本發(fā)明屬于食品快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用拉曼光譜技術(shù)準(zhǔn)確、快速鑒定地溝油的方法。

背景技術(shù)：

地溝油：一般指各類廢棄的劣質(zhì)食用油，主要是餐廚廢油脂，經(jīng)過過濾、蒸餾、脫色而提煉后產(chǎn)出的油。殘留數(shù)量不等的有毒有害成分，長期或大量食用對人體健康極為有害。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年多達(dá)300萬噸的地溝油流向國人餐桌，因此地溝油的鑒別方法及指標(biāo)也被國人廣泛關(guān)注。地溝油在國內(nèi)長期存在的原因，一方面是高額的利潤回報(bào)，地溝油比正常的食用油一頓要多收益近2000元。另一方面是缺乏準(zhǔn)確、有效的地溝油鑒定技術(shù)，目前，針對地溝油中存在的有毒有害物質(zhì)進(jìn)行鑒別已開展了大量的探索性工作，建立了以膽固醇及脂肪酸組成分析、電導(dǎo)率、外來污染物的檢測(脂肪酸、膽固醇、苯并芘、多環(huán)芳烴、塑化劑、黃曲霉毒素)等鑒別地溝油的方法。如專利201110131492.4報(bào)道的使用gc-ms對有機(jī)酸進(jìn)行檢測，專利201110333314.x利用gc-ms對高級脂肪酸進(jìn)行檢測，專利201510365203.5對膽固醇進(jìn)行檢測。以上報(bào)道大都使用大型的色譜儀器進(jìn)行檢測，不適合快速篩查，而且上述指標(biāo)在正常食用油里均存在，上述指標(biāo)只能決定油品品質(zhì)好壞、是否達(dá)到正常的食用標(biāo)準(zhǔn)，因此即使是某一項(xiàng)或幾項(xiàng)超標(biāo)，有可能是在原料煉制或存儲過程中引入的外源性污染，并不能作為地溝油的定性標(biāo)準(zhǔn)。因此，地溝油的定性檢測手段一直是分析化學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。

辣椒堿是引起辣味的主要化學(xué)成分，主要存在于辣椒中，而辣椒是飲食中常用的調(diào)料品，地溝油中必然含有辣椒堿。2012年，大連化物所陳吉平和重慶市公安局物證鑒定中心張忠課題組分別用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了食用油(正常植物油或地溝油，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(journalofchromatographybanalyticaltechnologiesinthebiomedical&lifesciences,2016,1021:137.)，只要檢測的食用油里面含有辣椒堿，即可定性為地溝油)中3種微量辣椒堿(天然辣椒素、二氫辣椒素及丁香酚)的檢測方法(液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法檢測食用油中辣椒堿類化合物[j].化學(xué)試劑,2016,38(6)：491-495；固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測食用油和地溝油中辣椒素和二氫辣椒素[j].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(6)：777-782；)。用該法對國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估中心提供的67個(gè)盲樣進(jìn)行了分析，結(jié)果表明辣椒堿是一個(gè)良好的地溝油特征指示物。憑借這3種辣椒堿指標(biāo)，陽性樣品正確識別率達(dá)到75％，陰性樣品正確識別率達(dá)到100％。目前本方法已經(jīng)成為國家衛(wèi)生部最新公布的4種地溝油儀器檢測方法之一(張忠，任飛，張盼。液-液萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定“地溝油”中辣椒堿類化合物及丁香酚[j].色譜,2012,30(11)：1108-1112)。

但液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)畢竟為大型儀器，價(jià)格昂貴，不適合現(xiàn)場快速檢測，而且單靠在實(shí)驗(yàn)室里用認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測是難于及時(shí)、全面的來監(jiān)控食品和環(huán)境的安全現(xiàn)狀，因此，需要有一種快速的檢測手段來準(zhǔn)確的定性油品中的辣椒堿。表面增強(qiáng)拉曼散射(surfaceenhancedramanscattering,sers)技術(shù)是納米材料與拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合的有效產(chǎn)物，是現(xiàn)代檢測中一項(xiàng)很重要的光譜技術(shù)，其檢出能力可達(dá)到單分子水平，尤其在非法添加物的現(xiàn)場快速、痕量物質(zhì)的定性檢測方面越來越受到人們的關(guān)注。以其極高的靈敏度等優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物分析以及臨床醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域，如能實(shí)現(xiàn)sers技術(shù)用于辣椒堿的指紋識別，將實(shí)現(xiàn)地溝油的現(xiàn)場快速精準(zhǔn)鑒定。

傳統(tǒng)檢測項(xiàng)目包括黃曲霉素、重金屬、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、脂肪酸分布等，因植物油在煉制或存儲的過程中也會引入上述物質(zhì)，故上述物質(zhì)的檢測或超標(biāo)不足以說明其為地溝油，只能說明植物油不合格。因此，針對這些目標(biāo)物的檢測對地溝油定性不準(zhǔn)確；另外，檢測方法多使用大型儀器，前處理復(fù)雜，檢測成本高，測試周期長：如利用hplc-ms對一些無機(jī)鹽、脂肪酸、辣椒堿等進(jìn)行檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種利用拉曼光譜技術(shù)準(zhǔn)確、快速鑒定地溝油的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：其步驟為：

量取2～5ml需要檢測的食用油，加入兩倍體積的萃取試劑a，渦旋5～10min后磁輔助分離，從而從食用油中萃取出天然辣椒堿(cas號：404-86-4；分子式：c18h27no3；分子量：305.41)；再用2～5ml甲醇解析所萃取出的天然辣椒堿，得到甲醇萃取液；然后將該甲醇萃取液加入到等體積的衍生化溶液b中，室溫渦旋反應(yīng)1～3min；最后加入與上述全部反應(yīng)溶液等體積的sers增強(qiáng)試劑c，室溫渦旋反應(yīng)1～3min后進(jìn)行sers檢測；如果sers譜圖中出現(xiàn)天然辣椒堿的特征峰，則表明所檢測的食用油為地溝油。

地溝油中辣椒堿的萃?。阂虻販嫌椭欣苯穳A無法直接進(jìn)行顯色，因此，顯色前需將辣椒堿與地溝油進(jìn)行分離。為了選擇一個(gè)簡單快速的前處理方法，并與后續(xù)的衍生化反應(yīng)相匹配，本發(fā)明采用磁固相萃取的方式進(jìn)行，磁固相萃取采用氨基功能化四氧化三鐵磁性微球，其制備過程如下：

(1)首先采用溶劑熱法制備四氧化三鐵磁性微球：2.7g六水三氯化鐵和7.2g乙酸鈉溶解到80ml乙二醇中，水浴60℃、磁力攪拌30min，當(dāng)溶液轉(zhuǎn)化成黑褐色時(shí)，將溶液全部轉(zhuǎn)移到100ml的聚四氟高壓反應(yīng)釜中于馬弗爐中200℃反應(yīng)8h，獲得的黑色反應(yīng)溶液用乙醇、水交替清洗3～5次，60℃干燥12h，得到四氧化三鐵磁性微球；

(2)用氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)對四氧化三鐵磁性微球表面進(jìn)行氨基化改性，過程如下：將0.1g四氧化三鐵磁性微球溶解在無水乙醇和水的混合溶液中(體積比為80：20)，再加入1.0ml濃氨水(28wt％)，接著分別加入67μl正硅酸乙酯和67μl氨丙基三乙氧基硅烷，水浴35℃、機(jī)械攪拌3h，得到氨基功能化四氧化三鐵磁性微球(fe3o4@nh2)，清洗干燥后分散于甲苯中配置成濃度為10mg/ml的溶液，即為萃取試劑a；

(3)配制衍生化溶液b：將衍生化試劑溶于0.2m的鹽酸水溶液，配制成濃度為1～50mm的衍生化試劑溶液；將亞硝酸鈉溶于水，配制成質(zhì)量濃度為0.01～1.0％的亞硝酸鈉水溶液；將碳酸鈉溶于水，配制成質(zhì)量濃度為0.01～5％的碳酸鈉水溶液；衍生化試劑為苯胺類物質(zhì)，如2-5-二氨基苯磺酸、2-5-二氨基二磺酸基聯(lián)苯、4-氨基萘磺酸-水合物、6-氨基萘磺酸、二苯胺磺酸鈉、對氨基苯磺酸中的一種，亞硝酸鈉、碳酸鈉作為輔助衍生化試劑；將上述三種溶液等體積混合，得到衍生化溶液b；

(4)sers增強(qiáng)試劑c的制備：sers增強(qiáng)試劑采用金溶膠或銀溶膠，二者均采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％檸檬酸鈉水溶液還原的方式，具體制備過程參考文獻(xiàn)：j.phys.chem.1982,86：17(17),3391-3395，制備后的銀、金溶膠水溶液可直接作為增強(qiáng)試劑。

sers基底對油品中辣椒堿的檢測方法學(xué)的研究：雖然sers技術(shù)在定量檢測方面存在局限性(重復(fù)性差)，但以辣椒堿作為外源性標(biāo)記物對地溝油進(jìn)行鑒定只需對辣椒堿進(jìn)行定性檢出即可，無需定量。因此，可以利用上述提取方法和衍生化技術(shù)，分別對地溝油中辣椒堿進(jìn)行濃度檢測并確定辣椒堿在地溝油中的最低檢出濃度。

有益效果：本發(fā)明提供的地溝油檢測方法，因正常食用油中不含有辣椒堿類物質(zhì)，利用拉曼光譜儀通過增強(qiáng)試劑對油品中的辣椒堿進(jìn)行檢出，可對地溝油進(jìn)行鑒定，該檢測方法操作簡便，靈敏度高，可有效監(jiān)控地溝油。

本發(fā)明主要解決了現(xiàn)有地溝油鑒別方法中存在的兩個(gè)問題，一是現(xiàn)有方法檢測目標(biāo)物作為地溝油的定性不準(zhǔn)確，假陰性、假陽性概率較大。二是現(xiàn)有準(zhǔn)確定性地溝油的方法所使用的儀器是hplc-ms，儀器昂貴、分析周期較長，不適合快速篩查。本發(fā)明地溝油的鑒別方法主要是針對辣椒堿可以作為準(zhǔn)確鑒定地溝油的特征分子：只要檢出油品中含有辣椒堿，即可定性為地溝油?；诒砻嬖鰪?qiáng)共振拉曼散射(serrs)原理，利用小型便攜式拉曼光譜儀、分子的衍生化，通過使用增強(qiáng)試劑，對地溝油的特征分子辣椒堿進(jìn)行檢測。該方法可實(shí)現(xiàn)辣椒堿的超靈敏檢測，檢測限可達(dá)到1.0×10^-9m，該方法為地溝油的鑒定提供了一種簡單、快速、超靈敏的分析方法，具有目標(biāo)物明確，特征性強(qiáng)，定性準(zhǔn)確，操作簡單，適用于快速檢測等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為天然辣椒堿衍生化產(chǎn)物的sers譜圖；

圖2為四種酚類衍生物的sers譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1：

sers增強(qiáng)試劑的制備：將27mgagno3溶解到150ml超純水中，煮沸后快速加入3.0ml、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的檸檬酸鈉水溶液，加熱至回流，并保持10min，之后降溫至到80℃反應(yīng)40min，自然冷卻至室溫，得到作為sers增強(qiáng)試劑的銀溶膠；

地溝油中的辣椒堿的檢測采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加標(biāo)的形式，即在合格的食用油中加入天然辣椒堿的方法來模擬檢測的食用油(即地溝油)，天然辣椒堿購于阿拉丁試劑(cas號：404-86-4；分子式：c18h27no3；分子量：305.41)，天然辣椒堿的結(jié)構(gòu)式如下式所示。加標(biāo)的具體操作步驟為：利用分析天平取0.0305g天然辣椒堿溶于1ml甲醇中，隨后加入到99ml大豆油中配置成10^-3m的辣椒堿母液。之后對上述母液用大豆油進(jìn)行逐級稀釋，分別稀釋成10^-5m、10^-6m、10^-7m、10^-8m和10^-9m五個(gè)濃度的辣椒堿待測溶液，準(zhǔn)確量取上述不同濃度加標(biāo)油樣2ml，分別加入兩倍體積的萃取試劑a，渦旋5min后磁輔助分離出萃取材料，用2ml甲醇解析所萃取的天然辣椒堿，得到甲醇萃取液用于衍生化反應(yīng)。

辣椒堿的衍生化和sers檢測：以2,5-二氨基二磺酸基聯(lián)苯為偶氮類衍生化試劑、亞硝酸鈉水溶液和碳酸鈉水溶液為輔助的衍生化試劑對天然辣椒堿進(jìn)行衍生化反應(yīng)。2,5-二氨基二磺酸基聯(lián)苯鹽酸水溶液的濃度為20mm(鹽酸水溶液的濃度為0.2m)、亞硝酸鈉和碳酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均是1％，將甲醇萃取液600μl、2,5-二氨基二磺酸基聯(lián)苯水溶液200μl、亞硝酸鈉水溶液200μl、碳酸鈉水溶液200μl分別加入2ml的離心管中，室溫手動(dòng)渦旋反應(yīng)1min后用于sers檢測。

sers檢測過程如下：衍生化后的溶液500μl與同體積的增強(qiáng)試劑c混合后渦旋1min，直接用于拉曼光譜進(jìn)行檢測，檢測條件：美國必達(dá)泰克，型號：btr-111mini；激光器波長為532nm，功率為3mw，積分時(shí)間為5s，積分次數(shù)為1次。天然辣椒堿進(jìn)行衍生化反應(yīng)的原理如下式所示。

油品中辣椒堿的檢測方法學(xué)研究：

靈敏性：上述10^-9～10^-5m五個(gè)濃度的天然辣椒堿經(jīng)過萃取、衍生化反應(yīng)、拉曼檢測得到的譜圖見圖1，以1361cm^-1處的強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，利用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合公式為：(y為1361cm^-1處的強(qiáng)度，x為濃度的對數(shù))。從圖1可以看出，辣椒堿衍生物的特征峰分別為：1191、1361、1429、1574和1606cm^-1，分別歸屬于辣椒堿衍生物的υ(c-c)(芳環(huán))、δ(c-h)、ν(n＝n)、ν(c＝c)(苯環(huán))和υ(c–n)的拉曼振動(dòng)峰。從圖1可以看出，辣椒堿最低檢測濃度可以檢測到10^-9m。

最低檢出濃度陽性檢出率：為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的適用性，我們對市場上采購的三種(金龍魚大豆油兩個(gè)(廠家：益海嘉里投資有限公司)、金龍魚葵花籽油兩個(gè)(廠家：益海嘉里投資有限公司)、多力調(diào)和油兩個(gè)(廠家：佳格投資有限公司))、六個(gè)植物油同樣采用加標(biāo)的方法進(jìn)行檢測，六個(gè)10ml植物油樣品中分別加入100μl的10^-6m天然辣椒堿(cas號：404-86-4；分子式：c18h27no3；分子量：305.41)油樣配置成含有10^-8m辣椒堿的植物油，按照上文描述的萃取條件和衍生化方法進(jìn)行樣品前處理和衍生化反應(yīng)，之后利用便攜式拉曼光譜儀對樣品進(jìn)行檢測，六個(gè)樣品中全部檢測出辣椒堿的sers信號，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得出檢出濃度和加標(biāo)回收率(測量值/加標(biāo)值×100％)如表1所示。

表1實(shí)際樣品檢測結(jié)果

干擾性試驗(yàn)：該衍生化方法對大部分酚類物質(zhì)均能發(fā)生衍生化反應(yīng)，而植物油或地溝油在煉制、存儲、使用過程中會引入其他的酚類等污染物質(zhì)，因此對植物油中可能存在的不同來源的酚類干擾物質(zhì)進(jìn)行干擾性實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研(jagrfoodchem2014,62(46),11130-11137；jagrfoodchem2013,61(44),10467-10475；jfoodsci2014,79(6),t1225-t1230)，植物油中主要存在三種酚類化合物可能會對辣椒堿的測定產(chǎn)生干擾：叔丁基對苯二酚、dl-α-生育酚和雙酚a，三種干擾性物質(zhì)的檢測方法也采用加標(biāo)的形式：加標(biāo)方式同天然辣椒堿的加標(biāo)方式一樣，加標(biāo)濃度為10^-5m。測試過程同天然辣椒堿一樣，測試結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示，三種物質(zhì)并沒有對天然辣椒堿的檢測帶來干擾，該方法對天然辣椒堿具有很好的選擇性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，在此基礎(chǔ)上使用拉曼光譜儀對地溝油的鑒定還可以做出若干技術(shù)改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。