一種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測【技術領域】，涉及一種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色傳感檢測方法。向0.05～10mM?PNC中加入1～50mg/mL的EDC和1～50mg/mL的NHS，反應5～90min，與1～100μg/L的微囊藻毒素抗體混合，10～50℃震蕩1～24h，靜置1～24h。用截留分子量為30K納濾膜進行分離，加入不大于10μg/L的微囊藻毒素，30～50℃震蕩0.5～12h，用截留分子量為50K的納濾膜對產物進行分離，加入0.01～10mg/mL顯色劑1～60min，加入0.1～10.0M終止液。比傳統(tǒng)酶檢測方法成本低，穩(wěn)定性、實用性強。
【專利說明】—種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測【技術領域】，涉及一種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色傳感檢測方法。
【背景技術】
[0002]微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一類由產毒水華藍藻分泌的次級代謝物質，具有強烈的肝毒性。其中，毒性最大的Microcystin-LR (MC-LR)對小白鼠的LD5tl值僅為43 μ g/kg,低于劇毒物質氰化鉀。如今，水體富營養(yǎng)化程度加劇,水華頻發(fā),飲用水源水和自來水廠出水中均有微囊藻毒素檢出，其對水體環(huán)境和人群健康造成嚴重威脅，已成為全球關注的重大環(huán)境問題之一。由于其急性毒性強，世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中微囊藻毒素的標準僅為I μ g/L。因此，發(fā)展靈敏、快速、高效、實時的檢測方法對監(jiān)測環(huán)境中的微囊藻毒素具有重要意義。
[0003]傳統(tǒng)的微囊藻毒素檢測方法有儀器檢測法，生物法/生化法等，由于其固有的缺陷已難以應對目前的環(huán)境監(jiān)測需求。例如，高效液相色譜法耗時、費力、成本高；全細胞法靈敏度低、特異性差；酶聯(lián)免疫吸附測定雖然具有較高的靈敏度和選擇性，但操作過程復雜，體系對極端環(huán)境的適應性差，阻礙了該法的推廣使用。近年來，無機納米材料仿生酶，包括仿生過氧化酶、仿生氧化酶等，可在分子層面上模仿天然酶，不僅擁有接近或高于天然酶的催化性能，且相較于天然酶更穩(wěn)定，實用性更強，更加經濟易于生產，已被廣泛運用于傳感分析檢測中(Chemical Communications, 2011, 47 (23), 6695-6697 ；ACS ΝΑΝΟ, 2012，6(4)，3142-3151)。目前，人們也已利用仿生酶材料成功建立了一些針對藻毒素檢測的傳感平臺(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2013, 103, 38-44 ；Science, 2010, 330 (6001)，188-189)，但這些方法均基于仿生過氧化酶的催化性能，即必須在反應體系中加入一定量的H2O2，才能實現(xiàn)催化過程的順利進行。由于H2O2不僅易降解，在長期存儲過程中易失效，而且其強氧化性易造成生物底物組織結構破壞，影響了實驗效率與檢測結果。
[0004]納米二氧化鈰，基于Ce3+與Ce4+的相互轉化作用而具有仿生氧化酶的催化性質，從而可以快速催化氧化多種有機底物，而無需額外添加任何氧化劑。如今納米二氧化鈰仿生氧化酶材料由于其優(yōu)異的性質已被用于傳感分析中(AngewandteChemie-1nternationalEdition, 2009, 48(13), 2308-2312 ；Biosensors and Bioelectronics, 2014, 52, 397-402)。本發(fā)明將納米二氧化鈰仿生氧化酶材料應用于水中微囊藻毒素的檢測，建立一種微囊藻毒素的比色分析方法，解決了傳統(tǒng)方法繁瑣耗時、成本高、實用性差等缺點，應用前景非常廣泛。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測微囊藻毒素方法繁瑣耗時、前處理過程復雜、成本高、實用性差等不足，提供了一種簡便、快捷、經濟、實用的檢測水中微囊藻毒素的方法。
[0006]六水合硝酸鈰和聚丙烯酸在氨水存在條件下，經攪拌，一步合成聚丙烯酸包被的納米二氧化鈰(PNC)，其仿生氧化酶的催化性能可使底物中的顯色劑從常態(tài)氧化至氧化態(tài)，從而使體系吸光度值發(fā)生改變。PNC表面羧基經過活化，與微囊藻毒素抗體通過脫水縮合反應結合，形成抗體-納米二氧化鈰復合物。檢測時利用納濾膜分離去除游離的納米二氧化鈰后，與目標物分子，即微囊藻毒素發(fā)生抗原-抗體特異性結合，形成抗原-抗體-納米二氧化鈰復合物。再利用納濾膜過濾分離去除未進行特異性結合的游離的抗體-納米二氧化鈰復合物。過濾截留的抗原-抗體-納米二氧化鈰復合物的濃度與目標物微囊藻毒素的濃度正相關，在顯色劑存在條件下，復合物與顯色劑發(fā)生反應產生顏色變化，并且體系吸光度值在一定范圍內與微囊藻毒素的濃度正相關，從而為微囊藻毒素的定量分析提供依據(jù)。
[0007]本發(fā)明提供了一種基于PNC仿生氧化酶的微囊藻毒素的檢測方法，具體步驟如下:
[0008](I)向0.05?IOmM PNC中依次加入濃度為I?50mg/mL的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和濃度為I?50mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應5?90min，活化PNC表面原有的羧基官能團。
[0009](2)將步驟⑴獲得的表面羧基活化的PNC與濃度為I?100 μ g/L的微囊藻毒素抗體混合，10?50°C溫度下震蕩I?24h，然后靜置I?24h。利用截留分子量為30K納濾膜對溶液進行分離，去除游離的PNC。向去除游離PNC后的溶液中加入濃度不大于10 μ g/L的微囊藻毒素，30?50°C溫度條件下震蕩0.5?12h，用截留分子量為50K的納濾膜對產物進行分離，去除未進行特異性結合的游離抗體-PNC復合物。
[0010](3)向步驟⑵得到的產物中加入0.01?10mg/mL顯色劑，反應I?60min，加入
0.1?10.0M終止液終止反應。
[0011]所述的顯色劑包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2，2_聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)等。
[0012]所述的終止液為硫酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。
[0013]所述的微囊藻毒素抗體為微囊藻毒素單克隆抗體。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
[0015](I)檢測下限可達0.45 μ g/L,符合WHO規(guī)定的飲用水中微囊藻毒素的標準I μ g/L0
[0016](2)納米二氧化鈰仿生氧化酶的制備采用磁力攪拌一步合成，過程簡單、快捷。
[0017](3)相較于傳統(tǒng)天然酶檢測方法，成本低，穩(wěn)定性、實用性強。
[0018](4)相較于傳統(tǒng)仿生過氧化酶傳感檢測方法，體系無需H2O2,過程安全且對生物分子無影響，便于運輸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明所述的檢測微囊藻毒素的方法過程示意圖。
[0020]圖2是本發(fā)明的方法獲得的檢測微囊藻毒素的標準工作曲線。
[0021]圖中:藝表面包被聚丙烯酸的納米二氧化鈰(PNC)；[0022]
【權利要求】
1.一種基于PNC仿生氧化酶的微囊藻毒素的檢測方法，其特征在于如下步驟: (1)向0.05?IOmM PNC中依次加入濃度為I?50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和濃度為I?50mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應5?90min，活化PNC表面原有的羧基官能團； (2)將步驟(I)獲得的表面羧基活化的PNC與濃度為I?100μ g/L的微囊藻毒素抗體混合，10?50°C溫度下震蕩I?24h，然后靜置I?24h ;利用截留分子量為30K納濾膜對溶液進行分離，去除游離的PNC ；向去除游離PNC后的溶液中加入濃度不大于10 μ g/L的微囊藻毒素，30?50°C溫度條件下震蕩0.5?12h，再用截留分子量為50K的納濾膜對產物進行分離，去除未進行特異性結合的游離抗體-PNC復合物； (3)向步驟(2)得到的產物中加入0.01?10mg/mL顯色劑，反應I?60min后，加入0.1?10.0M終止液終止反應。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺或2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述的終止液為硫酸或十二烷基硫酸鈉。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述的微囊藻毒素抗體為微囊藻毒素單克隆抗體。
5.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的微囊藻毒素抗體為微囊藻毒素單克隆抗體。
【文檔編號】G01N33/577GK103983777SQ201410191509
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權日:2014年5月7日
【發(fā)明者】趙慧敏, 袁芳, 全燮, 陳碩 申請人:大連理工大學