質(zhì)控標(biāo)志物及其在中草藥鑒定中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及質(zhì)控標(biāo)志物，以及這種標(biāo)志物在定性和定量鑒定蘭科石斛屬鐵皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo (即廣為人知的名為鐵皮石斛的名貴中藥)的使用方法。
【專利說(shuō)明】質(zhì)控標(biāo)志物及其在中草藥鑒定中的應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)要求2013年7月12日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3/940944的優(yōu)先權(quán)益，其 內(nèi)容通過(guò)引用合并進(jìn)入本申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及質(zhì)控標(biāo)志物，以及應(yīng)用這類標(biāo)志物定性和定量鑒定中草藥材(特別適 用，但不限于石斛物種的方法。更具體地，本發(fā)明涉及化學(xué)標(biāo)志物，以及其在快速、高效、低 成本鑒定鐵皮石斛ei 即廣為人知的名貴中藥鐵皮 石斛中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0003] 由于中草藥材中包含的碳水化合物(特別是多糖和寡糖）結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大，因 此對(duì)于這些碳水化合物的質(zhì)控依舊充滿了挑戰(zhàn)。通常而言，將中草藥中多糖和寡糖進(jìn)行分 離和純化后進(jìn)行完整的結(jié)構(gòu)表征是這兩種糖的質(zhì)量評(píng)價(jià)最可靠的方法。上述表征包括物 質(zhì)均一性和分子量的測(cè)定、組成單糖的分析、葡萄糖苷鍵類型的確認(rèn)、重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的推斷 等。然而，這些方法極其繁瑣、復(fù)雜和耗時(shí)，因此它們不適合發(fā)展為常規(guī)的質(zhì)控方法。此外， 糖含量測(cè)定和糖組成分析這兩種分析方法也被廣泛應(yīng)用于中草藥材中碳水化合物的質(zhì)控。 然而這兩種方法依然存在缺陷。比色法測(cè)定全糖含量的特異性非常差，因而無(wú)法運(yùn)用于以 定性為目的的分析。糖組成成分分析需要復(fù)雜的操作，例如酸解、衍生化、后續(xù)的利用HPLC (高效液相色譜）或GC (氣相色譜）對(duì)糖的衍生物進(jìn)行定性和定量測(cè)定（圖1A)。因此，其試 驗(yàn)結(jié)果往往會(huì)受到冗長(zhǎng)的操作步驟中諸多因素的影響，例如，溫度、反應(yīng)時(shí)間、酸解中酸的 濃度；因此結(jié)果重復(fù)性差。此外，該方法還具有片面性，無(wú)法顯示水解前多糖和寡糖的原始 存在。因此，發(fā)展更加簡(jiǎn)便、合理的中草藥材中碳水化合物的質(zhì)控方法是很有必要的。
[0004] 石斛屬是蘭科植物中最大的屬之一。已有1100多種石斛屬的植物被確認(rèn)，廣泛分 布于亞洲、歐洲和澳洲。其中大約30種石斛屬植物新鮮或曬干的莖被公認(rèn)為是一種名貴的 滋補(bǔ)中藥，中文名為石斛。在中國(guó)中藥材古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中，石斛被記載為一種上品中藥 材，因其具有傳統(tǒng)的滋補(bǔ)功效，例如健胃、活血、增強(qiáng)免疫力，現(xiàn)已被使用數(shù)千年之久。其中， 取自石斛屬鐵皮石斛ei 的干莖，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是石 斛中的極品，以鐵皮石斛（Dendrobii Officinalis Caulis)著名，具有例如養(yǎng)胃、護(hù)喉和明 目的功效。在道教經(jīng)籍《道藏》中，鐵皮石斛名列中國(guó)九大名藥之首。如今，由于其野生來(lái)源 的極端稀缺和其突出的滋補(bǔ)效果，鐵皮石斛已成為最出名、最稀缺的石斛中藥材，同時(shí)也是 世界中藥市場(chǎng)上，尤其是東南亞市場(chǎng)上，最名貴的中藥之一。鐵皮石斛議的 莖通在加熱后被折疊成螺旋狀或彈簧狀，并在干燥后在中藥市場(chǎng)上出售，名為鐵皮楓斗（圖 2)。和其他石斛加工品相比，鐵皮楓斗不具備特征性的形貌，且價(jià)格高昂，導(dǎo)致?lián)郊?、種類混 淆、仿冒品的發(fā)生。因此，鐵皮楓斗的鑒定和質(zhì)量評(píng)估以確保藥材的安全和功效就顯得至關(guān) 重要。
[0005] 已有的方法不能有效地對(duì)鐵皮石斛的質(zhì)量進(jìn)行定性和/或定量的分析，因?yàn)檫@種 中草藥具有獨(dú)特的化學(xué)特點(diǎn)。除一些小分子(諸如聯(lián)芐、菲等)外，其包含的碳水化合物含量 可達(dá)70%。針對(duì)小分子的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法無(wú)法將鐵皮石斛和其它石斛屬物種有效區(qū)分開，而 且被檢測(cè)的成分往往只占到整個(gè)中草藥材總成分的〇. 21%。換句話說(shuō)，這些樣品中多于99% 的成分無(wú)法被這些方法檢測(cè)。另一方面，碳水化合物含量最高并已被證明具有較好的生物 活性，自然應(yīng)該是鐵皮石斛質(zhì)控的主要目標(biāo)。但是，如上所述，和其它以糖類為主的中藥材 一樣，對(duì)鐵皮石斛中碳水化合物的質(zhì)控面臨著方法瓶頸。
[0006] 中國(guó)專利CN102370891A公開了一種針對(duì)小分子和使用GPC柱和UV檢測(cè)器的方 法。然而此方法復(fù)雜且繁瑣，并不適于快速、高效、低成本的應(yīng)用。因此，上述公開的發(fā)明很 難推廣至商業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。在另外一篇中國(guó)專利CN101716283A和一篇由Xu J等所著刊 登于期干丨J Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 上題為 Comparison of polysaccharides from different Dendrobium using saccharide mapping 的文章中，都 將目標(biāo)指向了大分子多糖，與本發(fā)明中的目標(biāo)分子一致。但是，他們所使用的化學(xué)標(biāo)志物并 非原始的石斛多糖，而是其酶解得到的產(chǎn)物。兩片文獻(xiàn)中公布了由石斛多糖酶解所產(chǎn)生的 寡糖的指紋圖譜。此過(guò)程須經(jīng)復(fù)雜且耗時(shí)的流程，包括水提取、乙醇沉淀、去蛋白質(zhì)、酶解、 電泳或HPLC分析。
[0007] 因此，發(fā)展可對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行質(zhì)控和鑒定且具有以下特點(diǎn)的方法依然存在需 求：1)快速、低成本；2)原理易懂；3)簡(jiǎn)單；4)具有滿意的可重復(fù)性和再現(xiàn)性；5)同時(shí)適 用于定性分析和定量分析；6)對(duì)于大批量樣品具有可靠性；7)適用于商業(yè)應(yīng)用。
[0008] 本章節(jié)或本申請(qǐng)的其它章節(jié)對(duì)于任何文獻(xiàn)的引用和鑒別，不應(yīng)被理解為承認(rèn)該文 獻(xiàn)可作為本申請(qǐng)的現(xiàn)有技術(shù)。
[0009] 發(fā)明概述 本發(fā)明第一方面提供了鑒定含有碳水化合物的中草藥材樣品的方法，包括：基于分子 量分布，提供樣品中碳水化合物化學(xué)指紋圖譜；鑒定樣品中碳水化合物一種或多種主要多 糖成分；分離該一種或多種主要的多糖成分；和發(fā)展化學(xué)標(biāo)志物以鑒定中草藥材。
[0010] 在第一方面的實(shí)施方案中，提供化學(xué)指紋圖譜的步驟通過(guò)包括尺寸排阻色譜進(jìn) 行。
[0011] 在第一方面的實(shí)施方案中，尺寸排阻色譜為高效凝膠滲透色譜。
[0012] 在第一方面的實(shí)施方案中，在提供化學(xué)指紋圖譜的步驟前樣品被溶劑提取。
[0013] 在第一方面的實(shí)施方案中，分離步驟通過(guò)包括過(guò)濾和沉淀的方法進(jìn)行。
[0014] 在第一方面的實(shí)施方案中，過(guò)濾為離心超濾。
[0015] 在第一方面的實(shí)施方案中，沉淀通過(guò)使用10-90% v/v的乙醇進(jìn)行。
[0016] 在第一方面的實(shí)施方案中，發(fā)展化學(xué)標(biāo)志物的步驟是高效凝膠滲透色譜分離步驟 后，通過(guò)分析一種或多種主要多糖成分進(jìn)行。
[0017] 在第一方面的實(shí)施方案中，所述中草藥材包含石斛屬物種。
[0018] 在第一方面的實(shí)施方案中，所述石斛屬物種包含鐵皮石斛。
[0019] 本發(fā)明第二方面提供了用以定性或定量鑒定含碳水化合物的中草藥材樣品的化 學(xué)標(biāo)志物的制備方法，包括基于分子量分布，提供樣品中碳水化合物的化學(xué)指紋圖譜；鑒定 樣品中碳水化合物的一種或多種主要多糖成分；分離該一種或多種主要多糖成分以形成一 種或多種已分離的主要多糖成分；和分析已分離的主要多糖成分。
[0020] 在第二方面的實(shí)施方案中，提供化學(xué)指紋圖譜的步驟包括使用尺寸排阻色譜。
[0021] 在第二方面的實(shí)施方案中，尺寸排阻色譜為高效凝膠滲透色譜。
[0022] 在第二方面的實(shí)施方案中，在提供化學(xué)指紋圖譜的步驟前樣品被溶劑提取。
[0023] 在第二方面的實(shí)施方案中，分離步驟通過(guò)包括過(guò)濾和沉淀的方法進(jìn)行。
[0024] 在第二方面的實(shí)施方案中，過(guò)濾為離心超濾。
[0025] 在第二方面的實(shí)施方案中，沉淀通過(guò)使用10-90% v/v的乙醇進(jìn)行。
[0026] 在第二方面的實(shí)施方案中，所述中草藥材包含石斛屬物種。
[0027] 在第二方面的實(shí)施方案中，所述石斛屬物種包含鐵皮石斛。
[0028] 附圖簡(jiǎn)述 本發(fā)明的上述及其它目標(biāo)和特征，將通過(guò)結(jié)合以下對(duì)本發(fā)明的描述與所配附圖而顯而 易見： 圖1為流程圖，顯示傳統(tǒng)的糖組成分析方法(A);根據(jù)本發(fā)明的高效凝膠滲透色譜 (HPGPC )的方法（B )，用于中草藥材中碳水化合物的質(zhì)控。
[0029] 圖2為下列原始植物的圖片鐵皮石斛(A)，流蘇石斛 Dendrobium fimbriatum 〇，金Dendrobium nobile (功，歲m% Dendrobium 球花石斛iAjrsi/yortt? (F)和鐵皮楓斗（B)，其是鐵皮石 斛的商用產(chǎn)物。
[0030] 圖3顯示來(lái)自鐵皮楓斗真品（A);其它石斛屬物種（B);和商品鐵皮楓斗樣品（C) 的水提取提物的HPGPC色譜圖。
[0031] 圖4顯示多糖標(biāo)志物的制備(峰I)。
[0032] 圖5顯示下列樣品的組成單糖分析的HPLC色譜圖：混合的單糖標(biāo)品（A)、鐵皮楓 斗真品和商品樣品，以及其它石斛屬物種樣品（B)。
[0033] 圖6顯示鐵皮楓斗真品和商品樣品，以及其它石斛屬物種樣品基于指紋譜圖分析 的鑒定結(jié)果。
[0034] 圖7顯示通過(guò)HPGPC定量分析得到被測(cè)石斛屬物種樣品中多糖標(biāo)志物的含量。
[0035] 優(yōu)選實(shí)施方案詳述 高效凝膠滲透色譜法（HPGPC)是一種基于分子大小分離分析物的尺寸排阻色譜法。此 方法被設(shè)計(jì)用來(lái)分析和制備性分離水溶性聚合物、寡聚物和生物物質(zhì)，諸如多糖、核酸、蛋 白質(zhì)、肽等。該方法通過(guò)應(yīng)用HPGPC對(duì)色譜峰的定性鑒定和借助已建立的保留時(shí)間-分子 量關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得結(jié)果，測(cè)定經(jīng)純化的多糖和寡糖的物質(zhì)均一性和分子量。但據(jù)我 們所知，此方法從未被應(yīng)用于中草藥材中碳水化合物的質(zhì)控和定量測(cè)定。
[0036] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以鐵皮石斛為例，發(fā)展了一種新穎快速的基于HPGPC 的方法，用于中草藥材中碳水化合物的質(zhì)控。首先，確立了基于碳水化合物成分的分子量分 布的HPGPC指紋圖譜，以對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行定性鑒定。其次，HPGPC譜圖中主要多糖的峰被分 離，其被視為獨(dú)特的化學(xué)標(biāo)志物，通過(guò)對(duì)其定量測(cè)定進(jìn)行鐵皮石斛的碳水化合物質(zhì)量評(píng)價(jià)。 (參見圖1中路線B)。除此之外，也實(shí)施和比較了傳統(tǒng)的糖組成分析方法(示于圖1路線 A)，結(jié)果不于表1。 實(shí)施例
[0037] 材料和化學(xué)藥品：鐵皮楓斗商品樣品購(gòu)自中國(guó)不同地方。鐵皮楓斗真品樣品和 其它石斛屬物種樣品，包括流蘇石斛ft 金釵石斛β /?〇心7^鼓槌石斛β 和球花石斛D. ?及7_Γ5·Υ/7ο_/--(示于圖2)，產(chǎn)自中國(guó)大陸數(shù)個(gè)經(jīng)過(guò)認(rèn)證的產(chǎn) 地，并且通過(guò)傳統(tǒng)的糖組成分析和HPGPC定量分析的鑒定，其結(jié)果示于表1。憑證標(biāo)本儲(chǔ)存 于香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院。
[0038] HPGPC定量分析 用于高效液相色譜（HPLC)分析的乙腈和醋酸氨購(gòu)買自Merck (Darmstadt,Germany)。 去離子水通過(guò) Millipore Milli Q-Plus 系統(tǒng)（Millipore, Bedford, MA, USA)制備得到。 用于酸解碳水化合物的三氟醋酸（TFA)得自Riedel-de HaSn (Honeywell International Inc.，Germany)。用于單糖衍生化的1_苯基-3-甲基-5-批唑酮（PMP)購(gòu)自Sigma (St. Louis，M0，USA)。參比物D -半乳糖醛酸一水合物（GalA)、D-葡萄糖醛酸（GlcA)、L -阿 拉伯糖（Ara)、D-甘露糖（Man)、D -半乳糖（Gal)、D -葡萄糖（Glc)、L-鼠李糖一水合 物（Rha)、D-巖藻糖（Fuc)、D-核糖（Rib)和一系列具有不同分子量的葡聚糖（lkDa、5kDa、 12kDa、25kDa、501^^、801^^、1501^^、2701^^、4101^^和 6701^^)購(gòu)自5丨811^^1^1118， MO, USA) 〇
[0039] 水提?。涸?00 °C下，將干燥的樣品粉末（0 . 10 g)用水提?。?mLXlhX2次)。 將提取液在3500 rpm下離心10分鐘，合并上清液做進(jìn)一步分析。
[0040] HPGPC條件：制備得到的石斛樣品水提物可直接在連接著蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (ELSD)的 Agilent 1100 series HPLC-DAD 系統(tǒng)上（Agilent Technologies, Palo Alto, CA)通過(guò)HPGPC分析法分析。該分離在4 0 °C下，通過(guò)兩個(gè)串聯(lián)的TSK GMPWXL柱（300 mmX7.8 mm，內(nèi)徑10 μπι)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。以醋酸氨水溶液（20 mM)為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/ min。通過(guò)Agilent 35900E界面，ELSD產(chǎn)生的信號(hào)傳輸至Agilent Chemstation進(jìn)行處 理。ELSD的參數(shù)設(shè)置如下：漂移管的溫度為1 2 0 °C，噴霧器氮?dú)饬魉贋?. 2L/min，不分流 模式。注入20 μ L溶液進(jìn)行分析。UV檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為260 nm和280 nm。
[0041] 使用相同條件，將配制好的含有不同分子量的葡聚糖（2 mg/mL) (lkDa、5kDa、 12kDa、25kDa、50kDa、80kDa、150kDa、270kDa、410kDa 和 670kDa)和葡萄糖的水溶液分別注 入HPGPC，通過(guò)各分析物的峰面積對(duì)數(shù)值相對(duì)保留時(shí)間作圖，以建立分子量-保留時(shí)間校正 曲線。
[0042] 化學(xué)標(biāo)志物分離：鐵皮楓斗HPGPC指紋圖譜中的主峰為鐵皮楓斗中含量最多的多 糖，可通過(guò)離心超濾或通過(guò)乙醇（10-90% v/v)沉淀分離得到(截留分子量（MWC0)為10 kDa, 其中分子量在至少10kDa和10kDa以上的被分離和收集）[Millipore，Billerica, ΜΑ]。 具體細(xì)節(jié)如下：將鐵皮石斛的水提取液（15 mL)轉(zhuǎn)移至離心超濾管中，然后在4000 Xg下離 心8次(每次1 5分鐘)。最后，將所得物重新溶解于15 mL水中，經(jīng)冷凍干燥后，做進(jìn)一步 分析。沉淀步驟操作如下：首先將乙醇（>90% v/v)加入水提物中，充分混合至乙醇濃度達(dá) 到10-90% v/v。放置過(guò)夜，合并沉淀，經(jīng)最后冷凍干燥后做進(jìn)一步分析。
[0043] HPGPC定量分析方法驗(yàn)證：HPGPC法定量分析多糖標(biāo)志物（HPGPC譜圖中的主峰)從 線性關(guān)系、靈敏度、精確度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性這幾方面進(jìn)行驗(yàn)證。
[0044] 化學(xué)標(biāo)志物的水溶液被稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛扔靡岳L制校正曲線。6種濃度的溶液被 分三等分被測(cè)試。校準(zhǔn)曲線通過(guò)峰面積的對(duì)數(shù)和標(biāo)志物濃度的對(duì)數(shù)作圖獲得。
[0045] 存儲(chǔ)溶液用水溶液稀釋至一系列合適濃度，吸取稀釋液注入HPLC進(jìn)行分析。在本 實(shí)驗(yàn)條件下的檢測(cè)限（LODs)和定量限（LOQs)分別以大約3和10的S/N (信噪比）確定。
[0046] 選擇日內(nèi)和日間變化以確定本檢測(cè)方法的精確度。在日內(nèi)變化測(cè)試中，鐵皮楓斗 樣品ATF-03 (不于表1中）在一日內(nèi)被提取并分析了 6次。在日間變化測(cè)試中，同一樣品 在連續(xù)的三天內(nèi)分為兩等分被測(cè)試。峰面積對(duì)數(shù)的變化以數(shù)據(jù)的RSDs形式表現(xiàn)。
[0047] 加樣回收試驗(yàn)被用以評(píng)價(jià)此方法的準(zhǔn)確度。稱取大約0. 05g具有已知目標(biāo)化學(xué)標(biāo) 志物含量的石斛樣品（ATF-03)。向樣品加入不同量的標(biāo)志物（高、中、低三個(gè)水平)，分三等 分提取后分析。加樣回收率按照下述公式計(jì)算： 加樣回收率（％)=(檢出總量一原始量）/加標(biāo)量X100% 穩(wěn)定性測(cè)試通過(guò)在2h、4h、6h、8h、12h、24h時(shí)分析樣品ATF-03的提取物，取標(biāo)志物峰面 積對(duì)數(shù)的RSD值用以檢測(cè)穩(wěn)定性。
[0048] 糖組成分析 酸解水提物：將制備好的水提物溶液（〇. 50 mL)與2. 50 mL三氟醋酸（TFA)(終濃度 2 M)溶液在螺口小瓶中混合，并在120 °C下水解2h。冷卻后，水解物在55 °C下用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀蒸干。加入1 mL水溶液溶解水解物，離心（15700Xg，5min)后去除沉淀，取上清進(jìn)行 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP)衍生化。
[0049] 單糖的PMP衍生化：糖衍生化的方法通過(guò)由J. Xu等所著刊登于期刊Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 上名為 Comparison of polysaccharides from different Dendrobium using saccharide mapping 中的方法經(jīng)修 改得來(lái)。簡(jiǎn)言之，將酸解物（100 μ L)與同體積的氨水，及200 μ L 0.5 M的PMP甲醇溶液 混合。此混合物在70 °C下反應(yīng)30 min，然后冷卻到室溫。隨后，相繼加入100 μ L冰醋酸 和500 μ L氯仿，以分別中和反應(yīng)液，并除去過(guò)量ΡΜΡ反應(yīng)試劑。劇烈搖動(dòng)后在15700 X g下 離心5分鐘，丟棄有機(jī)相。重復(fù)上述操作5次，將最終的水相稀釋10倍，并通過(guò)0. 22 μ m 的注射式過(guò)濾器（Agilent Technologies, USA)過(guò)濾后可進(jìn)行液相色譜-二極管陣列檢測(cè) 器（LC-DAD)分析。含有7種單糖（Rha, Ara, Fuc, Man, Glu, Gal和Rib)和2種糖醛酸 (GlcA and GalA)的標(biāo)準(zhǔn)溶液也通過(guò)上述操作處理。
[0050] HPLC分析：對(duì)石斛水提物經(jīng)酸解后生成的單糖的PMP衍生物的分析在配備真 空除氣器、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和二極管陣列檢測(cè)器的Agilent 1100 series HPLC-DAD (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)系統(tǒng)上進(jìn)行。5 μ? 樣品被注入在 30 ° C 下運(yùn) 行的Grace AlltimaTM C18 column-W (250 mm X 4· 6 m，內(nèi)徑 5 μ m)。通過(guò) 100 mM 醋酸 銨水溶液（Α) (ρΗ=5·58)和乙腈⑶在1.0 mL/min的流速下：0?5 min, 17?20 % B; 5?30 min，20?28 % B; 30-35 min，28% B的梯度洗脫實(shí)現(xiàn)分離。UV檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)置在 245nm〇
[0051] HPLC法定量分析組成單糖也將從其線性關(guān)系、靈敏度、精確度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性這 幾方面進(jìn)行校驗(yàn)。
[0052] 數(shù)據(jù)分析：使用 Simca_P+ 9 (Umetrics, AN MKS company, Sweden)進(jìn)行三維圖 形主成分分析（3D-PCA)，以評(píng)價(jià)被測(cè)的石斛樣品質(zhì)量的一致性，其包含了一系列"步驟"，諸 如畫圖、統(tǒng)計(jì)、報(bào)告、處理、制表，這些步驟保證了簡(jiǎn)單、迅速的數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)。
[0053] 結(jié)果及討論 糖組成分析：被測(cè)石斛樣品水提物中的組成單糖通過(guò)已建立的HPLC法測(cè)定。所有石 斛樣品水提物經(jīng)酸解后釋放出的單糖的典型色譜圖和計(jì)算出的含量分別總結(jié)于圖5和表1 中。分析表明所有石斛樣品中糖的組成從定性上看顯示出了高度的一致性。在石斛樣品水 提物中主要有兩種組成單糖Man和Glc。此外，某些樣品中這兩種組成單糖的定量結(jié)果也十 分相似。這很清楚地證明糖組成分析法的選擇性較差，因此可能妨礙了其對(duì)鐵皮石斛的鑒 定和質(zhì)量評(píng)價(jià)。除此之外，試驗(yàn)步驟也過(guò)于繁瑣，以致定量結(jié)果會(huì)受到諸多因素的影響。 [0054] 表1被測(cè)鐵皮楓斗樣品和石斛物種樣品基于糖組成分析和HPGPC分析所得的碳 水化合物成分定量結(jié)果（mg/g)
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定含碳水化合物中草藥材樣品的方法，包括： a. 基于分子量分布，提供樣品中碳水化合物的化學(xué)指紋圖譜； b. 鑒定樣品中碳水化合物的一種或多種主要的多糖成分； c. 分離該一種或多種主要的多糖成分；和 d. 發(fā)展化學(xué)標(biāo)志物以鑒定中草藥材。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中提供化學(xué)指紋圖譜的步驟通過(guò)包含尺寸排阻色譜的方法進(jìn) 行。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中尺寸排阻色譜是高效凝膠滲透色譜。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中在提供化學(xué)指紋譜圖步驟之前樣品用溶劑提取。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中分離步驟通過(guò)包含過(guò)濾或沉淀的方法進(jìn)行。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中過(guò)濾為離心超濾。
7. 權(quán)利要求5的方法，其中沉淀通過(guò)采用10-90% v/v的乙醇進(jìn)行。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)展化學(xué)標(biāo)志物的步驟在高效凝膠滲透色譜之后，通過(guò)分 析一種或多種主要多糖成分進(jìn)行。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中所述中草藥材包含石斛物種。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述石斛物種包括鐵皮石斛。
11. 一種制備化學(xué)標(biāo)志物用于定性和定量鑒定含碳水化合物中草藥材樣品的方法，包 括： a. 基于分子量分布，提供樣品中碳水化合物的化學(xué)指紋圖譜； b. 鑒定樣品中碳水化合物的一種或多種主要的多糖成分； c. 分離該一種或多種主要的多糖成分以形成一種或多種分離的主要多糖成分；和 d. 分析分離的主要多糖成分。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中提供化學(xué)指紋圖譜的步驟通過(guò)包含尺寸排阻色譜的方 法進(jìn)行。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中尺寸排阻色譜是高效凝膠滲透色譜。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中在提供化學(xué)指紋譜圖步驟之前樣品用溶劑提取。
15. 權(quán)利要求11的方法，其中分離步驟通過(guò)包含過(guò)濾或沉淀的方法進(jìn)行。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中過(guò)濾為離心超濾。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中沉淀通過(guò)采用10-90% v/v的乙醇進(jìn)行。
18. 權(quán)利要求11的方法，其中所述中草藥材包含石斛物種。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述石斛物種包括鐵皮石斛。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104280469SQ201410330544
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】韓全斌, 陳虎彪, 許軍 申請(qǐng)人:香港浸會(huì)大學(xué)