柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法，屬于農(nóng)藥快速檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。采用乙腈、無水硫酸鎂和氯化鈉按一定比例混合以盡可能地提取柑桔中的農(nóng)藥成分，再由無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳按一定比例混合后，去除萃取液中有機酸、色素、膠質(zhì)和纖維素等熒光物質(zhì)的影響，從而大大提高了表面增強拉曼光譜用于柑桔中農(nóng)藥殘留的檢測精度，達到痕量農(nóng)藥殘留快速檢測的目的，使該方法基本達到國家規(guī)定的檢測限要求。本發(fā)明的方法對柑桔中痕量農(nóng)藥殘留進行檢測，待測樣品前處理簡單，檢測速度快，檢測成本低，方法的準確度和精確度高，能快速準確地定性定量分析柑桔樣品中的痕量農(nóng)藥殘留，可用于現(xiàn)場大規(guī)模樣品檢測。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的快速篩查方法領(lǐng)域，特別是涉及柑桔中痕量農(nóng) 藥殘留的表面增強拉曼光譜快速篩查方法，屬于果蔬農(nóng)藥快速檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。 柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法

【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔內(nèi)含有豐富的黃酮類化合物、類胡蘿卜素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有提高機體 免疫力、抗氧化、抗衰老、降血糖等作用。柑桔是我國南方第一大水果，也是世界第一大水 果，在世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)十分重要的位置。目前，農(nóng)藥防治仍是最方便、最有效、最經(jīng)濟的 柑桔病蟲草害防治方法，而農(nóng)藥的不規(guī)范使用導(dǎo)致柑桔中存在嚴重的農(nóng)藥超標現(xiàn)象。
[0003] 目前，柑桔中農(nóng)藥殘留檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色 譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法、生物傳感器法等，前4種方法檢測時間長、檢測費 用高，酶聯(lián)免疫法、生物傳感器法具有操作簡便、快速等特點，但也存在一些缺陷，如酶抑制 法容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，生物傳感器法也存在結(jié)果的穩(wěn)定性差、精密度低和使用 壽命短等問題。
[0004] 拉曼光譜是一種分子散射光譜，攜帶的是分子結(jié)構(gòu)信息，每一種物質(zhì)都有其對應(yīng) 的"指紋"信息，據(jù)此可對物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分進行表征，已廣泛用于分子結(jié)構(gòu)分析和分子 鑒別，具有檢測速度快、分辨率高、受水干擾小等優(yōu)點。而拉曼散射強度很弱，靈敏度低， 有時會淹沒于分子的突光信號中。但采用表面增強拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)等增強技術(shù)使其檢測靈敏度能提高4-10個數(shù)量級，在單個分子探測、痕 量物質(zhì)檢測方面具有較大的應(yīng)用潛力。近年來，研究者們將表面增強拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于 食品、農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測中。如申請?zhí)?01110229459. 5、名稱為"一種蔬菜中甲胺磷的 表面增強拉曼光譜快速篩查方法"的專利申請，采用極性溶劑提取蔬菜中的甲胺磷農(nóng)藥，以 銀溶膠為增強基底，繪制以甲胺磷濃度為橫坐標，特征峰峰高為縱坐標的標準曲線，建立了 蔬菜中甲胺膦農(nóng)藥殘留的快速篩查方法。申請?zhí)?01310428126. 4、名稱為"一種水果農(nóng)藥 殘留的表面增強拉曼光譜檢測方法"的專利申請，采用丙酮為溶劑提取果皮中的農(nóng)藥，利用 Fe304和C18吸附劑來吸附提取液中的農(nóng)藥，采用丙酮、乙酸乙酯漂洗Fe 304和C18吸附劑后， 再用二氯甲烷從吸附劑Fe30 4和C18中洗滌出農(nóng)藥，用于拉曼光譜檢測。李永玉（食品安全 質(zhì)量檢測學(xué)報，2012年第6期，P672-675)公開了利用激光顯微拉曼光譜技術(shù)無損檢測蘋果 表面敵百蟲農(nóng)藥殘留方法，該方法檢測限為4800mg/kg。劉文涵（光譜實驗室，2012年第4 期，P2059-2062)公開了利用激光拉曼光譜技術(shù)檢測蔬菜紅辣椒表面的甲基毒死蜱。劉燕 德（中國農(nóng)機化學(xué)報，2014年第1期，P88-91)公開了利用共焦顯微拉曼光譜技術(shù)分析臍橙 表皮的樂果農(nóng)藥殘留，建立了臍橙表皮樂果農(nóng)藥殘留的預(yù)測模型。國家標準規(guī)定，農(nóng)產(chǎn)品中 農(nóng)藥殘留最低檢測限達到mg/kg級甚至達到μ g/kg級。表面增強拉曼光譜檢測技術(shù)理論 上能達到單分子檢測，但柑桔類等水果中含有大量有機酸、色素、膠質(zhì)和纖維素等大分子物 質(zhì)，這些物質(zhì)容易產(chǎn)生熒光，且不同農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)成分不同，對農(nóng)藥分子的SERS檢測產(chǎn)生的 干擾也不同；另外，農(nóng)產(chǎn)品中使用的農(nóng)藥種類較多，拉曼增強效應(yīng)差異較大，導(dǎo)致SERS方法 檢測農(nóng)產(chǎn)品中痕量農(nóng)藥殘留的精密度和重現(xiàn)性較差。上述公開的方法使用表面增強拉曼光 譜技術(shù)能達到對水果中農(nóng)藥分子信號增強的目的，但并未去除基質(zhì)物質(zhì)的影響，方法的檢 測限有待進一步提高，方法的準確性、穩(wěn)定性較差，不能達到水果中痕量農(nóng)藥殘留快速檢測 的目的。另外，上述公開的水果中農(nóng)藥殘留檢測方法的精密度和重現(xiàn)性也未進一步驗證。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服桔柑類等水果中有機酸、色素、膠質(zhì)等基質(zhì)對水果中痕 量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜檢測的影響，提供一種柑桔類農(nóng)產(chǎn)品中痕量農(nóng)藥殘留的表 面增強拉曼光譜快速檢測方法，以提高柑桔類農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測限。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方 法，按照下述步驟進行：
[0007] (1)銀納米或金納米增強基底的制備：采用檸檬酸三鈉加熱還原法制備得到。
[0008] (2)建立各種農(nóng)藥標準品的表面增強拉曼譜圖，并對其譜峰進行歸屬和解析。
[0009] (3)待測柑桔樣品經(jīng)搗碎后，萃取出樣品溶液，萃取液為黃色。
[0010] (4)采用無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳對上述萃取液進行凈化，去除 萃取液中有機酸、色素等熒光物質(zhì)對拉曼檢測效果的影響。萃取液經(jīng)凈化后，由黃色變成無 色。凈化后的溶液過0. 22 μ m有機濾膜。
[0011] (5)取步驟（4)的20 μ L待測過濾液、步驟（1)制備的500 μ L增強基底溶液和 100 μ L氯化鈉溶液（質(zhì)量濃度為1 % )混合均勻，用于拉曼光譜檢測。
[0012] (6)以化學(xué)方法檢測柑桔中不含農(nóng)藥殘留的柑桔為空白樣品，空白樣品經(jīng)搗碎后， 由步驟（3)提取和步驟（4)凈化，配制以空白柑桔提取液為基質(zhì)的不同濃度的農(nóng)藥標準溶 液，過0. 22 μ m有機濾膜。取20 μ L待測過濾液、步驟⑴制備的500 μ L增強基底溶液和 100 μ L氯化鈉溶液（質(zhì)量濃度為1 % )混合均勻，用于拉曼光譜檢測。
[0013] (7)將步驟（5)所得的待測試樣的SERS譜圖與步驟（2)所歸屬的農(nóng)藥拉曼譜峰進 行對比，便可確定待測試樣中是否含有該種農(nóng)藥，即達到對待測柑桔試樣中是否含有農(nóng)藥 殘留定性判別的目的。
[0014] (8)將步驟（6)所測得的待測柑桔試樣的SERS譜圖與步驟（2)所歸屬的農(nóng)藥拉曼 譜峰進行對比，選擇拉曼峰強度較高的農(nóng)藥特征峰用于柑桔中農(nóng)藥殘留的定量分析。以農(nóng) 藥濃度為橫坐標，特征峰的峰強度為縱坐標繪制標準曲線，用于柑桔樣品中農(nóng)藥殘留的定 量分析。
[0015] 其中步驟⑴銀納米或金納米增強基底的制備：銀納米增強基底采用檸檬酸三 鈉加熱還原法制備得到，按照下述步驟進行：將一定濃度的硝酸銀溶液（36mg硝酸銀溶于 200mL超純水）倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，高溫迅速加熱到沸騰，在2分鐘內(nèi)逐步 滴入濃度為1 %的檸檬酸三鈉溶液（60mg檸檬酸三鈉溶于6mL超純水），同時以200r/min 的轉(zhuǎn)速攪拌，此時溶液慢慢由透明變淡棕色，反應(yīng)25min后得到灰綠色液體。待室溫冷卻 后，將上述適量銀膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入適量超 純水，用超聲振蕩混勻，銀膠經(jīng)多次提純后，避光保存。
[0016] 金納米增強基底采用檸檬酸三鈉加熱還原法制備得到，按照下述步驟進行：將一 定濃度的高氯金酸溶液（l〇mg高氯金酸溶于100mL超純水中）倒入三口燒瓶中，放在恒溫 磁力攪拌器上，溫度控制在120°C恒定加熱至沸騰后，迅速加入一定濃度的檸檬酸三鈉溶液 (20mg朽1檬酸三鈉溶于4mL超純水），同時以100r/min的轉(zhuǎn)速快速攪拌。制備的金溶膠顏 色為酒紅色。待溶液冷卻后，避光保存。
[0017] 其中步驟（2)建立各種農(nóng)藥標準品的表面增強拉曼譜圖，并對其進行譜峰歸屬和 解析，按照下述步驟進行：稱取20mg農(nóng)藥標準品，放于200mL的容量瓶中，用有機溶劑定容 到刻度，用超聲振蕩溶解，制成濃度為l〇〇mg/L的標準品母液。將母液稀釋成一定濃度的標 準溶液，取稀釋標準溶液20 μ L、步驟（1)制備的500 μ L增強基底溶液和100 μ L氯化鈉溶 液（質(zhì)量濃度為1% )混合均勻，用于拉曼光譜檢測。參照相關(guān)文獻，對農(nóng)藥分子的官能團 特征振動頻率進行譜峰歸屬和解析，得到各農(nóng)藥分子的特征譜峰，這些特征譜峰作為柑桔 中該農(nóng)藥殘留的定性定量判別依據(jù)。
[0018] 所述步驟（3)的萃取方法為：待測柑桔樣品經(jīng)搗碎后，稱取10g搗碎樣品放于 50mL離心管中，向離心管中依次加入10mL乙腈、4g無水硫酸鎂和lg氯化鈉，搖勻后在渦旋 混合器上以400r/min的轉(zhuǎn)速渦旋混合2min，再將此離心管放入離心機中，以4200r/min的 轉(zhuǎn)速離心5min，此時上清液為黃色。
[0019] 所述步驟⑷的凈化方法為：在15mL離心管中，分別加入600mg無水硫酸鎂、60mg N-丙基乙二胺、60mg (318和2〇11^石墨化碳，取步驟⑶的4mL萃取液加入此離心管中，搖勻 后在400r/min的潤旋混合器上混合2min后，再將此離心管放入離心機以4200r/min的轉(zhuǎn) 速離心5min，得到無色上清液。
[0020] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后得到以下技術(shù)效果：
[0021] 1、柑桔類等水果中含有大量有機酸、色素、膠質(zhì)和纖維素等大分子物質(zhì)，這些物質(zhì) 容易產(chǎn)生熒光，對農(nóng)藥的拉曼光譜影響非常大。本發(fā)明采用乙腈、無水硫酸鎂和氯化鈉按一 定比例混合以盡可能地提取柑桔中的農(nóng)藥成分，再由無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C 18和石 墨化碳按一定比例混合后，去除萃取液中有機酸、色素、膠質(zhì)和纖維素等熒光物質(zhì)的影響， 從而大大提高了表面增強拉曼光譜用于柑桔中農(nóng)藥殘留的檢測精度，達到痕量農(nóng)藥殘留快 速檢測的目的，使該方法基本達到國家規(guī)定的檢測限要求。
[0022] 2、采用本發(fā)明公開的柑桔中痕量農(nóng)藥殘留表面增強拉曼光譜檢測方法對柑桔中 痕量農(nóng)藥殘留進行檢測，待測樣品前處理簡單，檢測速度快，檢測成本低，方法的準確度和 精確度高，能快速準確地定性定量分析柑桔樣品中的痕量農(nóng)藥殘留，可用于現(xiàn)場大規(guī)模樣 品檢測。
[0023] 3、本發(fā)明的結(jié)果與化學(xué)測定方法具有很好的一致性，有效避免了化學(xué)方法檢測柑 桔中農(nóng)藥殘留所存在的缺陷，可為柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的智能化檢測提供技術(shù)支持。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 以下結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0025] 圖1是三唑磷農(nóng)藥標準溶液的表面增強拉曼光譜圖；
[0026] 圖2是以臍橙果肉提取液為基質(zhì)的不同濃度三唑磷溶液表面增強拉曼譜圖；
[0027] 圖3是采用無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳對臍橙果肉萃取液凈化前 后的表面增強拉曼譜圖；
[0028] 圖4是建立的臍橙果肉中三唑磷農(nóng)藥殘留定量分析的標準曲線圖，圖中橫坐標為 三唑磷濃度，縱坐標為以三唑磷特征譜峰1407CHT1處的峰強度與乙腈在2257CHT1特征峰強 度的比值；
[0029] 圖5是以臍橙果皮提取液為基質(zhì)的不同濃度三唑磷溶液表面增強拉曼譜圖；
[0030] 圖6是采用無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳對臍橙果皮萃取液凈化前 后的表面增強拉曼譜圖；
[0031] 圖7是建立的臍橙果皮中三唑磷農(nóng)藥殘留定量分析的標準曲線圖，圖中橫坐標為 三唑磷濃度，縱坐標為977CHT 1處的峰強度；
[0032] 圖8是噻菌靈農(nóng)藥標準溶液的表面增強拉曼光譜圖；
[0033] 圖9是以臍橙果肉提取液為基質(zhì)的不同濃度的噻菌靈溶液表面增強拉曼譜圖；
[0034] 圖10是建立的噻菌靈標準溶液的定量分析標準曲線圖，圖中橫坐標為噻菌靈濃 度，縱坐標為lOlOcnT 1處的峰強度。

【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述 實施例。
[0036] 實施例1 :臍橙果肉中三唑磷農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測
[0037] (1)制備銀納米增強基底：將一定濃度的硝酸銀溶液（36mg硝酸銀溶于200mL超 純水）倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，高溫迅速加熱到沸騰，在2分鐘內(nèi)逐步滴入濃 度為1 %的檸檬酸三鈉溶液（60mg檸檬酸三鈉溶于6mL超純水），同時以200r/min的轉(zhuǎn)速 攪拌，此時溶液慢慢由透明變淡棕色，反應(yīng)25min后得到灰綠色液體。待室溫冷卻后，將上 述適量銀膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入適量超純水，用 超聲振蕩混勻，銀膠經(jīng)多次提純后，避光保存。
[0038] (2)選擇激發(fā)光源波長為785nm的拉曼光譜儀，功率為200mW，光譜掃描范圍 400?2000CHT 1，分辨率為4CHT1，積分時間為10s，積分2次求平均。稱取20mg三唑磷農(nóng)藥 標準品，放于200mL的容量瓶中，用乙腈有機溶劑定容到刻度，用超聲振蕩溶解，制成濃度 為100mg/L的標準品母液，將母液稀釋成濃度為20mg/L三唑磷標準溶液。取稀釋濃度為 20mg/L三唑磷標準溶液20 μ L、步驟⑴制備的500 μ L增強基底溶液和100 μ L氯化鈉溶液 (質(zhì)量濃度為1% )混合均勻，用于拉曼光譜檢測，得到三唑磷標準溶液的表面增強拉曼光 譜，如圖1所示。圖中611、977、1000、1330、1407和1595〇^ 1處拉曼信號明顯，其中1407〇^1 處強度最高，主要由三唑磷結(jié)構(gòu)中三唑環(huán)上C-N伸縮振動引起，另外還伴隨有-CH3/CH2/CH 彎曲振動；977、1000和1330〇^1峰強次之，977〇^1為(^4和苯環(huán)的彎曲振動，1000〇^ 1由 苯環(huán)的呼吸振動引起，1330CHT1歸屬于C-N伸縮振動；611CHT1處的峰強較弱，主要由C-0-P 彎曲振動引起，伴有整個骨架的振動；1595CHT1歸屬于苯環(huán)上C = C伸縮振動。這些特征峰 可作為三唑磷農(nóng)藥殘留的定性定量判別依據(jù)。
[0039] (3)待測臍橙果肉樣品經(jīng)搗碎后，稱取10g搗碎果肉放于50mL離心管，向離心管中 依次加入10mL乙腈、4g無水硫酸鎂和lg氯化鈉，搖勻后在渦旋混合器上以400r/min的轉(zhuǎn) 速渦旋混合2min，再將此離心管放入離心機中，以4200r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，此時上清液 為黃色。
[0040] (4)在15mL離心管中，分別加入600mg無水硫酸鎂、60mg N-丙基乙二胺、60mg C18 和20mg石墨化碳，取步驟⑶的4mL萃取液加入此離心管中，搖勻后以400r/min的轉(zhuǎn)速在 潤旋混合器上混合2min，再將此離心管放入離心機以4200r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，得到無 色上清液。無色上清液過〇. 22 μ m有機濾膜，待用。
[0041] (5)選擇激發(fā)光源波長為785nm的拉曼光譜儀，功率為200mW，光譜掃描范圍 400?2000CHT 1，分辨率為4CHT1，積分時間為10s，積分2次求平均。取步驟（4)的20 μ L待 測過濾液、步驟（1)制備的500 μ L銀納米溶液和濃度為1 %的100 μ L氯化鈉溶液混合均 勻，用于拉曼光譜檢測，得到待測樣品的表面增強拉曼譜圖。圖2為不同濃度以臍橙果肉提 取液為基質(zhì)的三唑磷溶液表面增強拉曼光譜。對比圖1和圖2,可看出待測樣品的表面增強 拉曼光譜中存在611、977、1000、1407和1595CHT 1處的5個三唑磷的拉曼特征峰，這5個特 征峰可作為臍橙果肉中三唑磷農(nóng)藥殘留的判別依據(jù)。由圖2還可看出，當(dāng)濃度為2mg/L時， 三唑磷的5處拉曼峰明顯，易識別；濃度為lmg/L時，611CHT 1處的拉曼特征峰已不易識別， 其他4處特征峰的峰強明顯降低，但依然能識別出；濃度為0. 6mg/L時，lOOOcnT1和1407CHT1 兩處特征峰可識別但峰強較低；濃度為0. 5mg/L時，1407CHT1處特征峰不易識別，但其依然 存在，峰強十分微弱；濃度為〇.4mg/L時，未出現(xiàn)三唑磷農(nóng)藥的特征拉曼峰。由此表明，利用 表面增強拉曼光譜技術(shù)能檢測到臍橙果肉中三唑磷農(nóng)藥的最低檢測濃度為0. 5mg/L。
[0042] (6)圖3是采用無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳對臍檢果肉萃取液凈 化前后的表面增強拉曼光譜對比圖。圖中標注"空白"是空白臍橙果肉萃取液的表面增強 拉曼譜圖，標注"凈化前"是由空白臍橙果肉萃取液為基質(zhì)制備的濃度為l〇〇mg/L的三唑磷 溶液表面增強拉曼譜圖，標注"凈化后"是由空白臍橙果肉萃取液為基質(zhì)制備濃度為l〇〇mg/ L的三唑磷溶液經(jīng)無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳凈化后的表面增強拉曼譜圖。 從圖可看出，空白臍橙果肉萃取液和凈化前的以空白臍橙果肉提取液為基質(zhì)的三唑磷溶液 的譜峰強度較低，存在明顯的熒光干攏，凈化前的以空白臍橙提取液為基質(zhì)的三唑磷溶液 的拉曼譜峰在977、1000和1407CHT 1處存在較弱的三唑磷拉曼峰，而在以空白臍橙果肉提 取液為基質(zhì)的三唑磷溶液經(jīng)無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C 18和石墨化碳凈化后的拉曼譜圖 中，熒光信號的干攏明顯減少，譜峰強度明顯增強，除了 977U000和1407CHT1處的三唑磷拉 曼峰強度明顯增強外，還出現(xiàn)了 611U595CHT1處的三唑磷拉曼峰。這說明使用無水硫酸鎂、 N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳對萃取液凈化后，去除了臍橙果肉中大量有機酸、色素、膠質(zhì) 和纖維素等突光物質(zhì)，大大提聞了胳澄中農(nóng)藥殘留的檢測精度。
[0043] (7)以化學(xué)方法檢測臍橙中不含三唑磷農(nóng)藥殘留的臍橙為空白樣品，空白樣品果 肉經(jīng)搗碎后，由步驟（3)提取和步驟（4)凈化后，配制以空白臍橙果肉提取液為基質(zhì)的不同 濃度三唑磷溶液，過0. 22 μ m有機濾膜。選擇激發(fā)光源波長為785nm的拉曼光譜儀，功率為 200mW，光譜掃描范圍400?2000CHT1，分辨率為4CHT 1，積分時間為10s，積分2次求平均，得 到不同濃度以臍橙果肉提取液為基質(zhì)的三唑磷溶液表面增強拉曼光譜。因光源輸出功率的 穩(wěn)定性、檢測元件的暗電流以及樣品濃度不同等因素會引起拉曼散射指數(shù)不同，這些因素 會影響檢測結(jié)果的準確性。本發(fā)明選用2257CHT 1處乙腈C = N伸縮振動峰為內(nèi)標峰來最大 可能地消除外界因素的影響，這是因為2257CHT1處拉曼峰較穩(wěn)定且與三唑磷的特征峰不重 合，另外采用乙腈為內(nèi)標物可避免因加入其它試劑對待測溶液產(chǎn)生干擾。
[0044] 在三唑磷的拉曼特征峰中，1407CHT1歸屬于三唑環(huán)上C-N伸縮振動，且沒有重疊峰 的影響，因此選用該特征峰作為定量分析譜峰。以三唑磷濃度為橫坐標，以三唑磷特征譜峰 1409CHT1處的峰強度與乙腈在2257CHT1的特征峰強度的比值為相對強度為縱坐標繪制標準 曲線，標準曲線如圖5所示，得到在線性范圍為0. 5?20mg/L標準曲線的函數(shù)關(guān)系為：y = 0. 3434x+2. 1008,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9919,線性關(guān)系良好，可用于臍橙果肉中三唑磷農(nóng)藥殘留 的定量分析。
[0045] 向已知三唑磷含量的臍橙果肉樣品中添加不等量的三唑磷標準溶液，按實施例1 中步驟進行操作，每個樣品重復(fù)測定3次，同時測定加標回收率與相對標準偏差，結(jié)果見表 1。 加標平均回收率為81. 23%?97. 95%，相對標準偏差在0. 84%?3. 30%之間，說明本 發(fā)明公開的方法具有較高的準確度和精密度。
[0046] 表1三唑磷在臍橙果肉樣品中的添加回收率和相對標準偏差
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法，其特征在于按照下述步驟 進行： (1) 銀納米或金納米增強基底的制備：采用檸檬酸三鈉加熱還原法制備得到； (2) 建立各種農(nóng)藥標準品的表面增強拉曼譜圖，并對其譜峰進行歸屬和解析； (3) 待測柑桔樣品經(jīng)搗碎后，萃取出樣品溶液，萃取液為黃色； (4) 采用無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和石墨化碳對上述萃取液進行凈化，去除萃取 液中有機酸、色素等熒光物質(zhì)對拉曼檢測效果的影響；萃取液經(jīng)凈化后，由黃色變成無色； 凈化后的溶液過〇. 22 μ m有機濾膜； (5) 取步驟（4)的20 μ L待測過濾液、步驟（1)制備的500 μ L增強基底溶液和100 μ L 氯化鈉溶液（質(zhì)量濃度為1% )混合均勻，用于拉曼光譜檢測； (6) 以化學(xué)方法檢測柑桔中不含農(nóng)藥殘留的柑桔為空白樣品，空白樣品經(jīng)搗碎后，由步 驟（3)提取和步驟（4)凈化，配制以空白柑桔提取液為基質(zhì)的不同濃度的農(nóng)藥標準溶液，過 0. 22 μ m有機濾膜；取20 μ L待測過濾液、步驟⑴制備的500 μ L增強基底溶液和100 μ L 質(zhì)量濃度為1 %氯化鈉溶液混合均勻，用于拉曼光譜檢測； (7) 將步驟（5)所得的待測試樣的SERS譜圖與步驟（2)所歸屬的農(nóng)藥拉曼譜峰進行對 t匕，便可確定待測試樣中是否含有該種農(nóng)藥，即達到對待測柑桔試樣中是否含有農(nóng)藥殘留 定性判別的目的； (8) 將步驟（6)所測得的待測柑桔試樣的SERS譜圖與步驟（2)所歸屬的農(nóng)藥拉曼譜峰 進行對比，選擇拉曼峰強度較高的農(nóng)藥特征峰用于柑桔中農(nóng)藥殘留的定量分析；以農(nóng)藥濃 度為橫坐標，特征峰的峰強度為縱坐標繪制標準曲線，用于柑桔樣品中農(nóng)藥殘留的定量分 析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法， 其特征在于其中步驟（1)銀納米或金納米增強基底的制備：銀納米增強基底采用檸檬酸三 鈉加熱還原法制備得到，按照下述步驟進行：將一定濃度的硝酸銀溶液（36mg硝酸銀溶于 200mL超純水）倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，高溫迅速加熱到沸騰，在2分鐘內(nèi)逐 步滴入濃度為1 %的檸檬酸三鈉溶液（60mg檸檬酸三鈉溶于6mL超純水），同時以200r/ min的轉(zhuǎn)速攪拌，此時溶液慢慢由透明變淡棕色，反應(yīng)25min后得到灰綠色液體；待室溫冷 卻后，將上述適量銀膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入適量 超純水，用超聲振蕩混勻，銀膠經(jīng)多次提純后，避光保存； 金納米增強基底采用檸檬酸三鈉加熱還原法制備得到，按照下述步驟進行：將一定濃 度的高氯金酸溶液（l〇mg高氯金酸溶于100mL超純水中）倒入三口燒瓶中，放在恒溫磁 力攪拌器上，溫度控制在120°C恒定加熱至沸騰后，迅速加入一定濃度的檸檬酸三鈉溶液 (20mg朽 1檬酸三鈉溶于4mL超純水），同時以100r/min的轉(zhuǎn)速快速攪拌；制備的金溶膠顏色 為酒紅色；待溶液冷卻后，避光保存。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法，其 特征在于其中步驟（2)建立各種農(nóng)藥標準品的表面增強拉曼譜圖，并對其進行譜峰歸屬和 解析；按照下述步驟進行：稱取20mg農(nóng)藥標準品，放于200mL的容量瓶中，用有機溶劑定容 到刻度，用超聲振蕩溶解，制成濃度為l〇〇mg/L的標準品母液；將母液稀釋成一定濃度的標 準溶液，取稀釋的標準溶液20 μ L、步驟（1)制備的500 μ L增強基底溶液和100 μ L質(zhì)量濃 度為1%氯化鈉溶液混合均勻，用于拉曼光譜檢測，對農(nóng)藥分子的官能團特征振動頻率進行 譜峰歸屬和解析，得到各農(nóng)藥分子的特征譜峰，這些特征譜峰作為柑桔中該農(nóng)藥殘留的定 性定量判別依據(jù)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法， 其特征在于所述步驟（3)的萃取方法為：待測柑桔樣品經(jīng)搗碎后，稱取10g搗碎樣品放于 50mL離心管中，向離心管中依次加入10mL乙腈、4g無水硫酸鎂和lg氯化鈉，搖勻后在渦旋 混合器上以400r/min的轉(zhuǎn)速渦旋混合2min，再將此離心管放入離心機中，以4200r/min的 轉(zhuǎn)速離心5min，此時上清液為黃色。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑桔中痕量農(nóng)藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法，其 特征在于所述步驟（4)的凈化方法為：在15mL離心管中，分別加入600mg無水硫酸鎂、60mg N-丙基乙二胺、60mg (318和2〇11^石墨化碳，取步驟⑶的4mL萃取液加入此離心管中，搖勻 后在400r/min的潤旋混合器上混合2min后，再將此離心管放入離心機以4200r/min的轉(zhuǎn) 速離心5min，得到無色上清液。
【文檔編號】G01N1/28GK104101591SQ201410354024
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】陳金印, 劉木華, 吳瑞梅, 王曉彬, 李俊杰, 藺磊, 范苑 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)