一種快速測(cè)定尿巰基的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的快速檢測(cè)尿液中巰基的方法，包括以下檢測(cè)步驟：在測(cè)試孔內(nèi)順序加入試劑A100μL?、尿液50μL、試劑B50μL和試劑C50μL；在對(duì)照孔內(nèi)順序加入試劑A100μL、尿液50μL、試劑D50μL、試劑B50μL和試劑C50μL；2分鐘內(nèi)觀察兩孔顏色變化，若測(cè)試孔顯藍(lán)色、對(duì)照孔未顯色或測(cè)試孔顯色明顯重于對(duì)照孔則為陽(yáng)性，表明尿標(biāo)本內(nèi)含有巰基；若兩孔均未顯色或顯色無(wú)明顯差異則為陰性，表明尿標(biāo)本內(nèi)不含有巰基；本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，簡(jiǎn)單實(shí)用，成本低廉，安全可靠，可快速的篩查出尿液中不含巰基的樣本、含巰基的樣本和可能含有巰基的樣本，為進(jìn)一步檢查做準(zhǔn)備。
【專利說(shuō)明】[0001] 一種快速測(cè)定尿巰基的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體涉及一種用普魯士藍(lán)法快速檢測(cè)尿液巰基的方 法。
[0003]

【背景技術(shù)】 許多天然蛋白質(zhì)含有游離巰基（free sulfhydryl groups)或潛在的巰基。在蛋白質(zhì) 中，巰基往往以活性功能基的形式參與酶的催化或參與輔助因子的結(jié)合或參與蛋白質(zhì)活性 構(gòu)象的維持。研究蛋白質(zhì)巰基的數(shù)量和性質(zhì)是近代生物化學(xué)獲得某些信息的重要手段之 一。正常人尿中幾乎不含有巰基，但是體內(nèi)某些代謝異常則導(dǎo)致尿中巰基含量增高。
[0004] 現(xiàn)今已知用來(lái)作用蛋白質(zhì)巰基的試劑大約有60多種，其中，Ellman試劑是檢測(cè)蛋 白質(zhì)巰基常用的試劑。Ellman試劑，也稱為DTNB (5, 5 -二硫二硝基苯甲酸)試劑，該試劑 是一種通用的檢測(cè)溶液中自由巰基的水溶性化合物。DTNB與蛋白質(zhì)巰基相互作用形成有色 的硫酚陰離子（CNT)，該化合物的溶液與巰基反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生黃色的化合物。檢測(cè)諸如具有末端 半胱氨酸殘基的多肽的未知樣品。但是，Ellman試劑操作比較復(fù)雜，靈敏度欠佳。
[0005] 尿巰基測(cè)定目前使用的另一,決速方法是硝普鈉試驗(yàn)：尿液1ml加入5%氰化鈉水溶 液，放置5分鐘，加入5%硝普鈉水溶液一滴，出現(xiàn)紅色或紫紅色為陽(yáng)性，表示尿中有過(guò)量的 巰基。該法涉及劇毒物質(zhì)一氰化鈉，生物安全度極低，給生產(chǎn)和使用均造成極大隱患。
[0006] 因此，發(fā)明一種新的、安全無(wú)毒、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、靈敏度高的檢測(cè)方法快速的 確定尿液中是否含有巰基，成為一個(gè)需要解決的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)尿液中的巰基方法敏感度低、毒性高、耗時(shí)長(zhǎng)、生物安全 度低的問(wèn)題，本發(fā)明提供了新的普魯士藍(lán)法快速測(cè)定尿巰基的方法，本發(fā)明提供的方法其 生物安全度高，而且靈敏度高，成本低廉，方便快捷。
[0008] 本發(fā)明提供的快速檢測(cè)尿液中巰基的方法，包括以下檢測(cè)步驟： 在測(cè)試孔內(nèi)順序加入試劑A 100 μ L、尿液50 μ L、試劑B 50 μ L和試劑C50 μ L ;在對(duì) 照孔內(nèi)順序加入試劑Α100 μ L、尿液50 μ L、試劑D50 μ L、試劑Β50 μ L和試劑C50 μ L ;2分 鐘內(nèi)觀察兩孔顏色變化，若測(cè)試孔顯藍(lán)色、對(duì)照孔未顯色或測(cè)試孔顯色明顯重于對(duì)照孔則 為陽(yáng)性，表明尿標(biāo)本內(nèi)含有巰基；若兩孔均未顯色或顯色無(wú)明顯差異則為陰性，表明尿標(biāo)本 內(nèi)不含有疏基； 所述試劑Α為2Μ ΡΗ5. 0醋酸緩沖液，配制方法如下： 2M醋酸鈉溶液：醋酸鈉8. 2g，加凈化水溶解，定容至100ml ; 2M醋酸溶液：冰醋酸6g，.加凈化水溶解，定容至100ml ; 2M醋酸鈉溶液10ml+2M醋酸溶液2ml，混勻，冰箱冷存48小時(shí)； 所述試劑B為1%鐵氰化鉀溶液，配制方法如下：鐵氰化鉀lg，加凈化水 溶解，定容至100ml ; 所述試劑C為2%三氯化鐵溶液，配制方法如下：三氯化鐵(含6分子 H20) 2g，加凈化水溶解，定容至100ml ; 所述試劑D為0. 1M二氯化汞溶液，配制方法如下：二氯化汞2. 7g，加凈化水溶解，定容 至 100ml ; 普魯士藍(lán)（?1'11881311131116)又稱亞鐵氰化鐵(分子式：？64|^6(01'〇6]3)是經(jīng)典的配合 物。其配體為六個(gè)氰基，中心離子為二價(jià)鐵離子。氰基與二價(jià)鐵離子共同通過(guò)配位鍵組成 六氰合鐵（II)酸根(整體顯-4價(jià)）作為普魯士藍(lán)的內(nèi)配位層（內(nèi)界)。而外層的三價(jià)鐵離子 與鉀離子作為普魯士藍(lán)的外配位層(外界）通過(guò)離子鍵與六氰合鐵（II)酸根以離子鍵的形 式相連接。
[0009] 普魯士藍(lán)的結(jié)構(gòu)：普魯士藍(lán)為六面立(正）方結(jié)構(gòu)。氰基作為立(正）方的各條棱連 結(jié)處于頂點(diǎn)的鐵離子，其中相同價(jià)態(tài)的鐵離子在各面上均互為對(duì)角，而每間隔一個(gè)立（正） 方，鉀離子會(huì)被包裹在其中。
[0010] 巰基（一SH)作為一種還原劑使三氯化鐵還原成二氯化鐵，后者與鉄氰化鉀反應(yīng)生 成普魯士藍(lán)而呈現(xiàn)藍(lán)色。利用這一化學(xué)反應(yīng)可以測(cè)定尿中巰基物含量。
[0011] 3K4Fe(CN)6 + 4FeC13 - Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KC1 但是尿中存在的尿酸、維生素 C等還原性物質(zhì)也能使鉄氰化鉀還原，故有干擾。正常體 內(nèi)尿酸池平均為1200mg，每天產(chǎn)生750mg，排出500?lOOOmg。在正常情況下，約2 / 3經(jīng) 腎臟排泄，其余1 / 3在腸道分解排出。但研究發(fā)現(xiàn)：巰基在酸性環(huán)境中還原性較強(qiáng)，而尿 酸在堿性環(huán)境中具有還原性。制作一個(gè)酸性環(huán)境則可基本排除尿酸對(duì)巰基檢測(cè)的干擾。此 夕卜，以二氯化汞與巰基結(jié)合，可作尿酸和維生素 C等干擾物的空白對(duì)照加以排除。
[0012] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，簡(jiǎn)單實(shí)用，成本低廉，安全可靠，可快速的篩查出尿液中 不含巰基的樣本、含巰基的樣本和可能含有巰基的樣本，為進(jìn)一步檢查做準(zhǔn)備。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0014] 實(shí)施例1 (1) 請(qǐng)受檢者留取尿液2ml以上； (2) 向測(cè)試孔和對(duì)照孔內(nèi)分別滴入試劑A各100 μ L ; (3) 再向測(cè)試孔和對(duì)照孔內(nèi)分別滴入標(biāo)本尿液各50 μ L ; (4) 再向?qū)φ湛變?nèi)滴入試劑D50 μ L ; (5) 再向測(cè)試孔和對(duì)照孔內(nèi)分別滴入試劑Β各50 μ L ; (6) 再向測(cè)試孔和對(duì)照孔內(nèi)分別滴入試劑C各50 μ L ; (7) 2分鐘內(nèi)觀察測(cè)試孔和對(duì)照孔內(nèi)液體的顏色變化。
[0015] 檢測(cè)結(jié)果判定如下： (1) 測(cè)試孔和對(duì)照孔均不顯色則為陰性，說(shuō)明尿液中不含巰基； (2) 測(cè)試孔和對(duì)照孔均顯同等顏色(藍(lán)色)，亦為陰性，說(shuō)明尿液中不含巰基； (3) 測(cè)試孔顯色(藍(lán)色)，對(duì)照孔不顯色則為陽(yáng)性，說(shuō)明尿液中含巰基；測(cè)試孔顯色越深， 說(shuō)明尿液中含巰基越多；
【權(quán)利要求】
1. 一種快速測(cè)定尿巰基的方法，包括以下檢測(cè)步驟： 在測(cè)試孔內(nèi)順序加入試劑A 100 μ L、尿液50 μ L、試劑B 50 μ L和試劑C50 μ L ;在對(duì) 照孔內(nèi)順序加入試劑Α100 μ L、尿液50 μ L、試劑D50 μ L、試劑Β50 μ L和試劑C50 μ L ;2分 鐘內(nèi)觀察兩孔顏色變化，若測(cè)試孔顯藍(lán)色、對(duì)照孔未顯色或測(cè)試孔顯色明顯重于對(duì)照孔則 為陽(yáng)性，表明尿標(biāo)本內(nèi)含有巰基；若兩孔均未顯色或顯色無(wú)明顯差異則為陰性，表明尿標(biāo)本 內(nèi)不含有疏基； 所述試劑Α為2Μ ΡΗ5. 0醋酸緩沖液； 所述試劑B為1%鐵氰化鉀溶液； 所述試劑C為2%三氯化鐵溶液； 所述試劑D為0. 1M二氯化汞溶液。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104089953SQ201410344565
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月19日
【發(fā)明者】溫鑫, 崔子倫 申請(qǐng)人:青島貝爾奧生物科技有限公司