一株生產(chǎn)戊二胺的基因工程菌及其制備戊二胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一株能高效生產(chǎn)戊二胺的基因工程菌及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 1，5-戊二胺，又名尸胺（cadaverine)、1，5-二氨基戊燒、五亞甲基二胺或尸毒素， 是脂肪族生物胺類（包括精胺、腐胺、亞精胺和戊二胺等）中的一種。1885年，德國柏林的 醫(yī)師LudwigBrieger在腐敗的尸體中首次發(fā)現(xiàn)該胺類，并W此得名尸胺。在細(xì)胞內(nèi)，戊二 胺是賴氨酸合成途徑的延伸反應(yīng)，是賴氨酸在賴氨酸脫簇酶巧.C. 4. 1. 1. 18)的作用下脫 簇產(chǎn)生的（如附圖1)，作為一種肉毒胺存在于腐敗物中，與鳥氨酸的脫簇產(chǎn)物腐胺一樣都 是生物尸體腐敗產(chǎn)生的氣味中的一種成分。運(yùn)種二胺不僅與腐敗作用有關(guān)，生物活體在生 命代謝中也會產(chǎn)生少量的戊二胺，是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿。
[0003] 戊二胺具有許多重要的生理功能，如戊二胺是微生物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)鐵離子濃度的 "鐵親和系統(tǒng)"和一些嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌膚聚糖的主要組成成分；戊二胺在關(guān)閉微孔 蛋白通道和保護(hù)大腸桿菌免受氧的毒害方面也起著重要的作用；內(nèi)源性戊二胺的分泌W及 胞內(nèi)高濃度戊二胺積累可導(dǎo)致外膜滲透性降低，抑制某些抗生素如頭抱霉素類抗生素的作 用。
[0004] 戊二胺在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和工業(yè)上均具有廣泛的應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)上，外源施加戊二胺可W 改善坐果和促進(jìn)果實(shí)發(fā)育，提高果實(shí)的產(chǎn)量；在醫(yī)學(xué)上，它也可作為一種有效治療頻疾的藥 物；在工業(yè)上，戊二胺與二元酸進(jìn)行聚合反應(yīng)可合成優(yōu)質(zhì)高分子材料。 陽〇化]微生物法生產(chǎn)戊二胺，是一條新穎且具有潛在競爭力的生產(chǎn)途徑，而現(xiàn)有技術(shù)更 多的關(guān)注在賴氨酸脫簇酶的表達(dá)和重組菌的構(gòu)建等。
[0006] 如：由日本的東麗株式會社申請的專利號為公開號為CN102844440A的中國專 利《1，5-戊二胺的制造方法》公開了一種利用微生物發(fā)酵的1，5-戊二胺的制造方法，所 使用的微生物是染色體中具有LDC基因的棒狀桿菌，可使棒狀桿菌在培養(yǎng)過程中持續(xù)保持 20mU/mg蛋白W上的賴氨酸脫簇酶活性。 陽007] 德國的己斯夫歐洲公司申請的公開號為CN101389765A的專利《生產(chǎn)尸胺的方 法》公開了一種通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法 [000引德國的贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司申請的公開號為CN101240258A的專利則公布 了戊二胺制備相關(guān)專利關(guān)注的是發(fā)酵條件優(yōu)化和重組菌構(gòu)建過程的保護(hù)。
[0009] 可見，現(xiàn)有技術(shù)并沒有在如何更高效的制備用于戊二胺合成的催化細(xì)胞方面進(jìn)行 技術(shù)創(chuàng)新性研究。本發(fā)明則通過建立戊二胺合成所需催化細(xì)胞及其高效制備方法，從而實(shí) 現(xiàn)戊二胺的大規(guī)模制備過程。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種可高效生產(chǎn)戊二胺的基因工程菌W及利 用其制備戊二胺的高效制備工藝。
[0011] 本發(fā)明所提供的技術(shù)方案之一是，提供一種可高效生產(chǎn)戊二胺的基因工程菌，所 述基因工程菌其賴氨酸脫簇酶啟動(dòng)子IdcCp被替換為環(huán)境/營養(yǎng)因素控制型啟動(dòng)子，使得 生產(chǎn)菌株在生長過程中不大量合成目標(biāo)酶，即目標(biāo)酶的痕量合成不影響細(xì)胞生長，而在生 長完成后通過改變環(huán)境/營養(yǎng)因素快速過量表達(dá)目標(biāo)酶及其輔因子。
[0012] 進(jìn)一步的，所述基因工程菌其出發(fā)菌株，可W為大腸桿菌K12、D冊α、W3110、BL21、 MG1655 等；
[0013] 更進(jìn)一步的，所述出發(fā)菌株為大腸桿菌B0013-070;
[0014] 進(jìn)一步的，所述環(huán)境/營養(yǎng)因素控制型啟動(dòng)子可W是抑、溫度、溶氧等控制型啟動(dòng) 子，也可W是多種營養(yǎng)因素如乳糖、木糖、阿拉伯糖等控制型啟動(dòng)子；
[0015] 更進(jìn)一步的，所述控制型啟動(dòng)子為溫度調(diào)控性啟動(dòng)子動(dòng)子；
[0016] 所述Pk-Pl啟動(dòng)子的核巧酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示；
[0017] 進(jìn)一步的，所述基因工程菌在替換啟動(dòng)子的同時(shí)表達(dá)信號膚，使得重組菌株可W 在細(xì)胞周質(zhì)空間大量表達(dá)賴氨酸脫簇酶；
[0018] 所述信號膚由基因pelBs編碼，核巧酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示；
[0019] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所提供的基因工程菌為大腸埃希氏菌巧scherichiacoli)42#, 所述菌株已于2014年12月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101)，保藏編號CGMCCNo. 10240。
[0020] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明菌種在較低的溫度下，如25~36°C，目標(biāo)酶編碼基因IdcC的 轉(zhuǎn)錄被強(qiáng)烈抑制；而在較高溫度下，如37~50°C，目標(biāo)酶編碼基因IdcC的轉(zhuǎn)錄被強(qiáng)烈啟 動(dòng)。
[0021] 本發(fā)明所提供的技術(shù)方案之二：是一種制備戊二胺的高效工藝，所述制備工藝是 利用技術(shù)方案一所述的基因工程菌為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)戊二胺，在發(fā)酵初期的6~12h內(nèi)， 培養(yǎng)溫度控制在25~36°C，進(jìn)行菌體的快速生長；在余下的發(fā)酵階段溫度控制在37~ 50°C，誘導(dǎo)產(chǎn)酶1~化，轉(zhuǎn)化2~化，產(chǎn)戊二胺水平達(dá)到10.6~11.6% (w/v)或W上；其工 藝特征是：25~5(TC的條件下，分別經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)菌體，變溫高效產(chǎn)酶和目標(biāo)產(chǎn)物快速轉(zhuǎn) 化Ξ個(gè)階段，產(chǎn)戊二胺水平達(dá)到106-116. 8g/l，賴氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了理論轉(zhuǎn)化率的91 %~ 97% ；
[0022] 進(jìn)一步的，發(fā)酵過程中使用的培養(yǎng)基為全合成培養(yǎng)基；
[0023] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明建立的關(guān)鍵酶高效制備工藝和快速轉(zhuǎn)化工藝不限于戊二胺的 制備，還包括具有類似反應(yīng)過程的其他化學(xué)品，如丙酬酸、丙氨酸、乳酸、α-酬戊二酸、下二 酸、衣康酸W及多種功能糖等等。
[0024] 有益效果：
[0025] 1、本發(fā)明提供的基因工程菌具有明顯的高效轉(zhuǎn)化賴氨酸合成戊二胺的能力，菌 種在25~50°C的條件下培養(yǎng)6~12h，誘導(dǎo)產(chǎn)酶1~化，轉(zhuǎn)化2~化，從培養(yǎng)細(xì)胞到戊 二胺轉(zhuǎn)化完成工耗時(shí)9-25h，產(chǎn)戊二胺水平達(dá)到10.6~11.6% (w/v)或W上，產(chǎn)量達(dá)到 106-116.8g/L;
[00%] 2、本發(fā)明中使用的表達(dá)宿主菌其表達(dá)酶的過程在細(xì)胞膜完成，最終表達(dá)的酶介于 細(xì)胞內(nèi)膜與細(xì)胞壁之間，而不釋放的發(fā)酵體系中，進(jìn)而可W實(shí)現(xiàn)催化細(xì)胞的重復(fù)使用。
[0027] 3、由于本發(fā)明所制備的基因工程就其出發(fā)菌株為大腸桿菌，因此表達(dá)催化劑的細(xì) 胞同時(shí)可W完成輔因子的合成，在用于賴氨酸轉(zhuǎn)化為戊二胺的過程中可W使用完整的細(xì)胞 直接進(jìn)行底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，細(xì)胞同時(shí)起到了提供催化劑作用的場所和保護(hù)催化劑活性的 作用，其中輔因子的存在為催化劑的高活性提供了保證。
[0028] 4、本發(fā)明的戊二胺生物轉(zhuǎn)化基因工程菌，在菌體培養(yǎng)過程中，采用全合成培養(yǎng)基， 培養(yǎng)液澄清，有利于后續(xù)產(chǎn)品分離提取；本發(fā)明轉(zhuǎn)化過程使用的原料可W是未經(jīng)后提取處 理的賴氨酸發(fā)酵料液；本發(fā)明轉(zhuǎn)化過程的效率不受賴氨酸發(fā)酵料液殘余物的影響；本發(fā) 明設(shè)及的轉(zhuǎn)化過程完成后形成的戊二胺鹽易于后提取和純化。5、本發(fā)明的戊二胺生物轉(zhuǎn)化 基因工程菌，在菌體培養(yǎng)、誘導(dǎo)產(chǎn)酶和高效轉(zhuǎn)化過程中，戊二胺積累達(dá)較高水平，為后續(xù)提 取純化提供了便捷。
[0029] 6、本發(fā)明的戊二胺高效轉(zhuǎn)化過程：用于催化的菌體細(xì)胞生長溫度在25~36°C下 利用葡萄糖快速生長6~12h，形成菌體；快速誘導(dǎo)產(chǎn)酶1~化后，在37~50°C下快速轉(zhuǎn) 化賴氨酸合成戊二胺。即：運(yùn)用本發(fā)明的重組菌及其戊二胺制備工藝，戊二胺的生產(chǎn)過程僅 需改變發(fā)酵溫度控制參數(shù)，即可實(shí)現(xiàn)W賴氨酸為原料高效生成戊二胺。
【附圖說明】
[0030] 圖1賴氨酸脫簇反應(yīng)；
[0031] 圖2重組質(zhì)粒pT-ldcC的物理圖譜；
[0032]圖3賴氨酸脫簇酶啟動(dòng)子功能鑒定結(jié)果；
[0033] 圖4賴氨酸脫簇酶信號膚功能鑒定結(jié)果；
[0034] 圖5戊二胺局效制備流程圖；
[0035] 圖6戊二胺HPLC檢測圖譜；
[0036] 圖7小試水平戊二胺轉(zhuǎn)化進(jìn)程；
[0037] 圖8規(guī)?；a(chǎn)下戊二胺轉(zhuǎn)化進(jìn)程。
【具體實(shí)施方式】：
[0038] 實(shí)施例1:大腸桿菌染色體賴氨酸脫簇酶溫度調(diào)控型啟動(dòng)子和信號膚的替換
[0039]1，IdcC基因部分序列的克隆 W40]W大腸桿菌B0013-070染色體DNA為模板，用引物ldc-upl(SEQIDN0:：3)和ldc-up2(SEQIDN0:4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增IdcC5'端及其上游序列（IdcC-up)，兩端通過引物 加入EcoRI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物大小~92化P;將PCR產(chǎn)物克隆入pMD-18T-simple，獲得重組質(zhì) 粒pU)C-UP;
[0041] Idc-upl：GGAATTCGCAACCTGCGTGAAATGTC；EcoRI
[0042] ldc-up2：GGAATTCTGAACGGCGGTGTAATGTT；EcoRI
[0043] 2,IdcC基因重組同源臂的獲得
[0044]EcoRI酶切重組質(zhì)粒pLDC-UP釋放915bp和2. 7化片段；W重組質(zhì)粒pLDC-up的 DNA為模板，用引物ldc-invF(SEQIDN0:5)和ldc-invR(SEQIDN0:6)進(jìn)行反向PCR擴(kuò) 增，PCR產(chǎn)物為IdcC基因上游部分序列含啟動(dòng)子部分，即LDC-up大小~3. 57化。
[0045] Idc-invF：GTTCGGATCCGAACATCATTGCCATTATGGGAC；BamHI
[0046] Idc-invR：GGGCTCAAACCGTGGCGATAAA
[0047] 3,溫控型啟動(dòng)子和分泌型信號膚的獲得
[0048] PCR擴(kuò)增PPL451 (Gene, 1996, 176:49 ~53)的pL啟動(dòng)子（引物pkF(SEQID N0:7)和pkR(SEQIDN0:8))，PCR產(chǎn)物大小~1.37化。PCR產(chǎn)物用BamHI和Spel度cul) 酶切、pET-2化用Bglll和甜al、連接轉(zhuǎn)化溫控型啟動(dòng)子片段pL和信號膚序列pelBs獲得 質(zhì)粒pPkpelBs,大小5. 0化；SmaI和BamHI雙酶切pPkpelBs，膠分離pkpelBs片段，大 小1. 48化。
[0049] pL-F：ATCAGGATCCCGGGTGATGATTATCAGCCAGCAGAGATT；Ba