一種定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種定量檢測(cè)肽段糖基化水平的新方法，具體包括凝集素液相懸浮芯片的制備、糖基化蛋白質(zhì)的酶解、糖基化肽段的檢測(cè)。該方法克服了高效液相色譜、質(zhì)譜等傳統(tǒng)的糖基化分析手段的技術(shù)路線復(fù)雜、耗時(shí)、耗力的弊端，可以快速、簡(jiǎn)便、高靈敏、高通量地檢測(cè)肽段的糖基化水平，使用的樣品量較少，有利于不同肽段樣品之間的糖基化差異比較，為疾病相關(guān)的生物樣本中的多肽糖基化分析提供有效手段，有利于探討內(nèi)源性肽段的不同糖基化狀態(tài)對(duì)疾病的預(yù)測(cè)價(jià)值。
【專利說明】一種定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及肽段糖基化水平的檢測(cè)方法，具體涉及一種新的定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法。本方法包括凝集素液相懸浮芯片的制備、糖蛋白的酶解、通過凝集素液相懸浮芯片對(duì)牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)酶解肽段進(jìn)行檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了蛋白質(zhì)糖基化是最常見、最重要的翻譯后修飾之一。研究顯示，糖鏈會(huì)影響糖蛋白的理化性質(zhì)，比如細(xì)胞的折疊、溶解性、聚集以及降解；蛋白質(zhì)的糖基化還在多種生物過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，包括受精過程、發(fā)育、激素識(shí)別以及細(xì)胞間的相互作用等。據(jù)報(bào)道，許多糖蛋白的糖基化變化為疾病的早期診斷以及預(yù)后評(píng)估提供了重要的信
肩、O
[0003]凝集素芯片技術(shù)是一種非常有吸引力的糖鏈結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，具有樣品處理簡(jiǎn)單、樣品用量少、高通量、高靈敏度，可以定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于糖基化蛋白質(zhì)的糖型分析中；有研究報(bào)道，液相凝集素芯片技術(shù)可進(jìn)一步提聞凝集素芯片技術(shù)的靈敏度和檢測(cè)通量。
[0004]肽組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性低分子量蛋白質(zhì)或多肽(low-molecularweightproteinorpolypeptides, LMWP)及其變化規(guī)律的科學(xué)。作為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要分支，多肽組學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)中做出了顯著的貢獻(xiàn)，如:確定甲狀腺癌的早期診斷肽分子標(biāo)志物；確定胰腺癌診斷分子一血小板因子-4 ;揭示糖尿病腎病的復(fù)雜分子機(jī)制等。由于糖基化修飾參與了分泌肽的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、通訊與應(yīng)答等重要的生物過程，因此，對(duì)肽段糖基化水平的研究將有助于揭示重要的生命活動(dòng)以及尋找潛在的疾病診斷標(biāo)志物。傳統(tǒng)的分析手段，如高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜，用于糖基化分析時(shí)，通常比較復(fù)雜、耗時(shí)、耗力；同時(shí)，由于糖基化修飾的肽段在生物樣本中表達(dá)量很低，阻礙了多肽/低分子量蛋白質(zhì)的糖基化修飾的研究。
[0005]本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種快速、高靈敏度、高通量的檢測(cè)肽段糖鏈結(jié)構(gòu)和糖基化水平的實(shí)用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法。本方法能快速、高靈敏、高通量的檢測(cè)糖基化肽段的糖鏈結(jié)構(gòu)，且可比較不同樣本中肽段的糖基化水平，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用不同于傳統(tǒng)的糖基化分析手段的復(fù)雜、耗時(shí)、耗力的技術(shù)路線，克服了高效液相色譜、質(zhì)譜等的弊端，通過如下的技術(shù)方案:制備凝集素液相懸浮芯片、酶解糖基化蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏、高通量糖基化肽段的檢測(cè)。
[0008]具體的，本發(fā)明的一種定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法，其特征在于，其包括步驟:[0009]I)凝集素與磁珠共價(jià)偶聯(lián)，制備凝集素液相懸浮芯片；
[0010]2)糖蛋白酶解；
[0011]本發(fā)明的實(shí)施例中以牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)為例，進(jìn)行糖蛋白的酶解；
[0012]3)用生物素標(biāo)記肽段；
[0013]本發(fā)明的實(shí)施例中，用生物素標(biāo)記牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)的IysC酶解肽段；
[0014]4)凝集素液相懸浮芯片與生物素標(biāo)記的肽段反應(yīng)。
[0015]本發(fā)明的實(shí)施例中，生物素標(biāo)記的牛去唾液酸胎球蛋白IysC酶解肽段與偶聯(lián)凝集素的磁珠反應(yīng)；
[0016]5)用Bio-Plex液相懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)凝集素芯片信號(hào)進(jìn)行采集，并且記錄熒光信號(hào)中位值(MFI)。
[0017]本發(fā)明步驟3)中，采用氨基反應(yīng)生物素標(biāo)記試劑盒對(duì)肽段進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0018]本發(fā)明步驟3)中，采用氨基反應(yīng)生物素標(biāo)記糖蛋白，于37°C反應(yīng)15分鐘；
[0019]本發(fā)明步驟3)中，生物素標(biāo)記結(jié)束后，不需要除去反應(yīng)液，可以直接繼續(xù)與凝集素液相懸浮芯片進(jìn)行反應(yīng)；
[0020]本發(fā)明采用凝集素液相懸浮芯片技術(shù)定量檢測(cè)糖基化肽段的糖基化水平，結(jié)果顯示，該方法可以快速、簡(jiǎn)便、高靈敏、高通量地定量檢測(cè)肽段的糖基化特征，使用的樣品量較少，有利于不同樣品之間的差異比較，本發(fā)明為高通量的肽段糖基化修飾差異譜分析提供新的技術(shù)平臺(tái)，有助于探討內(nèi)源性肽標(biāo)志物的不同糖基化狀態(tài)對(duì)疾病的預(yù)測(cè)價(jià)值。
[0021]本發(fā)明的定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法的優(yōu)點(diǎn)有:
[0022]1，該方法克服了高效液相色譜、質(zhì)譜等傳統(tǒng)的糖基化分析手段的技術(shù)路線復(fù)雜、耗時(shí)、耗力的弊端；
[0023]2、能快速、簡(jiǎn)便、高靈敏、高通量地檢測(cè)肽段的糖基化水平；
[0024]3、使用的樣品量較少；
[0025]4、有利于不同肽段樣品之間的糖基化差異比較；
[0026]5、為疾病相關(guān)的生物樣本中的多肽糖基化分析提供有效手段，有利于探討內(nèi)源性肽段的不同糖基化狀態(tài)對(duì)疾病的預(yù)測(cè)價(jià)值。
[0027]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本方法的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。
[0029]圖2為凝集素RCA120檢測(cè)牛去唾液酸化胎球蛋白糖基化肽段的最低檢測(cè)限。
[0030]圖3為凝集素RCA120檢測(cè)牛去唾液酸化胎球蛋白糖基化肽段的線性范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1采用下述步驟定量檢測(cè)肽段糖基化水平
[0032]I)凝集素與磁珠共價(jià)偶聯(lián)，制備凝集素液相懸浮芯片；[0033]用清洗緩沖液(偶聯(lián)試劑盒自帶)清洗磁珠后，加入活化緩沖液(偶聯(lián)試劑盒自帶)重懸磁珠，向磁珠內(nèi)加入50 μ g/μ LEDC和50 μ g/μ Lsulf0-NHS振蕩條件下避光室溫反應(yīng)20分鐘，用PBS清洗過量的EDC和sulfo-NHS，并重復(fù)清洗過程一次，最后，用PBS重懸活化的磁珠，用PBS配置的凝集素與活化后的磁珠4°C過夜反應(yīng)，離心去上清后，加入“StabilGuardChoice”無蛋白封閉溶液重懸，室溫孵育30分鐘，離心后，用貯存緩沖液(偶聯(lián)試劑盒自帶)重懸磁珠；
[0034]2)糖蛋白酶解，本實(shí)施例中，選用對(duì)牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)的酶解，
[0035]將牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)溶于H2O,使蛋白終濃度為I μ g/μ L，向蛋白溶液中，加入IM碳酸氫銨，使得蛋白溶液中碳酸氫銨的終濃度為50mM，以蛋白與蛋白酶(IysC)的質(zhì)量比為50:1，加入lysC，37°C過夜反應(yīng)；
[0036]3)用生物素標(biāo)記肽段，本實(shí)施例中，選用生物素標(biāo)記牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)的IysC酶解肽段，
[0037]將32 μ LDMSO加入到氨基-反應(yīng)生物素中(標(biāo)記試劑盒自帶)，吹打使其溶解。向IOug酶解肽段中加入26.8 μ L反應(yīng)溶液(標(biāo)記試劑盒自帶)及3.2 μ L氨基-反應(yīng)生物素溶液，混勻后，37°C反應(yīng)15分鐘；
[0038]4)凝集素液相懸浮芯片與生物素標(biāo)記的肽段反應(yīng)，本實(shí)施例中，對(duì)生物素標(biāo)記的牛去唾液酸胎球蛋白IysC酶解肽段與偶聯(lián)凝集素的磁珠反應(yīng)，
[0039]向孵育緩沖液(0.5 % Tween-20PBS)中加入生物素化的牛去唾液酸胎球蛋白IysC酶解肽段和磁珠，4°C下反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后，加入100 μ L清洗緩沖液(0.1 %Tween-20PBS)清洗磁珠，再加入50 μ L孵育緩沖液稀釋的I μ g/mL鏈霉素-藻紅蛋白室溫下振蕩反應(yīng)40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，重復(fù)清洗步驟，最后，用清洗緩沖液重懸磁珠。
[0040]5)用Bio-Plex液相懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)凝集素芯片信號(hào)進(jìn)行采集，每個(gè)孔檢測(cè)75個(gè)磁珠，并且記錄熒光信號(hào)中位值(MFI)。
[0041]實(shí)施例2凝集素液相懸浮芯片檢測(cè)肽段糖基化的最低檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)
[0042]用孵育緩沖液配置一系列濃度的牛去唾液酸胎球蛋白酶解肽段溶液，與1.5μ L磁珠4°C過夜孵育，清洗后與二抗反應(yīng)，之后用Bioplex懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行采集，本實(shí)施例中設(shè)不加入肽段的空白樣品做為陰性對(duì)照，凈信號(hào)為凝集素特異性識(shí)別的糖基化肽段產(chǎn)生的信號(hào)減去陰性對(duì)照信號(hào)的平均值，當(dāng)凈信號(hào)大于標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍，并且信號(hào)與噪音的比值大于1.5倍時(shí)的最小肽段濃度為檢測(cè)限；結(jié)果顯示(如圖2所示)，凝集素RCA120對(duì)牛去唾液酸胎球蛋白酶解肽段糖基化的檢測(cè)限為500pg/mL。
[0043]實(shí)施例3凝集素液相懸浮芯片檢測(cè)肽段糖基化的線性范圍實(shí)驗(yàn)
[0044]用孵育緩沖液配置一系列濃度的牛去唾液酸牛胎球蛋白酶解肽段溶液，與1.5 μ L磁珠4°C過夜孵育，清洗后與二抗反應(yīng)，之后用Bioplex懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行采集；結(jié)果顯示(如圖3所示)，凝集素RCA120檢測(cè)牛去唾液酸胎球蛋白酶解肽段糖基化的線性范圍為0.5?50ng/mL。
[0045]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法能克服高效液相色譜、質(zhì)譜等傳統(tǒng)的糖基化分析手段的技術(shù)路線復(fù)雜、耗時(shí)、耗力的缺陷；能快速、簡(jiǎn)便、高靈敏、高通量地定量檢測(cè)肽段的糖基化特征，使用的樣品量較少，有利于不同樣品之間的差異比較。
【權(quán)利要求】
1.一種定量檢測(cè)肽段糖基化水平的方法，其特征在于，其包括步驟: 1)凝集素與磁珠共價(jià)偶聯(lián)，制備凝集素液相懸浮芯片； 2)糖蛋白酶解； 3)用生物素標(biāo)記肽段； 4)凝集素液相懸浮芯片與生物素標(biāo)記的肽段反應(yīng)。 5)用Bio-Plex液相懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)凝集素芯片信號(hào)進(jìn)行采集，并且記錄熒光信號(hào)中位值(MFI)。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中步驟2)中糖蛋白選自牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中用生物素標(biāo)記牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)的IysC酶解肽段。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中生物素標(biāo)記的牛去唾液酸胎球蛋白IysC酶解肽段與偶聯(lián)凝集素的磁珠反應(yīng)。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中采用氨基反應(yīng)生物素標(biāo)記試劑盒對(duì)肽段進(jìn)行生物素標(biāo)記。
6.按權(quán)利要求1所 述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中采用氨基反應(yīng)生物素標(biāo)記糖蛋白，于37°C反應(yīng)15分鐘。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中生物素標(biāo)記結(jié)束后，不需要除去反應(yīng)液，直接繼續(xù)與凝集素液相懸浮芯片進(jìn)行反應(yīng)。
8.按權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述方法的步驟中: 1)用清洗緩沖液清洗磁珠后，加入活化緩沖液重懸磁珠，向磁珠內(nèi)加入50μ g/μ LEDC和50μ8/μ LsulfO-NHS振蕩條件下避光室溫反應(yīng)20分鐘，用PBS清洗過量的EDC和sulfo-NHS，并重復(fù)清洗過程，最后，用PBS重懸活化的磁珠，用PBS配置的凝集素與活化后的磁珠4°C過夜反應(yīng),離心去上清后,加入“StabiIGuardChoice”無蛋白封閉溶液重懸,室溫孵育30分鐘，離心后，用貯存緩沖液重懸磁珠； 2)將糖蛋白溶于H20，使蛋白終濃度為1μg/μL，向蛋白溶液中，加入IM碳酸氫銨，使得蛋白溶液中碳酸氫銨的終濃度為50mM，以蛋白與蛋白酶(IysC)的質(zhì)量比為50:1，加入lysC，37°C過夜反應(yīng)； 3)將32μ LDMSO加入到氨基-反應(yīng)生物素中，吹打使其溶解，向IOy g酶解肽段中加入.26.8 μ L反應(yīng)溶液及3.2 μ L氨基-反應(yīng)生物素溶液混勻后,37°C反應(yīng)15分鐘； 4)向孵育緩沖液(0.5% Tween-20PBS)中加入生物素化的肽段和磁珠，4°C反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后，加入100 μ L清洗緩沖液(0.l%Tween-20PBS)清洗磁珠，再加入50 μ L孵育緩沖液稀釋的I μ g/mL鏈霉素-藻紅蛋白室溫下振蕩反應(yīng)40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，重復(fù)清洗步驟，最后，用清洗緩沖液重懸磁珠； 5)利用Bio-Plex液相懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行采集，每個(gè)孔檢測(cè)75個(gè)磁珠，并且記錄熒光信號(hào)中位值(MFI)。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104020299SQ201410280757
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】李宏, 魏黎明, 楊芃原, 方盼 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)