一種環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法及在環(huán)境雌激素的檢測(cè)中的應(yīng)用，屬于新型納米功能材料和環(huán)境檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用兩種新型納米功能材料修飾工作電極，利用二者的協(xié)同催化作用以及對(duì)抗體的吸附作用，從而制備了一種靈敏度高、特異性好、檢測(cè)快速、制備簡(jiǎn)單的檢測(cè)環(huán)境雌激素的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器。
【專利說(shuō)明】一種環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用具有協(xié)同催化作用的新型納米復(fù)合材料構(gòu)建的檢測(cè)環(huán)境雌激素的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型納米功能材料與環(huán)境檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境雌激素是一類存在于環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，具有類似生物體內(nèi)雌激素的活性，進(jìn)入人體后具有模擬雌激素的作用，通過(guò)擾亂人體內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)的正常功能而產(chǎn)生如致癌、損害生殖發(fā)育系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病，是一類嚴(yán)重危害人類健康的環(huán)境毒素。常見(jiàn)的環(huán)境雌激素來(lái)源包括如農(nóng)藥(如有機(jī)氯農(nóng)藥)、二手煙、廢氣(如燃燒塑料垃圾產(chǎn)生的有毒氣體)、食品添加劑等。
[0003]用于環(huán)境雌激素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法、放射免疫法等。但大多數(shù)檢測(cè)方法儀器貴重、操作復(fù)雜，檢驗(yàn)人員必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格訓(xùn)練后，方可進(jìn)行檢測(cè)。一些簡(jiǎn)便的方法如電化學(xué)分析法，雖操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏、快速，但特異性差。因此，可快速、靈敏、高特異性檢測(cè)環(huán)境中的環(huán)境雌激素的電化學(xué)免疫傳感器顯得尤為突出。
[0004]電化學(xué)免疫傳感器由于其靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床分析和環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域，一般可分為有標(biāo)記和無(wú)標(biāo)記兩種，由于標(biāo)記物的特性，前者比后者對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求更嚴(yán)格，操作也相對(duì)繁瑣，因此其中在檢測(cè)環(huán)境雌激素方面，無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器更有應(yīng)用前景。構(gòu)建環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器，關(guān)鍵的技術(shù)是提高修飾電極對(duì)抗體的固定量和對(duì)測(cè)試底液的信號(hào)響應(yīng)速度和大小。核殼結(jié)構(gòu)的AuOPd納米棒復(fù)合材料是一種新型貴金屬納米復(fù)合材料，由于其生物相容性好以及納米級(jí)尺寸，增加了抗體的吸附量；并且核殼結(jié)構(gòu)中Au為核Pd為殼層，減少了 Pd的使用量，降低了成本；同時(shí)其特殊的棒狀形貌賦予Pd暴露出更多的催化晶面，可以更好的提高對(duì)作為測(cè)試底液的雙氧水的催化響應(yīng)速度和電流響應(yīng)信號(hào)大小。另外，CoFe204/rGo—方面增加了電極比表面積,增強(qiáng)電極導(dǎo)電能力，另一方面可以與AuOPd產(chǎn)生協(xié)同催化作用，更大的增強(qiáng)對(duì)雙氧水的催化響應(yīng)速度和電流響應(yīng)信號(hào)大小。因此，將二者聯(lián)合使用，可成功用于無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建。
[0005]本發(fā)明先后使用C0Fe2CVrG0和AuOPd-Ab對(duì)電極進(jìn)行修飾，然后利用環(huán)境雌激素抗原的加入，使得電極對(duì)雙氧水的電流響應(yīng)信號(hào)降低，從而實(shí)現(xiàn)了無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建，并應(yīng)用于簡(jiǎn)單、快速、特異性好和靈敏度高的檢測(cè)環(huán)境雌激素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一在于避免現(xiàn)有檢測(cè)方法中存在的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過(guò)程繁瑣及特異性差等不足，提供一種環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，所制備的傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，且制備簡(jiǎn)單、操作方便，可用于環(huán)境雌激素的快速、靈敏檢測(cè)；
本發(fā)明的目的之二在于將所制備的無(wú)標(biāo)記免疫傳感器應(yīng)用到環(huán)境雌激素的檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種環(huán)境雌激素的快速、靈敏檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
1.一種環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，所述環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器包括:工作電極、參比電極和對(duì)電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾CoFe204/rGo、戊二醛、Au@PdNRs_Ab、牛血清蛋白(BSA)，所述參比電極為飽和甘汞電極，所述對(duì)電極為鉬絲電極，所述C0Fe2CVrG0為鐵酸鈷/還原石墨烯復(fù)合材料，所述AuOPtNRs-Ab為金@鈀核殼納米棒復(fù)合材料孵化的環(huán)境雌激素抗體；
其特征在于，所述制備方法包括以下步驟:
a、制備CoFe204/rGo ；
b、制備AuOPdNRs-Ab ；
C、制備環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器工作電極；
其中，步驟a制備CoFe204/rGo的具體步驟如下:
將8?12 mg氧化石墨烯超聲分散到25?35 ml無(wú)水乙醇中，依次加入0.5?1.5 ml 0.2mol/mL 的 Fe (NO3) 3水溶液、0.25?0.75 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 2.0?3.0 ml 氨水，80°C下攪拌l(Tl4h，然后轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，180°C下反應(yīng)4?6h ;冷卻至室溫后，離心分離，于50°C真空干燥箱中烘干，即得C0Fe2CVrG0 ；
步驟b制備AuOPdNRs-Ab的具體步驟如下:
將20mL金納米棒溶液和20mL 0.05、.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液混合，在3(T45°C下攪拌，并順序加入3飛mL 0.1 mol/L的L-抗壞血酸(AA)溶液、0.5?ImL 0.03 mol/L的氯化鈀(PdCl2)溶液和3?6 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉(NaOH)溶液，停止攪拌，靜置f 3h，離心分離，加入20mL pH7.4的PBS緩沖溶液，然后再加入環(huán)境雌激素抗體(Ab)，在 4°C下震蕩 24h，得到 AuOPdNRs-Ab ；
步驟c制備環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器工作電極的具體步驟如下:
①對(duì)工作電極進(jìn)行預(yù)處理，使其表面光潔；
②在①中得到的電極表面滴加5?10μ? Γ5 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室溫下自然晾干；
③在②中得到的電極表面滴加5?10PL的戊二醛，室溫下自然晾干；
④在③中得到的電極表面滴加5?8μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
⑤在④中得到的電極表面滴加4飛μ?100 Pg/mL的BSA溶液，用以封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，即得到環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的工作電極。
[0008]2.本發(fā)明所述的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器，用于環(huán)境雌激素的檢測(cè)，步驟如下:
I)將已知濃度的環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到4(Γ60 μ?、ρΗ=7.(Γ8.0的PBS緩沖溶液中，制得抗原混合溶液，取5?10 PL抗原混合溶液滴涂到所制備的環(huán)境雌激素免疫傳感器的工作電極上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.(Γ8.0的PBS緩沖溶液清洗后，晾干，4 V保存；
2)將作為參比電極得甘汞電極、作為對(duì)電極得鉬絲電極，與I)中組裝的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電化學(xué)工作站上；在電解槽中先后加入l(T25mL ρΗ=7.(Γ8.0的PBS緩沖溶液和ImL 3飛mmol/L的過(guò)氧化氫(H2O2)溶液；通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；根據(jù)所得的電流響應(yīng)與環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；
3)將待測(cè)樣品溶液代替環(huán)境雌激素抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述環(huán)境雌激素抗原的工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0009]3.本發(fā)明所述的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用，其特征在于所述環(huán)境雌激素選自下列之一:雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、雙酚A或壬基酚。
[0010]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明所述的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器制備簡(jiǎn)單，操作方便，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種環(huán)境雌激素的快速、靈敏、高選擇性檢測(cè)，具有市場(chǎng)發(fā)展前景。
[0011](2)本發(fā)明首次采用C0Fe2CVrG0和AuOPdNRs-Ab共同修飾電極，并利用二者的協(xié)同催化效應(yīng)，顯著提高電流相應(yīng)速度和大小，進(jìn)一步增強(qiáng)了抗體的吸附量，從而構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1 CoFe204/rGo的制備
將8 mg氧化石墨烯超聲分散到25 ml無(wú)水乙醇中，依次加入0.5 ml 0.2 mol/mL的Fe (NO3)3 水溶液、0.25 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 2.0 ml 氨水，80°C下攪拌 10h，然后轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，180°C下反應(yīng)4h ;冷卻至室溫后，離心分離，于50°C真空干燥箱中烘干，即得CoFe204/rGo。
[0013]實(shí)施例2 CoFe204/rGo的制備
將10 mg氧化石墨烯超聲分散到30 ml無(wú)水乙醇中，依次加入I ml 0.2 mol/mL的Fe (NO3)3 水溶液、0.5 ml of 0.2 M Co (NO3) 2 水溶液和 2.50 ml 氨水，80°C下攪拌 12h，然后轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，180°C下反應(yīng)5h ;冷卻至室溫后，離心分離，于50°C真空干燥箱中烘干，即得 CoFe2O4Mo。
[0014]實(shí)施例3 CoFe204/rGo的制備
將12 mg氧化石墨烯超聲分散到35 ml無(wú)水乙醇中，依次加入1.5 ml 0.2 mol/mL的Fe (NO3)3 水溶液、0.75 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 3.0 ml 氨水，80°C下攪拌 14h，然后轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，180°C下反應(yīng)6h ;冷卻至室溫后，離心分離，于50°C真空干燥箱中烘干，即得CoFe204/rGo。
[0015]實(shí)施例4 AuiPdNRs-Ab的制備
將20mL金納米棒溶液和20mL 0.05 mol/L的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液混合，在30°C下攪拌，并順序加入3 mL 0.1 mol/L的L-抗壞血酸(AA)溶液、0.5 mL 0.03 mol/L的氯化鈀(PdCl2)溶液和3 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉(NaOH)溶液，停止攪拌，靜置lh，離心分離，加入20mL pH7.4的PBS緩沖溶液，然后再加入環(huán)境雌激素抗體(Ab)，在4°C下震蕩 24h，得到 AuOPdNRs-Ab。
[0016]實(shí)施例5 AuiPdNRs-Ab的制備
將20mL金納米棒溶液和20mL 0.1 mol/L的CTAB溶液混合，在35°C下攪拌，并順序加入 4 mL 0.1 mol/L 的 AA 溶液、0.8 mL 0.03 mol/L 的 PdCl2 溶液和 4 mL 0.1 mol/L 的NaOH溶液，停止攪拌，靜置2h，離心分離，加入20mL pH7.4的PBS緩沖溶液，然后再加入環(huán)境雌激素抗體(Ab)，在4°C下震蕩24h，得到Au@PdNRs-Ab。
[0017]實(shí)施例6 AuiPdNRs-Ab的制備
將20mL金納米棒溶液和20mL 0.2 mol/L的CTAB溶液混合，在45°C下攪拌，并順序加入 6 mL 0.1 mol/L 的 AA 溶液、I mL 0.03 mol/L 的 PdCl2 溶液和 6 mL 0.1 mol/L 的 NaOH溶液，停止攪拌，靜置3h，離心分離，加入20mL pH7.4的PBS緩沖溶液，然后再加入環(huán)境雌激素抗體(Ab)，在4°C下震蕩24h，得到Au@PdNRs-Ab。
[0018]實(shí)施例7環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器工作電極的制備方法
(1)對(duì)工作電極進(jìn)行預(yù)處理，使其表面光潔；
(2)在(I)中得到的電極表面滴加5μ? I mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室溫下自然晾干;
(3)在(2)中得到的電極表面滴加5μ?的戊二醛，室溫下自然晾干；
(4)在(3)中得到的電極表面滴加5μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
(5)在(4)中得到的電極表面滴加4μ? 100 Pg/mL的BSA溶液，用以封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，即得到環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的工作電極。
[0019]實(shí)施例8環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器工作電極的制備方法
(1)對(duì)工作電極進(jìn)行預(yù)處理，使其表面光潔；
(2)在(I)中得到的電極表面滴加8μ? 3 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室溫下自然晾干;
(3)在(2)中得到的電極表面滴加8μ?的戊二醛，室溫下自然晾干；
(4)在(3)中得到的電極表面滴加6μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
(5)在(4)中得到的電極表面滴加5μ? 100 Pg/mL的BSA溶液，用以封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，即得到環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的工作電極。
[0020]實(shí)施例9環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器工作電極的制備方法
(1)對(duì)工作電極進(jìn)行預(yù)處理，使其表面光潔；
(2)在(I)中得到的電極表面滴加10μ? 5 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室溫下自然晾干；
(3)在(2)中得到的電極表面滴加10μ?的戊二醛，室溫下自然晾干；
(4)在(3)中得到的電極表面滴加8μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存；
(5)在(4)中得到的電極表面滴加6μ? 100 Pg/mL的BSA溶液，用以封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，即得到環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的工作電極。
[0021]實(shí)施例10實(shí)施例1、制備的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器，用于環(huán)境雌激素的檢測(cè)，步驟如下
(1)將已知濃度的環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到40μ?、ρΗ=7.0的PBS緩沖溶液中，制得抗原混合溶液，取5 PL抗原混合溶液滴涂到所制備的環(huán)境雌激素免疫傳感器的工作電極上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.0的PBS緩沖溶液清洗后，晾干，4 °C保存；
(2)將作為參比電極得甘汞電極、作為對(duì)電極得鉬絲電極，與(I)中組裝的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電化學(xué)工作站上；在電解槽中先后加入1mL pH=7.0的PBS緩沖溶液和ImL 3 mmol/L的H2O2溶液；通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；根據(jù)所得的電流響應(yīng)與環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)將待測(cè)樣品溶液代替環(huán)境雌激素抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述環(huán)境雌激素抗原的工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0022]實(shí)施例11實(shí)施例1、制備的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器，用于環(huán)境雌激素的檢測(cè)，步驟如下
(1)將已知濃度的環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到50μ?、ρΗ=7.4的PBS緩沖溶液中，制得抗原混合溶液，取7 PL抗原混合溶液滴涂到所制備的環(huán)境雌激素免疫傳感器的工作電極上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.4的PBS緩沖溶液清洗后，晾干，4 °C保存；
(2)將作為參比電極得甘汞電極、作為對(duì)電極得鉬絲電極，與(I)中組裝的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電化學(xué)工作站上；在電解槽中先后加入20mL pH=7.4的PBS緩沖溶液和ImL 4 mmol/L的H2O2溶液；通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；根據(jù)所得的電流響應(yīng)與環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)將待測(cè)樣品溶液代替環(huán)境雌激素抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述環(huán)境雌激素抗原的工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0023]實(shí)施例12實(shí)施例1、制備的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器，用于環(huán)境雌激素的檢測(cè)，步驟如下
(1)將已知濃度的環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到60μ?、ρΗ=8.0的PBS緩沖溶液中，制得抗原混合溶液，取10 PL抗原混合溶液滴涂到所制備的環(huán)境雌激素免疫傳感器的工作電極上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=8.0的PBS緩沖溶液清洗后，晾干，4 °C保存；
(2)將作為參比電極得甘汞電極、作為對(duì)電極得鉬絲電極，與(I)中組裝的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電化學(xué)工作站上；在電解槽中先后加入25mL pH=8.0的PBS緩沖溶液和ImL 6 mmol/L的H2O2溶液；通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；根據(jù)所得的電流響應(yīng)與環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)將待測(cè)樣品溶液代替環(huán)境雌激素抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述環(huán)境雌激素抗原的工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0024]實(shí)施例13環(huán)境雌激素:雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、雙酚A或壬基酚的檢測(cè)，包括以下步驟
(1)選擇一種環(huán)境雌激素，按照實(shí)施例1、所述的步驟構(gòu)建環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器；
(2)按照實(shí)施例1(Γ12所述的步驟進(jìn)行檢測(cè)，環(huán)境雌激素的檢測(cè)技術(shù)指標(biāo)見(jiàn)表I。
[0025]表I環(huán)境雌激素的檢測(cè)技術(shù)指標(biāo)


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實(shí)施例14牛奶中環(huán)境雌激素的檢測(cè)
準(zhǔn)確移取牛奶樣品，加入一定質(zhì)量濃度的環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，以未加入環(huán)境雌激素抗原的牛奶為空白，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照實(shí)施例13的步驟進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定牛奶樣品中環(huán)境雌激素的回收率，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。
[0026]表2牛奶中多種環(huán)境雌激素的檢測(cè)結(jié)果.......................................................1.....................................................汴 ?.δ.Α?#:.............Si1.....................1si>%.....................Hie!...........^.0gaH1n-5%
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表2檢測(cè)結(jié)果可知，結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.0 %，平均回收率為96.0?102%，表明本發(fā)明可用于牛奶中多種環(huán)境雌激素的檢測(cè)，方法的靈敏度高、特異性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0027]實(shí)施例15水樣中環(huán)境雌激素的檢測(cè)
準(zhǔn)確移取一定水樣，加入一定質(zhì)量濃度的環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，以未加入環(huán)境雌激素抗原的水樣為空白，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照實(shí)施例13的步驟進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定水樣中環(huán)境雌激素的回收率，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。
[0028]表3水樣中多種環(huán)境雌激素的檢測(cè)結(jié)果
1.^t-1水樣

',1 W收值 RSl) % H收率
nrg ng'g? n=s %
雜.:+:醇5_no 4.91__2.Sm.2
雕 \M5Mt5il5:01I
d Itel Hd5 J14.86 3.x97.2
Htv) Λ5JHI5.1W 2.?102
1?_3.C105.U5 2.?101
表3檢測(cè)結(jié)果可知，結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.3 %，平均回收率為97.2?102%，表明本發(fā)明可用于水樣中多種環(huán)境雌激素的檢測(cè)，方法的靈敏度高、特異性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，所述環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器包括:工作電極、參比電極和對(duì)電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾CoFe204/rGo、戊二醛、AuOPdNRs-Ab、牛血清蛋白(BSA)，所述參比電極為飽和甘汞電極，所述對(duì)電極為鉬絲電極，所述C0Fe2CVrG0為鐵酸鈷/還原石墨烯復(fù)合材料，所述AuOPtNRs-Ab為金@鈀核殼納米棒復(fù)合材料孵化的環(huán)境雌激素抗體； 其特征在于，所述制備方法包括以下步驟:
a、制備CoFe204/rGo ；
b、制備AuOPdNRs-Ab ； C、制備環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器工作電極； 其中，步驟a制備CoFe204/rGo的具體步驟如下: 將8?12 mg氧化石墨烯超聲分散到25?35 ml無(wú)水乙醇中，依次加入0.5?1.5 ml 0.2mol/mL 的 Fe (NO3) 3水溶液、0.25?0.75 ml of 0.2 mol/L Co (NO3) 2 水溶液和 2.0?3.0 ml 氨水，80°C下攪拌l(Tl4h，然后轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，180°C下反應(yīng)4?6h ;冷卻至室溫后，離心分離，于50°C真空干燥箱中烘干，即得C0Fe2CVrG0 ； 步驟b制備AuOPdNRs-Ab的具體步驟如下: 將20mL金納米棒溶液和20mL 0.05、.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液混合，在3(T45°C下攪拌，并順序加入3飛mL 0.1 mol/L的L-抗壞血酸(AA)溶液、0.5?ImL 0.03 mol/L的氯化鈀(PdCl2)溶液和3?6 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉(NaOH)溶液，停止攪拌，靜置f 3h，離心分離，加入20mL pH7.4的PBS緩沖溶液，然后再加入環(huán)境雌激素抗體(Ab)，在 4°C下震蕩 24h，得到 AuOPdNRs-Ab ； 步驟c制備環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器工作電極的具體步驟如下: ①對(duì)工作電極進(jìn)行預(yù)處理，使其表面光潔； ②在①中得到的電極表面滴加5?10μ? Γ5 mg/mL的CoFe204/rGo水溶液，室溫下自然晾干； ③在②中得到的電極表面滴加5?10PL的戊二醛，室溫下自然晾干； ④在③中得到的電極表面滴加5?8μ? 10 Pg/mL的AuOPdNRs-Ab溶液，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存； ⑤在④中得到的電極表面滴加4飛μ?100 Pg/mL的BSA溶液，用以封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，4 V冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，即得到環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的工作電極。
2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器，用于環(huán)境雌激素的檢測(cè)，步驟如下: 1)將已知濃度的環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到4(Γ60μ?、ρΗ=7.(Γ8.0的PBS緩沖溶液中，制得抗原混合溶液，取5?10 PL抗原混合溶液滴涂到所制備的環(huán)境雌激素免疫傳感器的工作電極上，在4 V冰箱中保存晾干，ρΗ=7.(Γ8.0的PBS緩沖溶液清洗后，晾干，4 V保存； 2)將作為參比電極得甘汞電極、作為對(duì)電極得鉬絲電極，與I)中組裝的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電化學(xué)工作站上；在電解槽中先后加入l(T25mL ρΗ=7.(Γ8.0的PBS緩沖溶液和ImL 3飛mmol/L的過(guò)氧化氫(H2O2)溶液；通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；根據(jù)所得的電流響應(yīng)與環(huán)境雌激素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線； 3)將待測(cè)樣品溶液代替環(huán)境雌激素抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述環(huán)境雌激素抗原的工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。
3.如權(quán)利要求1和2所述的環(huán)境雌激素?zé)o標(biāo)記免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用，其特征在于所述環(huán)境雌激素選自下列之一:雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、雙酚A或壬基酚。
【文檔編號(hào)】G01N27/327GK104133070SQ201410338509
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】張勇, 郭占魁, 魏琴, 吳丹, 李燕 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)