nm下分析。每分鐘將1μmol的L-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-胍氨酸的酶量規(guī)定為1.0IU。用Pierce考馬斯藍(lán)蛋白質(zhì)分析試劑(Pierce Co.，Rockford，IL)，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)確定蛋白濃度。
純化的ADI制品酶活性是17-25IU/mg。
實(shí)施例3PEG和ADI的連接在100mM、pH 7.4的磷酸緩沖液中將PEG與ADI共價(jià)相連。簡(jiǎn)言之，磷酸緩沖液中的ADI與過(guò)量的100mol PEG相混合。在室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后將所述混合物透析以去除非結(jié)合的PEG。
第一個(gè)實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)估PEG-ADI組合物中所用的連接基團(tuán)的作用。PEG和ADI通過(guò)四種不同的連接基團(tuán)即酯基或順丁烯二酰亞胺基包括SS、SSA、SPA和SSPA共價(jià)相連，其中PEG的總重均分子量為5,000、10,000、12,000、20,000、30,000和40,000；環(huán)氧基，環(huán)氧-PEG其中PEG的總重均分子量為5,000；以及分枝的PEG基團(tuán)，PEG2-NHS，其中PEG的總重均分子量為10,000、20,000和40,000。
將5.0IU的所得組合物注射到小鼠中(每組各5只小鼠)。為了測(cè)定精氨酸血清水平，對(duì)小鼠通過(guò)眼眶血管(retro orbital plexus)放血(100μl)。收集后立即加入等體積的50％(w/v)三氯乙酸。離心(13,000xg，30分鐘)去除沉淀，取上清于-70℃保存。用Beckman Instruments全自動(dòng)氨基酸分析儀和試劑，根據(jù)制造商所提供的方案分析樣品。該方法對(duì)精氨酸的靈敏度限度是大約2-6μM，測(cè)定值的重復(fù)性在約8％以內(nèi)。通過(guò)氨基酸分析確定血清精氨酸的量。如圖3結(jié)果所示，共價(jià)鍵合PEG和ADI的連接基團(tuán)對(duì)在體內(nèi)ADI減少血清精氨酸的能力沒(méi)有可評(píng)估的作用。換句話說(shuō)，除在體內(nèi)應(yīng)用必須使用無(wú)毒的連接基團(tuán)外，該連接基團(tuán)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不十分重要。
第二個(gè)實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)連接基團(tuán)和PEG的分子量在體內(nèi)對(duì)血清瓜氨酸水平的影響。小鼠(5只為一組)接受了5.0IU量的不同ADI和PEG-ADI的組合物。為了測(cè)定瓜氨酸血清水平，對(duì)小鼠通過(guò)眼眶血管放血(100μl)。收集后立即加入等體積的50％(w/v)三氯乙酸。離心(13,000xg，30分鐘)去除沉淀，取上清于-70℃保存。用BeckmanInstruments全自動(dòng)氨基酸分析儀和試劑，根據(jù)制造商所提供的方案分析樣品。該方法對(duì)瓜氨酸的靈敏度限度是大約2-6μM，測(cè)定值的重復(fù)性在約8％以內(nèi)。確定瓜氨酸的量，曲線下面的面積粗略估計(jì)并表示為μmol天。
在圖4中，空心圓圈表示由天然ADI產(chǎn)生的瓜氨酸的量，實(shí)心圓圈表示ADI-SC-PEG，空心方塊表示ADI-SS-PEG，空心三角形表示ADI-SPA-PEG，實(shí)心三角形表示支鏈PEG-NHS-PEG2。圖4所示的結(jié)果表明PEG的分子量決定PEG-ADI組合物的功效。除在體內(nèi)使用必須使用生物相容性連接基團(tuán)之外，PEG-ADI組合物的功效不必需依賴于PEG與ADI結(jié)合的方法或方式。
圖4的結(jié)果還表明PEG的最佳分子量是20,000。盡管在藥效方面PEG30,000似乎優(yōu)于PEG20,000，但PEG30,000可溶性差使其難于操作。產(chǎn)量依賴于酶活性回收，對(duì)于PEG5,000和PEG12,000約為90％；對(duì)PEG20,000約為85％，以及對(duì)PEG30,000約為40％。因此，如瓜氨酸產(chǎn)量所確定的，PEG20,000是在產(chǎn)量和循環(huán)半衰期之間達(dá)到平衡的最佳選擇。
第三個(gè)實(shí)驗(yàn)用于確定ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000對(duì)血清精氨酸消耗和瓜氨酸產(chǎn)量的劑量反應(yīng)。對(duì)小鼠(5只為一組)單次注射0.05IU、0.5IU或5.0IU的ADI-SS-PEG5,000或者ADI-SS-PEG20,000。如上所述在所示的時(shí)間收集血清，進(jìn)行氨基酸分析以量化血清精氨酸(圖5A和5C)和血清瓜氨酸(圖5B和5D)。兩種劑型都誘導(dǎo)劑量依賴性的血清精氨酸減少和血清瓜氨酸增加。然而，ADI-SS-PEG20,000的誘導(dǎo)效果比ADI-SS-PEG5,000的效果更明顯，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。
實(shí)施例4ADI介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的選擇性用一些人腫瘤證明精氨酸脫亞胺酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的選擇性。具體而言，在體外檢測(cè)人腫瘤對(duì)ADI-SS-PEG5,000(50ng/ml)的靈敏度。7天后確定培養(yǎng)物的生存力。在多于95％的細(xì)胞吸收臺(tái)盼藍(lán)染料的情況下，可將所述培養(yǎng)物定義為“抑制的”。也檢測(cè)了許多正常細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞均不受ADI-SS-PEG5,000的抑制。盡管精氨酸脫亞胺酶對(duì)正常細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有可測(cè)量的毒性，但是ADI-SS-PEG5,000卻大大抑制了全部的人黑素瘤和肝細(xì)胞瘤，這些瘤細(xì)胞是從ATCC、MSKCC和歐洲商購(gòu)。
表1精氨酸脫亞胺酶細(xì)胞毒性的專一性
在一組平行實(shí)驗(yàn)中，從所述腫瘤中分離mRNA。利用人精氨基琥珀酸合酶cDNA探針進(jìn)行Northern印跡分析，表明在精氨酸脫亞胺酶處理的靈敏度與不能表達(dá)精氨基琥珀酸合酶之間存在完全一致性。這些數(shù)據(jù)表明ADI毒性是由于其不能誘導(dǎo)精氨基琥珀酸合酶引起的。因此，這些細(xì)胞不能從瓜氨酸合成精氨酸，也不能合成生長(zhǎng)所必須的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5循環(huán)半衰期如圖2A和2B所示，Balb C小鼠(5只為一組)靜脈內(nèi)注射單劑量5.0IU的天然精氨酸脫亞胺酶或者不同劑型的經(jīng)聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶。為了測(cè)定精氨酸和瓜氨酸的血清水平，對(duì)小鼠通過(guò)眼眶血管放血(100μl)。收集后立即加入等體積的50％(w/v)三氯乙酸。離心(13,000xg，30分鐘)去除沉淀，取上清于-70℃保存。用BeckmanInstruments全自動(dòng)氨基酸分析儀和試劑，根據(jù)制造商所提供的方案分析樣品。該方法對(duì)精氨酸的靈敏度限度是大約6pM，測(cè)定值的重復(fù)性在約8％以內(nèi)。
單劑量施用天然ADI(實(shí)心圓圈)或ADI-SS-PEG(空心三角形)后，檢測(cè)到劑量依賴性的血清精氨酸水平降低，如圖2A的實(shí)心圓圈所示，和血清瓜氨酸升高，如圖2B中的空心三角形所示。然而血清精氨酸降低和血清升高都是短暫的，不久即恢復(fù)正常。精氨酸消耗的半衰期概括于下表。
表2血清精氨酸消耗的半衰期
該實(shí)驗(yàn)表明正常細(xì)胞和組織能在細(xì)胞內(nèi)將瓜氨酸轉(zhuǎn)變回精氨酸，而黑素瘤和肝細(xì)胞瘤不能，這是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈被晁岷铣擅浮?br> 實(shí)施例6PEG修飾的ADI的抗原性為了確定天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI SS-PEG20,000的抗原性，應(yīng)用下述文獻(xiàn)中所述的方法，參見(jiàn)Park，Ahticancer Res.，同上和Kamisaki，J.Pharmacol.Exp.Ther.，同上。簡(jiǎn)言之，每周對(duì)Balb C小鼠(5只為一組)靜脈內(nèi)注射大約0.5IU(100μg蛋白質(zhì))的天然ADI、ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000，共12周。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和第4、8和12周將所述動(dòng)物從眼眶后血管放血(0.05ml)。分離血清并貯存于-70℃。用ELISA測(cè)定抗-ADI IgG的效價(jià)。在96孔微滴定板的每孔中加入50μg ADI，室溫下溫育4小時(shí)。用PBS洗板，接著用牛血清白蛋白(1mg/ml)包被以封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)，在4℃下保存過(guò)夜。次日稀釋小鼠血清，并加到孔中。1小時(shí)后，用PBS洗板，并將偶聯(lián)了過(guò)氧化物酶的兔抗小鼠IgG加到孔中。板溫育30分鐘，然后用微滴定板讀數(shù)儀測(cè)定所得的UV吸光度。將效價(jià)單位定義為導(dǎo)致較背景吸光度(約0.50OD)高出兩倍的血清最高稀釋度。
結(jié)果如圖6所示。空心圓圈代表由注射抗原性很強(qiáng)的天然ADI的動(dòng)物所得的數(shù)據(jù)。實(shí)心圓圈代表由注射了ADI-SS-PEG5,000的動(dòng)物所獲得的數(shù)據(jù)，而空心三角形代表由注射了ADI-SS-PEG20,000的動(dòng)物所獲得的數(shù)據(jù)。從圖6中可以看出，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性顯著地低于天然ADI。例如，少至4次注射天然ADI導(dǎo)致約106的效價(jià)，而4次注射任何PEG-ADI劑型均未產(chǎn)生任何可測(cè)量的抗體。然而，在8次注射ADI-PEG5,000后產(chǎn)生了大約102的效價(jià)，而在12次注射以前，ADI-PEG20,000均未誘導(dǎo)如此的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。該結(jié)果表明PEG結(jié)合到ADI上鈍化了該蛋白的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例7人黑素瘤的腫瘤抑制在裸鼠中測(cè)定了PEG-ADI對(duì)人黑素瘤生長(zhǎng)的影響。給裸鼠(5只為一組)注射106SK-mel 2人黑素瘤細(xì)胞，并使所述細(xì)胞生長(zhǎng)到腫瘤直徑約3-5毫米。小鼠或不經(jīng)處理(空心圓圈)，或用5.0IU的ADI-SS-PEG5,000(實(shí)心三角形)、ADI-SS-PEG12,000(空心三角)或ADI-SS-PEG20,000(實(shí)心圓圈)每周處理一次，共8周。每周測(cè)定腫瘤的大小，所述腫瘤的平均直徑示于圖7中。
圖8表示ADI-SS-PEG20,000對(duì)在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的三種人黑素瘤(SK-mel 2、SK-mel 28、M24-met)的效果。給裸鼠(5只為一組)注射106SK mel 2、SK mel 28或M24-met人黑素瘤細(xì)胞。使所述腫瘤生長(zhǎng)到直徑約為3-5毫米。其后，上述動(dòng)物每周注射一次5.0IU的ADI-SS-PEG20,000。如圖8所示的結(jié)果表明，PEG-ADI抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，最終使腫瘤慢慢變小直至完全消失。因?yàn)槟[瘤沒(méi)有精氨基琥珀酸合成酶，它們不能合成蛋白質(zhì)(因?yàn)锳DI去除了精氨酸且腫瘤不能合成精氨酸)，因此該細(xì)胞“饑餓致死”。
由于M24-met人黑素瘤是高度轉(zhuǎn)移性的，注射了M24-met人黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物在處理4周后處死，測(cè)定動(dòng)物肺中轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目。對(duì)照動(dòng)物平均有32個(gè)轉(zhuǎn)移灶，而用ADI-SS-PEG20,000處理的動(dòng)物種沒(méi)有任何轉(zhuǎn)移灶。這一結(jié)果似乎表明，ADI-SS-PEG20,000不但抑制原發(fā)性黑素瘤的生長(zhǎng)而且抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
有趣的是，在200只以上的受試動(dòng)物中，對(duì)照組的平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)目為49±18，而在經(jīng)處理的動(dòng)物中僅有1只發(fā)現(xiàn)有單個(gè)轉(zhuǎn)移灶。
實(shí)施例8人肝細(xì)胞瘤的抑制檢測(cè)了PEG-ADI在體內(nèi)抑制人肝細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的能力。給裸鼠(5只為一組)注射106人肝細(xì)胞瘤SKHepl細(xì)胞。使所述的腫瘤生長(zhǎng)2周，然后用5.0IU的SS-PEG5,000-ADI(實(shí)心圓圈)、SS-PEG12,000-ADI(實(shí)心三角形)或SS-PEG20,000-ADI(空心三角形)處理所述動(dòng)物，每周一次。結(jié)果如圖9所示。未經(jīng)處理的動(dòng)物(空心圓圈)在3周內(nèi)全部死亡。相反，從圖9中可以看出，用ADI處理的動(dòng)物可有較長(zhǎng)的壽命。所存活的小鼠在6個(gè)月后處以安樂(lè)死，尸檢表明它們都沒(méi)有腫瘤。
令人驚訝的是，PEG5,000-ADI在體內(nèi)抑制肝細(xì)胞瘤生長(zhǎng)最有效。這種現(xiàn)象的恰切機(jī)理仍是未知的。本發(fā)明的工作不束縛于任何理論，似乎用SS-PEG5,000-ADI配制的蛋白在肝中被隔離開(kāi)了。較大分子量的PEG不是如此，這可能是因?yàn)楦蝺?nèi)皮的獨(dú)特性和空間的大小使較大分子量的PEG-ADI結(jié)合物被排除在外了。
實(shí)施例9對(duì)人的應(yīng)用將PEG5,000-ADI和PEG20,000-ADI在體外與正常人血清一同溫育，通過(guò)氨基酸分析確定其對(duì)精氨酸濃度的影響，其中發(fā)現(xiàn)該酶是完全活性的，并能以與在小鼠實(shí)驗(yàn)中相同的動(dòng)力學(xué)降解全部可檢測(cè)到的精氨酸。0.1ml的反應(yīng)體積在37℃下進(jìn)行1小時(shí)。
另外，在人血清中的精氨酸和瓜氨酸水平與在小鼠中發(fā)現(xiàn)的情況相同。PEG-蛋白質(zhì)在人中比在小鼠中循環(huán)更長(zhǎng)時(shí)間。例如，腺苷脫亞胺酶、天冬酰胺酶、glucocerbrocidase、尿酸酶、血球蛋白(hemoglobulin)和過(guò)氧化物歧化酶與PEG結(jié)合后，其循環(huán)半衰期都比相同制劑在小鼠中的循環(huán)半衰期長(zhǎng)5到10倍。這意味著，用于人的劑量通常是用于小鼠劑量的1/5到1/10。因此，PEG-ADI在人中應(yīng)當(dāng)比在小鼠中循環(huán)更長(zhǎng)的時(shí)間。
本說(shuō)明書中所引述的每一篇專利、專利申請(qǐng)和出版物均以其全文引入作為參考。
除此處所描述的以外，鑒于前文所述，本發(fā)明所做的任何改變對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)。這些修改也同樣落入本申請(qǐng)所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110> 鳳凰藥理學(xué)公司(Phoenix Pharmaceologics，Inc.)<120> 修飾的精氨酸脫亞胺酶(Modified Arginine Deiminase)<130> SCT031404-47<150> PCT/US01/29184<151> 2001-09-19<150> 09/723,546<151> 2000-11-28<160> 14<170> PatentIn version 3.2<210> 1<211> 410<212> PRT<213> 精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)<400> 1Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu1 5 10 15Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile20 25 30Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile35 40 45Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Ala Glu50 55 60Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Ile Asp Leu Val Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile Glu85 90 95Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Val100 105 110
Val Val Arg Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr Ser Arg Lys Leu Val115 120 125Glu Ile Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala130 135 140Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg145 150 155 160Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg165 170 175Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser180 185 190Asn His Pro Lys Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu195 200 205Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr210 215 220Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu225 230 235 240Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile245 250 255Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr260 265 270Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala275 280 285Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala290 295 300Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu Gln305 310 315 320Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly325 330 335Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
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<210>11<211>413<212>PRT<213>產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)<400>11Met Arg Asp Asp Arg Ala Leu Asn Val Thr Ser Glu Ile Gly Arg Leu1 5 10 15Lys Thr Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Ile Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Asp Leu Leu Asp Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Lys35 40 45Val Ala Arg Glu Glu His Asp Ala Phe Ala Gln Thr Leu Arg Glu Ala50 55 60Gly Val Glu Val Leu Tyr Leu Glu Val Leu Ala Ala Glu Ala Ile Glu65 70 75 80Thr Ser Asp Glu Val Lys Gln Gln Phe Ile Ser Glu Phe Ile Asp Glu85 90 95Ala Gly Val Glu Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala Leu Ile Glu Tyr Phe100 105 110Asn Ser Phe Ser Asp Asn Lys Ala Met Val Asp Lys Met Met Ala Gly115 120 125Val Arg Lys Glu Glu Leu Lys Asp Tyr His Arg Glu Ser Leu Tyr Asp130 135 140Gln Val Asn Asn Val Tyr Pro Phe Val Cys Asp Pro Met Pro Asn Leu145 150 155 160Tyr Phe Thr Arg Glu Pro Phe Ala Thr Ile Gly His Gly Ile Thr Leu165 170 175Asn His Met Arg Thr Asp Thr Arg Asn Arg Glu Thr Ile Phe Ala Lys180 185 190Tyr Ile Phe Arg His His Pro Arg Phe Glu Gly Lys Asp Ile Pro Phe
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<212>PRT<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<400>12Met Ile Met Thr Thr Pro Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Pro Leu1 5 10 15Lys Thr Val Met Leu Lys Arg Pro Gly Arg Glu Leu Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Glu Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Pro35 40 45Ala Val Gln Lys Glu His Asp Gln Phe Ala Glu Thr Leu Lys Gln Gln50 55 60Gly Ala Glu Val Leu Tyr Leu Glu Lys Leu Thr Ala Glu Ala Leu Asp65 70 75 80Asp Ala Leu Val Arg Glu Gln Phe Ile Asp Glu Leu Leu Thr Glu Ser85 90 95Lys Ala Asp Ile Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Lys Glu Phe Leu Leu100 105 110Thr Phe Asp Ala Asp Ser Met Val Glu Gln Val Met Ser Gly Ile Arg115 120 125Lys Asn Glu Leu Glu Arg Glu Lys Lys Ser His Leu His Glu Leu Met130 135 140Glu Asp His Tyr Pro Phe Tyr Leu Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe145 150 155 160Thr Arg Asp Pro Ala Ala Ala Ile Gly Ser Gly Leu Thr Ile Asn Lys165 170 175Met Lys Glu Pro Ala Arg Arg Arg Glu Ser Leu Phe Met Arg Tyr Ile180 185 190Ile Asn His His Pro Arg Phe Lys Gly His Glu Ile Pro Val Trp Leu195 200 205Asp Arg Asp Phe Lys Phe Asn Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Val Leu
210 215 220Asn Glu Glu Thr Val Ala Ile Gly Val Ser Glu Arg Thr Thr Ala Gln225 230 235 240Ala Ile Glu Arg Leu Val Arg Asn Leu Phe Gln Arg Gln Ser Arg Ile245 250 255Arg Arg Val Leu Ala Val Glu Ile Pro Lys Ser Arg Ala Phe Met His260 265 270Leu Asp Thr Val Phe Thr Met Val Asp Arg Asp Gln Phe Thr Ile His275 280 285Pro Ala Ile Gln Gly Pro Glu Gly Asp Met Arg Ile Phe Val Leu Glu290 295 300Arg Gly Lys Thr Ala Asp Glu Ile His Thr Thr Glu Glu His Asn Leu305 310 315 320Pro Glu Val Leu Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Asp Val Asn Leu Ile325 330 335Phe Cys Gly Gly Gly Asp Glu Ile Ala Ser Ala Arg Glu Gln Trp Asn340 345 350Asp Gly Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val Thr Tyr355 360 365Asp Arg Asn Tyr Ile Ser Asn Glu Cys Leu Arg Glu Gln Gly Ile Lys370 375 380Val Ile Glu Ile Pro Ser Gly Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro385 390 395 400Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Tyr Arg Glu Asp Val Lys405 410<210>13<211>408<212>PRT<213>糞腸球菌(Enterococcus faecalis)
<400>13Met Ser His Pro Ile Asn Val Phe Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys Thr1 5 10 15Val Met Leu His Arg Pro Gly Lys Glu Leu Glu Asn Leu Met Pro Asp20 25 30Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Glu Lys Ala35 40 45Gln Ala Glu His Asp Ala Phe Ala Glu Leu Leu Arg Ser Lys Asp Ile50 55 60Glu Val Val Tyr Leu Glu Asp Leu Ala Ala Glu Ala Leu Ile Asn Glu65 70 75 80Glu Val Arg Arg Gln Phe Ile Asp Gln Phe Leu Glu Glu Ala Asn Ile85 90 95Arg Ser Glu Ser Ala Lys Glu Lys Val Arg Glu Leu Met Leu Glu Ile100 105 110Asp Asp Asn Glu Glu Leu Ile Gln Lys Ala Ile Ala Gly Ile Gln Lys115 120 125Gln Glu Leu Pro Lys Tyr Glu Gln Glu Phe Leu Thr Asp Met Val Glu130 135 140Ala Asp Tyr Pro Phe Ile Ile Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr145 150 155 160Arg Asp Asn Phe Ala Thr Met Gly His Gly Ile Ser Leu Asn His Met165 170 175Tyr Ser Val Thr Arg Gln Arg Glu Thr Ile Phe Gly Gln Tyr Ile Phe180 185 190Asp Tyr His Pro Arg Phe Ala Gly Lys Glu Val Pro Arg Val Tyr Asp195 200 205Arg Ser Glu Ser Thr Arg Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Ile Leu Ser210 215 220Lys Glu Val Val Ala Ile Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp Ala Ala Ser
225 230 235 240Ile Glu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Phe Glu Gln Lys Leu Gly Phe Lys245 250 255Asn Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly Glu His Arg Lys Phe Met His Leu260 265 270Asp Thr Val Phe Thr Met Ile Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile His Pro275 280 285Glu Ile Glu Gly Gly Leu Val Val Tyr Ser Ile Thr Glu Lys Ala Asp290 295 300Gly Asp Ile Gln Ile Thr Lys Glu Lys Asp Thr Leu Asp Asn Ile Leu305 310 315 320Cys Lys Tyr Leu His Leu Asp Asn Val Gln Leu Ile Arg Cys Gly Ala325 330 335Gly Asn Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser Asn340 345 350Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Val Val Tyr Asp Arg Asn Thr355 360 365Ile Thr Asn Lys Ala Leu Glu Glu Ala Gly Val Lys Leu Asn Tyr Ile370 375 380Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met Ser385 390 395 400Met Pro Leu Tyr Arg Glu Asp Leu405<210>14<211>409<212>PRT<213>清酒乳芽孢桿菌(Lactobacillus sake)<400>14Met Thr Ser Pro Ile His Val Asn Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys Thr1 5 10 15
Val Leu Leu Lys Arg Pro Gly Lys Glu Val Glu Asn Ile Thr Pro Asp20 25 30Ile Met Tyr Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Pro Thr Ile35 40 45Gln Lys Glu His Asp Gln Phe Ala Gln Thr Leu Arg Asp Asn Gly Val50 55 60Glu Val Leu Tyr Leu Glu Asn Leu Ala Ala Glu Ala Ile Asp Ala Gly65 70 75 80Asp Val Lys Glu Ala Phe Leu Asp Lys Met Leu Asn Glu Ser His Ile85 90 95Lys Ser Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Lys Asp Tyr Leu Ile Ser Met100 105 110Ala Thr Leu Asp Met Val Glu Lys Ile Met Ala Gly Val Arg Thr Asn115 120 125Glu Ile Asp Ile Lys Ser Lys Ala Leu Ile Asp Val Ser Ala Asp Asp130 135 140Asp Tyr Pro Phe Tyr Met Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg145 150 155 160Asp Pro Ala Ala Ser Met Gly Asp Gly Leu Thr Ile Asn Lys Met Thr165 170 175Phe Glu Ala Arg Gln Arg Glu Ser Met Phe Met Glu Val Ile Met Gln180 185 190His His Pro Arg Phe Ala Asn Gln Gly Ala Gln Val Trp Arg Asp Arg195 200 205Asp His Ile Asp Arg Met Glu Gly Gly Asp Glu Leu Ile Leu Ser Asp210 215 220Lys Val Leu Ala Ile Gly Ile Ser Gln Arg Thr Ser Ala Gln Ser Ile225 230 235 240Glu Glu Leu Ala Lys Val Leu Phe Ala Asn His Ser Gly Phe Glu Lys
245 250 255Ile Leu Ala Ile Lys Ile Pro His Lys His Ala Met Met His Leu Asp260 265 270Thr Val Phe Thr Met Ile Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile His Pro Gly275 280 285Ile Gln Gly Ala Gly Gly Met Val Asp Thr Tyr Ile Leu Glu Pro Gly290 295 300Asn Asn Asp Glu Ile Lys Ile Thr His Gln Thr Asp Leu Glu Lys Val305 310 315 320Leu Arg Asp Ala Leu Glu Val Pro Glu Leu Thr Leu Ile Pro Cys Gly325 330 335Gly Gly Asp Ala Val Val Ala Pro Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser340 345 350Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val Thr Tyr Asp Arg Asn355 360 365Tyr Val Ser Asn Glu Asn Leu Arg Gln Tyr Gly Ile Lys Val Ile Glu370 375 380Val Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met385 390 395 400Ser Met Pro Leu Val Arg Arg Lys Thr40權(quán)利要求
1.一種包含通過(guò)連接基團(tuán)與聚乙二醇共價(jià)相連的精氨酸脫亞胺酶的化合物，其中所述聚乙二醇的總重均分子量為從約1,000到約40,000，以及所述的連接基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸酯基團(tuán)、酯基、環(huán)氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基團(tuán)、半胱氨酸基團(tuán)、組氨酸基團(tuán)及其組合。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的連接基團(tuán)是琥珀酰亞胺基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述琥珀酰亞胺基團(tuán)是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲基化琥珀酰亞胺、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺，N-羥基琥珀酰亞胺或其組合。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物，其中所述琥珀酰亞胺基團(tuán)是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯或其組合。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于支原體屬的微生物。
6.如權(quán)利要求5所述的化合物，其中所述的微生物選自精氨酸支原體(Mycoplasnia arginini)、人型支原體(Mycoplasma hominus)、關(guān)節(jié)炎支原體(Mycoplasma arthritides)及其組合。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于鏈球菌屬的微生物。
8.如權(quán)利要求7所述的化合物，其中所述的微生物選自化膿鏈球菌(Steptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)及其組合。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于疏螺旋體屬的微生物。
10.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中所述的微生物選自布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)及其組合。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于Qiardia屬的微生物。
12.如權(quán)利要求11所述的化合物，其中所述的微生物是Qiardiaintestinalis。
13.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于梭狀芽孢桿菌屬的微生物。
14.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中所述的微生物是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)。
15.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于腸球菌屬的微生物。
16.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中所述的微生物是糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
17.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于乳桿菌屬的微生物。
18.如權(quán)利要求17所述的化合物，其中所述的微生物是清酒乳芽孢桿菌(Lactobacillus sake)。
19.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于芽孢桿菌屬的微生物。
20.如權(quán)利要求19所述的化合物，其中所述的微生物是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
21.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的微生物選自肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、人型支原體(Mycoplasma hominus)、精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)、化膿鏈球菌(Steptococcuspyogenes)、肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、Qiardiaintestinalis、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳芽孢桿菌(Lactobacillus sake)及其組合。
22.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶共價(jià)連接于約7到約15個(gè)聚乙二醇分子。
23.如權(quán)利要求22所述的化合物，其中所述的精氨酸脫亞胺酶共價(jià)連接于約9到約12個(gè)聚乙二醇分子。
24.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的聚乙二醇的總重均分子量為從約10,000到約30,000。
25.一種延長(zhǎng)精氨酸脫亞胺酶的循環(huán)半衰期的方法，該方法包括通過(guò)連接基團(tuán)把所述的精氨酸脫亞胺酶與聚乙二醇共價(jià)相連來(lái)修飾所述的精氨酸脫亞胺酶，其中所述的聚乙二醇的總重均分子量為從約1,000到約4,000，以及所述的連接基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸酯基團(tuán)、酯基、環(huán)氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基團(tuán)、半胱氨酸基團(tuán)、組氨酸基團(tuán)及其組合。
26.一種增強(qiáng)精氨酸脫亞胺酶抗腫瘤活性的方法，該方法包括通過(guò)連接基團(tuán)把所述的精氨酸脫亞胺酶與聚乙二醇共價(jià)相連來(lái)修飾所述的精氨酸脫亞胺酶，其中所述的聚乙二醇分子的總重均分子量為從約1,000到約4,000，以及所述的連接基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸酯基團(tuán)、酯基、環(huán)氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基團(tuán)、半胱氨酸基團(tuán)、組氨酸基團(tuán)及其組合。
27.一種治療患者的腫瘤的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用如權(quán)利要求1所述的化合物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的腫瘤是黑素瘤。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的聚乙二醇的總重均分子量約為20,000。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的連接基團(tuán)是琥珀酰亞胺基團(tuán)。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述琥珀酰亞胺基團(tuán)是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲基化琥珀酰亞胺、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺或其組合。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的腫瘤是肝細(xì)胞瘤。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述聚乙二醇的總重均分子量約為5,000。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的連接基團(tuán)是琥珀酰亞胺基團(tuán)。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述琥珀酰亞胺基團(tuán)是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲基化琥珀酰亞胺、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺或其組合。
36.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的腫瘤是肉瘤。
37.一種治療和抑制患者腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用如權(quán)利要求1所述的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶、治療癌癥的方法以及治療和/或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1518595SQ01819673
公開(kāi)日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2001年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月28日
發(fā)明者邁克·A·克拉克, 邁克 A 克拉克 申請(qǐng)人:鳳凰藥理學(xué)公司