檢測稀有循環(huán)細胞內多種信號轉導分子的基于抗體的陣列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于檢測稀有循環(huán)細胞內眾多信號轉導分子的活化狀態(tài)和/或總量的基于抗體的陣列以及使用該陣列來幫助癌癥預后和診斷及設計個性化、定向治療的方法。
【專利說明】檢測稀有循環(huán)細胞內多種信號轉導分子的基于抗體的陣列
[0001]本申請是申請日為2007年9月20日、發(fā)明名稱為“檢測稀有循環(huán)細胞內多種信號轉導分子的基于抗體的陣列”的中國專利申請200780042849.3(國際申請?zhí)朠CT/US2007/079002)的分案申請。
[0002]相關申請的交叉引用
[0003]本申請要求2006/9/21提交的美國專利申請?zhí)?1/525，598 (該申請已變?yōu)槊绹R時專利申請N0._)和2007/8/20提交的美國臨時申請?zhí)?0/913,087的優(yōu)先權，出于所有目的將它們的內容通過引用全文納入本文。
[0004]發(fā)明背景
[0005]經(jīng)常在癌癥不同早期階段的患者血液內發(fā)現(xiàn)“微小轉移”腫瘤細胞(散布腫瘤細胞)，在轉移癌中也有發(fā)現(xiàn)。血液中腫瘤細胞的數(shù)目取決于腫瘤的階段和類型。腫瘤是極其異質性的。因此，單個部位的活檢樣品可能無法代表腫瘤群的異質性?；顧z樣品通常從原發(fā)性腫瘤上獲得；然而，無法對大多數(shù)轉移瘤進行活檢，從而更難于對腫瘤樣品進行分子分析。
[0006]在腫瘤轉移期間，最具攻擊性的腫瘤細胞離開原發(fā)性腫瘤并經(jīng)血液和淋巴系統(tǒng)到達遠端位置。因此,血液中的循環(huán)腫瘤細胞是腫瘤細胞中最具攻擊性和同質性的群體。每毫升血液中轉移腫瘤細胞的數(shù)目可從一個到幾千個。因此，需要特異且靈敏的方法為診斷和預后目的來檢測這些細胞。本發(fā)明滿足了這一需要并提供了有關優(yōu)點。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明提供了用于檢測稀有循環(huán)細胞內眾多信號轉導分子的活化狀態(tài)和/或總量的基于抗體的陣列以及其用法，其優(yōu)點在于具有酶聯(lián)免疫吸附試驗的特異性、信號放大的靈敏性以及微陣列的高通量多重性。
[0009]一方面，本發(fā)明提供了一種具有高動態(tài)范圍(super1r dynamic range)的陣列，其包含細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上。
[0010]另一方面，本發(fā)明提供了一種進行具有高動態(tài)范圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括:
[0011](a)將細胞提取物與該細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上；
[0012](b)將該眾多捕獲分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物；
[0013](C)將該眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第一和第二成員一起培育以產(chǎn)生放大信號；和
[0014](d)檢測由信號放大對的第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
[0015]在還有另一方面，本發(fā)明提供了一種進行具有高動態(tài)范圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括:
[0016](a)將細胞提取物與該細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上；
[0017](b)將該眾多捕獲分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物，其中該檢測抗體包含:
[0018](I)眾多用易化部分(facilitating moiety)標記的活化狀態(tài)非依賴性抗體,和
[0019](2)眾多用信號放大對的第一成員標記的活化狀態(tài)依賴性抗體，
[0020]其中所述易化部分產(chǎn)生導向信號放大對的第一成員并與其反應的氧化劑；
[0021](C)將眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第二成員一起培育以產(chǎn)生放大信號；和
[0022](d)檢測由該信號放大對的第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
[0023]本發(fā)明還提供了進行上述基于抗體的陣列方法的試劑盒，其包含:(a)局限在固相支持體上的眾多捕獲抗體的稀釋系列；和(b)眾多檢測抗體。該試劑盒還任選包含諸如信號放大對的第一和第二成員等其他試劑。
[0024]通過以下詳述和附圖，本領域技術人員能明白本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點。
[0025]附圖簡述
[0026]圖1顯示了特異性結合于活化分析物的三個抗體。
[0027]圖2顯示了試驗過程，其中已經(jīng)特異性結合于活化分析物的標記的抗體局限在固相支持體上。
[0028]圖3顯示了在ELISA中用抗EGFR胞外域單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體檢測A431細胞中的總EGFR。(a)夾心ELISA標準曲線。采用人EGFR重組胞外域的靈敏度為約0.25pg/孔。(b)細胞滴定曲線。A431細胞內的EGFR濃度通過ELISA檢測。(c)以pg/孔和Pg/細胞計算出的總EGFR濃度。計算出的各A431細胞內的EGFR濃度為約0.6pg。
[0029]圖4顯示了在ELISA中用抗EGFR胞外域的單克隆抗體作為捕獲抗體和抗磷酸化EGFR的生物素-標記的單克隆抗體作為檢測抗體檢測A431細胞中的磷酸化EGFR。(a)采用捕獲抗體稀釋系列獲得的細胞滴定曲線。(b)細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.0625微克/毫升時單細胞水平的信/噪比為1.78。
[0030]圖5顯示了在ELISA中用抗ErbB2胞外域單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體檢測SKBr3細胞中的總ErbB2。(a) SKBr3細胞中總ErBb2的細胞滴定。檢測范圍介于約1，000個細胞至約1.37個細胞。(b)細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為I微克/毫升時1.37細胞水平的信/噪比為2.71。
[0031]圖6顯示了在ELISA中用抗ErbB2胞外域的單克隆抗體作為捕獲抗體和抗磷酸化ErbB2的單克隆抗體作為檢測抗體檢測SKBr3細胞中的磷酸化ErBb2。(a) SKBr3細胞中磷酸化ErBb2的細胞滴定。檢測范圍介于約500個細胞至約5個細胞。(b)細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為I微克/毫升時5細胞水平的信/噪比為3.03。
[0032]圖7顯示了在ELISA中用抗Erk2單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體檢測SKBr3細胞中總的和磷酸化的Erk2蛋白。(a)用抗Erk2單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體檢測總的Erk2蛋白。(b)用抗Erk2單克隆抗體作為捕獲抗體和抗磷酸化Erk2單克隆抗體作為檢測抗體檢測磷酸化Erk2蛋白。(c)細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。在1.37細胞水平時總的和磷酸化的Erk2的信/噪比約為3。
[0033]圖8顯示了在微陣列ELISA中用抗EGFR胞外域單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體檢測A431細胞中的總EGFR。(a)基于細胞數(shù)的捕獲抗體稀釋曲線。微陣列ELISA具有寬動態(tài)范圍，可用稀釋系列中各種捕獲抗體濃度檢測約1-10，000個細胞內的EGFR。(b)基于捕獲抗體濃度稀釋系列的細胞滴定曲線，顯示可從一個細胞(箭頭)檢測EGFR。(c)稀釋系列中各種捕獲抗體濃度的細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.0625毫克/毫升時(箭頭)單細胞水平的信噪比為2.11。
[0034]圖9顯示了在微陣列ELISA中用抗EGFR胞外域的單克隆抗體作為捕獲抗體和抗磷酸化EGFR的單克隆抗體作為檢測抗體檢測A431細胞中的磷酸化EGFR。(a)基于細胞數(shù)的捕獲抗體稀釋曲線。微陣列ELISA具有寬動態(tài)范圍，可用稀釋系列中各種捕獲抗體濃度檢測約1-10，000個細胞內的磷酸化EGFR。(b)基于捕獲抗體濃度稀釋系列的細胞滴定曲線，顯示可從一個細胞檢測磷酸化EGFR。(c)稀釋系列中各種捕獲抗體濃度的細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.125毫克/毫升時(箭頭)單細胞水平的信噪比為1.33。
[0035]圖10顯示了在微陣列ELISA中用抗ErBb2胞外域單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體檢測SKBr3細胞中的總ErBb2。(a)基于細胞數(shù)的捕獲抗體稀釋曲線。微陣列ELISA具有寬動態(tài)范圍，可用稀釋系列中各種捕獲抗體濃度檢測約1-10,000個細胞內的ErBb2。
(b)基于捕獲抗體濃度稀釋系列的細胞滴定曲線，顯示可從一個細胞(箭頭)檢測ErBb2。
(c)稀釋系列中各種捕獲抗體濃度的細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.125毫克/毫升時(箭頭)單細胞水平的信噪比為15.27。
[0036]圖11顯示了在微陣列ELISA中用抗ErBb2胞外域的單克隆抗體作為捕獲抗體和抗磷酸化ErBb2的單克隆抗體作為檢測抗體檢測SKBr3細胞中的磷酸化ErBb2。(a)基于細胞數(shù)的捕獲抗體稀釋曲線。微陣列ELISA具有寬動態(tài)范圍，可用稀釋系列中各種捕獲抗體濃度檢測約1-10，000個細胞內的ErBb2。(b)基于捕獲抗體濃度稀釋系列的細胞滴定曲線，顯示可從一個細胞(箭頭)檢測磷酸化ErBb2。(c)稀釋系列中各種捕獲抗體濃度的細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.125毫克/毫升時(箭頭)單細胞水平的信噪比為5.45。
[0037]圖12顯不了相近雙檢測器(proximity dual detector)微陣列ELISA與單檢測器微陣列ELISA的靈敏度比較。A431細胞從10，000稀釋到0.01細胞。捕獲抗體從I毫克
/毫升連續(xù)稀釋到0.004毫克/毫升。
[0038]圖13顯示了單檢測器微陣列ELISA與相近雙檢測器微陣列ELISA的檢測特異性。(a)單檢測器模式下各種捕獲抗體濃度時A431細胞中磷酸化EGFR的滴定曲線。由于該模式下單個檢測抗體缺乏特異性因此觀察到非常高的背景。(b)相近雙檢測器模式下各種捕獲抗體濃度時A431細胞中磷酸化EGFR的滴定曲線。由于該模式下通過檢測兩個檢測抗體之間的相近性獲得了提高的特異性因此觀察了非常低的背景。
[0039]圖14顯示了采用捕獲抗體稀釋系列檢測眾多信號轉導分子活化狀態(tài)的可尋址微陣列模式的一個示例性實施方式。
[0040]圖15顯示了在受激A431細胞的滴定分析中檢測磷酸化Shc的水平。可尋址陣列同時提供EGFR和HER2磷酸化信息。
[0041]圖16顯示了抗-EGFR捕獲抗體的稀釋曲線。該試驗的動態(tài)范圍大于5個log。每條單獨曲線的動態(tài)范圍約為2個log，當將6條提供信息曲線的信息組合時動態(tài)范圍顯著增加。
[0042]圖17顯示了本發(fā)明寡核苷酸偶聯(lián)的質量控制過程。(a)顯示了各種GO-寡核苷酸組分的微陣列點樣圖式。(b)Alexa647-寡核苷酸-偶聯(lián)的抗體對組分13-15中的GO-寡核昔酸具有最聞結合未和力。
[0043]圖18顯示了包含與葡萄糖氧化酶(GO)-寡核苷酸雜交的Alexa647_寡核苷酸-偶聯(lián)的抗-EGFR抗體、HRP-偶聯(lián)的抗-磷酸化EGFR抗體、以及局限在固相支持體上的EGFR捕獲抗體的多重磷酸化EGFR復合體的形成。
[0044]圖19顯示了同時檢測總EGFR和磷酸化EGFR。(a) 10，000個細胞中的總EGFR通過Alexa647-寡核苷酸-偶聯(lián)的抗-EGFR抗體生成的Alexa647信號來檢測。EGFR磷酸化程度通過監(jiān)測酪酰胺(tyramide)-介導的放大的Alexa555信號來檢測。(b)總EGFR(t-EGFR)通過僅有10個細胞的直接結合試驗來檢測，磷酸化EGFR(p-EGFR)從I個細胞檢測。10e5p-EGFR分子采用相近信號放大法(proximity signal amplificat1n method)檢測。采用該相近試驗模式使得P-EGFR的檢出限提高100倍以上。
[0045]發(fā)明詳述
[0046]介紹
[0047]本發(fā)明提供了用基于抗體的陣列試驗系統(tǒng)檢測稀有循環(huán)細胞內眾多信號轉導分子的活化狀態(tài)和/或總量的方法。一些實施方式中，本發(fā)明的多重、高通量免疫測定可在單個細胞水平上檢測實體瘤循環(huán)細胞內一種或多種信號轉導分子的活化狀態(tài)。事實上，信號轉導分子如EGFR的檢測靈敏度約為100則摩爾(zeptomole，10_21摩爾)，線性動態(tài)范圍介于約100則摩爾至約100毫微微摩爾(femtomole)。如此，單細胞檢測稀有循環(huán)細胞中多重信號轉導分子活化狀態(tài)有助于癌癥預后和診斷以及個性化定向治療的設計。
[0048]稀有循環(huán)細胞包括從實體瘤轉移或微轉移的實體瘤的循環(huán)細胞。循環(huán)腫瘤細胞、癌癥干細胞以及移行到腫瘤的細胞(例如，由于化學吸引(chemoattract1n))如循環(huán)內皮祖細胞、循環(huán)內上皮細胞、循環(huán)前血管生成(pro-ang1genic)骨髓細胞，以及循環(huán)樹突細胞是實體瘤循環(huán)細胞的一些例子。
[0049]感興趣的信號轉導分子通常在分離循環(huán)細胞后不久被提取以保持它們的原位活化狀態(tài)，優(yōu)選在約24、6或I小時內，更優(yōu)選在約30、15或5分鐘內。分離細胞也可與一種或多種通常為納摩爾至微摩爾濃度的生長因子一起培育約1-30分鐘以回復或刺激信號轉導分子的活化(參見，例如，Irish等，Cell，118:217-228 (2004))。
[0050]如文中更加詳細的解釋，為評價用于個體患者的潛在抗癌療法，可將分離細胞與一種或多種不同劑量的抗癌藥一起培育。然后可用生長因子刺激數(shù)分鐘(例如，約1-5分鐘)或數(shù)小時(例如，約1-6小時)。有或沒有抗癌藥時信號傳導途徑的差異激活能夠幫助選擇對于各個體患者的合適劑量的合適癌癥療法。循環(huán)細胞也可在抗癌藥治療或用一種或多種生長因子刺激期間從患者樣品分離，以便確定是否需要對療法進行改進。如此，本發(fā)明方法能有利地幫助臨床醫(yī)生為每名患者在正確的時間提供正確劑量的正確抗癌藥。
[0051]定義
[0052]在本文中，除非另有說明，以下術語具有它們自己的含義。
[0053]術語“癌癥”意指包括以異常細胞非受控生長為特征的一類疾病的任何成員。該術語包括所有已知的癌癥和腫瘤癥狀，無論其定性為惡性、良性、軟組織性或實體性，以及包括轉移前和轉移后癌癥在內的所有階段和等級的癌癥。不同癌癥類型的例子包括但不限于:肺癌(例如，非小細胞肺癌)；消化道和胃腸道癌癥如結腸直腸癌、胃腸道間質瘤、胃腸道類癌瘤、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膽管癌、小腸癌和胃癌;食管癌;膽囊癌；肝癌；胰腺癌；闌尾癌；乳腺癌；卵巢癌；腎癌(例如，腎細胞癌)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥；皮膚癌；淋巴瘤；絨毛膜癌；頭頸癌；骨原性肉瘤；和血癌。文中，“腫瘤”包含一種或多種癌性細胞。
[0054]術語〃分析物〃包括任何感興趣的分子，通常是大分子如多肽，其存在、含量和/或同一性是確定的。某些情況下，分析物是實體瘤循環(huán)細胞的細胞組分，優(yōu)選信號轉導分子。
[0055]文中，術語〃稀釋系列〃意指包括一系列遞減濃度的特定樣品(例如，細胞裂解液)或試劑(例如，抗體)。制備稀釋系列時通常將測定量的起始濃度的樣品或試劑與稀釋劑(例如，稀釋緩沖液)混合以形成較低濃度的樣品或試劑，并重復該過程足夠次數(shù)以獲得所需數(shù)量的連續(xù)稀釋液。樣品或試劑可以至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、
45、50、100、500 或 1000-倍連續(xù)稀釋以制得包含至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個遞減濃度的樣品或試劑的稀釋系列。例如，為制造包含起始濃度為I毫克/毫升的捕獲抗體試劑2-倍連續(xù)稀釋的稀釋系列，可將一定量起始濃度的捕獲抗體與等量稀釋緩沖液混合以得到濃度為0.5毫克/毫升的捕獲抗體，并重復該過程以獲得濃度為0.25暈克/暈升、0.125暈克/暈升、0.0625暈克/暈升、0.0325毫克/毫升等的捕獲抗體。
[0056]術語〃高動態(tài)范圍〃在文中指本發(fā)明的試驗檢測少達一個細胞或多達數(shù)千細胞的特定分析物的能力。例如，本文所述免疫測定能采用捕獲抗體濃度的稀釋系列來有利地檢測約 1-10,000 個細胞(例如，約 1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500或10，000個細胞)中的感興趣的特定信號轉導分子，因此具有高動態(tài)范圍。
[0057]術語〃信號轉導分子〃或〃信號轉導分子〃包括能執(zhí)行某過程的蛋白質或其他分子，通過該過程細胞能將胞外信號或刺激轉換成某反應，通常涉及細胞內有序的生化反應。信號轉導分子的例子包括但不限于:受體酪氨酸激酶如EGFR(例如，EGFR/HER1/ErbBl、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、VEGFR-l/FLT-1、VEGFR-2/FLK-l/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFR (例如，PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR (胰島素受體)、IGF-1R、IGF-1IR, IRR(胰島素受體相關受體)、CSF-1R、FGFR1-4、HGFR1-2、CCK4、TRKA-C、MET、RON、EPHA1-8, EPHB1-6, AXL, MER、TYR03、TIE1-2、TEK, RYK, DDR1-2、RET、c_R0S、LTK(白細胞酪氨酸激酶)、ALK(間變性淋巴瘤激酶)、R0R1-2、MUSK、AATYK1-3和RTK106 ；非受體酪氨酸激酶如 BCR-ABL、Src> Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak> Jak> Ack 和LIMK ;酪氨酸激酶信號傳導級聯(lián)組分如 Akt、MAPK/ERK、MEK、RAF、PLA2、MEKK, JNKK, JNK,p38、She (p66)、PI3K、Ras (例如，K-Ras, N-Ras, H-Ras)、Rh。、Racl、Cdc42、PLC、PKC, p70S6激酶、p53、細胞周期蛋白 Dl、STATl、STAT3、PIP2、PIP3、PDK、mT0R、BAD、p21、p27、R0CK、IP3、TSP-1、NOS、PTEN、RSK1-3、JNK, c_Jun、Rb、CREB, Κ?67 和樁蛋白；以及它們的組合。
[0058]文中，術語〃循環(huán)細胞〃包括已經(jīng)從實體瘤轉移或微轉移的細胞。循環(huán)細胞的例子包括但不限于:循環(huán)腫瘤細胞，癌癥干細胞，和/或移行到腫瘤的細胞(例如，循環(huán)內皮祖細胞，循環(huán)內皮細胞，循環(huán)前血管生成骨髓細胞，循環(huán)樹突細胞，等等)。
[0059]術語〃樣品〃在文中包括從患者獲得的任何生物標本。樣品包括但不限于:全血，血漿，血清，紅血細胞，白血細胞(例如，外周血單核的細胞)，唾液，尿液，糞便(即，排泄物)，痰液，支氣管灌洗液，淚液，乳頭抽吸物，淋巴液(例如，淋巴結的彌散性腫瘤細胞)，細針抽吸物，任何其他體液，組織樣品(例如，腫瘤組織)如腫瘤活檢樣品(例如，針頭活檢樣品)，以及它們的細胞提取物。一些實施方式中，所述樣品是全血或其組成成分如血漿、血清或細胞團。在優(yōu)選實施方式中，所述樣品是采用本領域已知的任何技術從全血或其細胞組分分離實體瘤循環(huán)細胞并制備循環(huán)細胞的細胞提取物而獲得的。在其他實施方式中，所述樣品是，例如，來自肺、結腸或直腸的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)腫瘤組織樣品。
[0060]術語〃對象〃或〃患者〃通常包括人，但也包括其他動物，如其他靈長類、嚙齒類、犬類、貓類、馬類、羊類、豬類等等。
[0061 ] 〃陣列〃或〃微陣列〃包括固定或局限在固相支持體上的捕獲抗體的不同組和/或稀釋系列，所述固相支持體例如玻璃(例如，玻璃載玻片)、塑料、芯片、針、濾器、珠(例如，磁珠，聚苯乙烯珠，等等)、紙、膜(例如，尼龍、硝酸纖維素，聚偏二氟乙烯(PVDF)等等)、纖維束或任何其他合適基材。捕獲抗體通常通過共價或非共價相互作用(例如，離子鍵、疏水相互作用、氫鍵、范德華力、偶極-偶極鍵)固定或局限在固相支持體上。某些情況下，捕獲抗體包含與結合于固相支持體的捕獲劑相互作用的捕獲標簽。用于本發(fā)明試驗的陣列通常包含偶聯(lián)于固相支持體表面不同的已知/可尋址位點的眾多不同的捕獲抗體和/或捕獲抗體濃度。
[0062]術語〃捕獲抗體〃意指包括對樣品中的一種或多種感興趣分析物如實體瘤循環(huán)細胞的細胞提取物具有特異性(即，結合、被結合或與之形成復合體)的固定抗體。在優(yōu)選實施方式中，所述捕獲抗體局限在陣列的固相支持體上。將任何一種信號轉導分子固定在固相支持體上的合適捕獲抗體獲自加州特默庫拉的奧普斯特公司(Upstate, Temecula,CA)、加州卡瑪利奧的生物源公司(B1source, Camarillo, CA)、馬薩諸塞州丹維斯的細胞信號傳導技術公司(Cell Signaling Technologies (Danvers, MA)、明尼蘇達州明尼阿波利斯的R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems, Minneapolis, MN)、加州弗里蒙特的實驗室視覺公司(Lab Vis1n, Fremont, CA)、加州桑塔庫茲的桑塔庫茲生物技術公司(Santa CruzB1technology, Santa Cruz, CA)、密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma, St.Louis,MO)、以及加州圣何塞的BD生物科技公司(BD B1sciences, San Jose, CA)。
[0063]術語〃檢測抗體〃在文中包括包含對樣品中的一種或多種感興趣分析物具有特異性(即，結合、被結合或與之形成復合體)的可檢測標簽的抗體。該術語還包括對一種或多種感興趣分析物具有特異性的抗體，其中所述抗體可被包含可檢測標簽的其他種類結合。可檢測標簽的例子包括但不限于:生物素/鏈霉抗生物素蛋白標簽，核酸(例如，寡核苷酸)標簽，化學反應性標簽，熒光標簽，酶標簽，放射性標簽，以及它們的組合。用于檢測各種信號轉導分子中任何一種的活化狀態(tài)和/或總量的合適檢測抗體獲自加州特默庫拉的奧普斯特公司(Upstate, Temecula, CA)、加州卡瑪利奧的生物源公司(B1source, Camarillo, CA)、馬薩諸塞州丹維斯的細胞信號傳導技術公司(CellSignaling Technologies (Danvers, MA)、明尼蘇達州明尼阿波利斯的R&D系統(tǒng)公司(R&DSystems, Minneapolis, MN)、加州弗里蒙特的實驗室視覺公司(Lab Vis1n, Fremont, CA)、加州桑塔庫茲的桑塔庫茲生物技術公司(Santa Cruz B1technology, Santa Cruz,CA)、密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma, St.Louis,MO)、以及加州圣何塞的BD生物科技公司(BD B1sciences, San Jose, CA)。一個非限制性的例子是，抗 EGFR、c_KIT、c_Src、FLK-1、PDGFRA, PDGFRB, Akt、MAPK, PTEN、Raf和MEK之類各種磷酸化形式的信號轉導分子的磷酸特異性抗體獲自桑塔庫茲生物技術公司(Santa Cruz B1technology)。
[0064]術語〃活化狀態(tài)依賴性抗體〃包括對樣品中一種或多種感興趣分析物的特定活化狀態(tài)具有特異性(即，結合、被結合或與之形成復合體)的檢測抗體。在優(yōu)選實施方式中，所述活化狀態(tài)依賴性抗體檢測一種或多種分析物如一種或多種信號轉導分子的磷酸化、泛素化和/或復合狀態(tài)。一些實施方式中，受體酪氨酸激酶EGFR家族成員的磷酸化和/或EGFR家族成員之間異二聚復合體的形成用活化狀態(tài)依賴性抗體檢測。適合用活化狀態(tài)依賴性抗體檢測的活化狀態(tài)(在括號中列出)的非限制性例子包括:EGFR(EGFRvIII，磷酸化(p-)EGFR，EGFR:Shc，泛素化(u-)EGFR，p-EGFRvIII) ；ErbB2 (p85:截短的(Tr)-ErbB2, p-ErbB2, p85:Tr-p-ErbB2, Her2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR,ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4) ；ErbB3(p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc)；ErbB4(p-ErbB4, ErbB4:Shc) ；IGF-1R(p-1GF-lR, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-1RS, IGF-1R:PI3K) ；INSR(p-1NSR) ；KIT(p-KIT) ；FLT3(p-FLT3) ；HGFR1(p-HGFRl) ；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET) ；PDGFRa(p-PDGFRa) ；PDGFRP(p-PDGFRP) ；VEGFRl(p-VEGFRl, VEGFRl:PLC y,VEGFRl:Src) ；VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLC y , VEGFR2:Src, VEGFR2:硫酸肝素，VEGFR2:VE-鈣粘蛋白)；VEGFR3 (p-VEGFR3) ;FGFRI (p-FGFRI) ；FGFR2 (p-FGFR2) ；FGFR3 (p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4) ；Tiel (p-Tiel) ；Tie2(p-Tie2) ；EphA (p-EphA) ；EphB (p-EphB) ；NFKB 和 /或 IKB(p-1K(S32)，p-NFKB(S536)，p-P65:1KBa) ;Akt (p_Akt (T308，S473)) ；PTEN(p-PTEN)；Bad(p-Bad(S112, S136)，Bad:14-3-3) ；mTor(p-mTor(S2448)) ；p70S6K(p-p70S6K(T229,T389)) ；Mek(p-Mek(S217, S221)) ；Erk (p-Erk(T202, Y204)) ;Rsk_l (p-Rsk-1(T357，S363)) ；Jnk(p-Jnk(T183, Y185)) ；P38(p-P38 (T180, Y182)) ；Stat3(p-Stat-3 (Y705,S727)) ;Fak(p-Fak(Y576)) ；Rb(p-Rb(S249, T252, S780)) ；Ki67 ；p53 (p-p53(S392, S20))；CREB (p-CREB(S133)) ；c-Jun (p-c-Jun (S63)) ；cSrc (p-cSrc (Y416));以及樁蛋白(p_ 樁蛋白(Y118))。
[0065]術語〃活化狀態(tài)非依賴性抗體〃包括對樣品中一種或多種感興趣分析物具有特異性(即，結合、被結合或與之形成復合體)而不考慮它們的活化狀態(tài)的檢測抗體。例如，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體可檢測一種或多種分析物如一種或多種信號轉導分子的磷酸化和非磷酸化形式。
[0066]術語〃核酸〃或〃多核苷酸〃包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其單鏈或雙鏈形式的聚合物如DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷酸類似物或者修飾的主鏈殘基或連接鍵的核酸，它可以是合成的、天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的，并具有參比核酸的類似結合特性。這種類似物的例子包括但不限于:硫代磷酸酯，氨基磷酸酯(phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2’-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。除非特別限定，該術語包括具有參比核酸的類似結合特性的含有天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另有說明，具體的核酸序列還隱含包括其保守性修飾的變體和互補序列以及隱含表示的序列。
[0067]術語〃寡核苷酸〃指RNA、DNA、RNA/DNA雜交體和/或其模擬物的單鏈寡聚體或聚合體。某些情況下，寡核苷酸由天然產(chǎn)生的(即，未修飾的)核堿基、糖和核苷內(主鏈)連接鍵構成。在某些其他情況下，寡核苷酸包括修飾的核堿基、糖和/或核苷內連接鍵。
[0068]文中，術語〃錯配基序〃或〃錯配區(qū)〃指寡核苷酸中不與其互補序列100%互補的部分。寡核苷酸可有至少1、2、3、4、5、6或更多錯配區(qū)。錯配區(qū)可以是毗連的或隔開1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個核苷酸。所述錯配基序或錯配區(qū)可包含單個核苷酸或者可包含2、3、4、5或更多核苷酸。
[0069]短語"嚴格雜交條件"指寡核苷酸將與其互補序列但不與其他序列雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的并將在不同情況下有所不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。有關核酸雜交的更多指導可在Tijssen的《生物化學和分子生物學技術一核酸探針雜交》(Techniques in B1chemistry and Molecular B1logy—Hybridizat1nwith Nucleic Probes)，“雜交原則和核酸測定策略概述”(Overview of principles ofhybridizat1n and the strategy of nucleic acid assays) (1993)中找到。一般，選擇的嚴格條件是在規(guī)定的離子強度PH下比特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。Tm是平衡時有50%的與靶互補的探針與靶序列雜交的溫度(在規(guī)定的離子強度、pH和核酸濃度下)(當靶序列過量時，在Tm下有50%的探針在平衡時被占據(jù))。也可加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺來獲得嚴格條件。對于選擇性和/或特異性雜交，正信號至少是背景的2倍，優(yōu)選至少是背景雜交的10倍。
[0070]對于兩個或多個核酸，術語〃基本相同〃或“基本同一性”表示當采用序列比較算法或通過手工比對和目檢在比較窗或指定區(qū)域上比較和比對最大對應性時，這兩個或多個序列或亞序列是相同的或有規(guī)定比例的核苷酸是相同的(即，在特定區(qū)域上至少約60%，優(yōu)選至少約65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同)。當文中涉及該定義時還類似地表示序列互補物。優(yōu)選地，在長度至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100個核苷酸的區(qū)域上存在這種基本同一'I"生。
[0071]術語〃培育〃與“接觸”和“暴露”以相同含義使用，且不暗指任何具體的時間或溫度要求，如有說明除外。
[0072]實施方式的描述
[0073]本發(fā)明提供了用于檢測稀有循環(huán)細胞內眾多信號轉導分子的活化狀態(tài)和/或總量的基于抗體的陣列以及使用該陣列來幫助癌癥預后和診斷及設計個性化、定向治療的方法。
[0074]抗體陣列
[0075]一方面，本發(fā)明提供了一種具有高動態(tài)范圍的陣列，其包含對細胞提取物中一種或多種分析物具有特異性的捕獲抗體的眾多稀釋系列，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上。
[0076]一些實施方式中，所述細胞提取物包含實體瘤循環(huán)細胞提取物。所述循環(huán)細胞通常采用一種或多種分離方法從患者樣品分離，所述方法包括，例如，免疫磁分離(參見，例如，Racila 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 95:4589-4594 (1998) ；BiIkenroth 等，Int.J.Cancer, 92:577-582 (2001)),微流體分離(參見，例如，Mohamed 等，IEEE Trans.Nanob1sc1.，3:251-256 (2004) ；Lin 等，摘要編號 5147，第 97 屆 AACR 年會，華盛頓特區(qū)
(2006))，F(xiàn)ACS(參見，例如，Mancuso 等，Blood,97:3658-3661 (2001))，密度梯度離心(參見，例如，Baker 等，Clin.Cancer Res.，13:4865-4871 (2003))，以及耗竭法(參見，例如，Meye 等，Int.J.0ncol.,21:521-530 (2002))。
[0077]在其他實施方式中，所述患者樣品包含全血、血清、血漿、尿液、痰液、支氣管灌洗液、淚液、乳頭抽吸物、淋巴液、唾液和/或細針抽吸物樣品。在某些情況下，全血樣品被分離成血漿或血清部分以及細胞部分(即，細胞團)。所述細胞部分通常含有紅血細胞、白血細胞和/或實體瘤循環(huán)細胞如循環(huán)腫瘤細胞(CTC)、循環(huán)內皮細胞(CEC)、循環(huán)內皮祖細胞(CEPC)、癌癥干細胞(CSC)，以及它們的組合。所述血漿或血清部分通常含有核酸(例如，DNA、RNA)和由實體瘤循環(huán)細胞釋放的蛋白質。
[0078]一些情況下，分離的循環(huán)細胞在與感興趣的一種或多種抗癌藥一起培育之前、期間和/或之后可用一種或多種生長因子體外刺激。刺激性生長因子包括但不限于:表皮生長因子(EGF)，調蛋白(HRG)，TGF-α，PIGF，血管生成素(Ang)，NRGI, PGF，TNF-α，VEGF,PDGF, IGF, FGF, HGF，細胞因子，等等。其他情況下，例如在生長因子刺激和/或抗癌藥處理之后可用本領域已知的任何技術裂解分離的循環(huán)細胞以產(chǎn)生細胞提取物(例如，細胞裂解液)。優(yōu)選地，在生長因子刺激后約1-360分鐘之間開始細胞裂解，更優(yōu)選在兩個不同時間間隔進行裂解:(I)生長因子刺激后約1-5分鐘；和(2)生長因子刺激后約30-180分鐘之間?；蛘?，細胞裂解液可儲存于_80°C直至使用。
[0079]在某些實施方式中，所述抗癌藥包括抗-信號傳導劑(即，細胞生長抑制藥)如單克隆抗體或酪氨酸激酶抑制劑；抗增殖劑；化療劑(即，細胞毒藥物)；和/或能夠降低或消除異常細胞如癌性細胞不受控生長的任何其他化合物。一些實施方式中，聯(lián)用抗-信號傳導劑和/或抗增殖劑與一種或多種化療劑處理分離的循環(huán)細胞。
[0080]適用于本發(fā)明的抗-信號傳導劑的例子包括但不限于:單克隆抗體如曲妥單抗,ereeptlii?),阿侖單抗(Campatiie)?貝伐單抗(ATOstine),西妥昔單抗
(Erbttuxe),吉姆單抗(My1targ*8*) ? 帕木單抗(panitumumab) (Vectibix?)，
利妥昔單抗(Rltuxan?)和托西莫單抗(BEXXAR?);酪氨酸激酶抑制齊U如吉非替尼(gefitinib) (IreSSa?),舒尼替尼(sunitinib) (Slltent?),埃羅替尼
(erlotinib) (TarCCV:l_K)，拉帕替尼(Iapatinib) (GW-572016)，卡奈替尼(canertinib)(Cl 1033)，賽瑪西尼(semaxinib) (SU5416)，瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787/ZK222584)，索拉非尼(sorafenib) (BAY43-9006 ； Nexavar^ )，甲磺酸伊馬替尼(Gleevece)和來氟米特(SUlOl);以及它們的組合。
[0081]抗增殖劑的例子包括:mT0R抑制劑如西羅莫司(雷帕霉素)，坦西羅利瑪斯(temsirolimus) (CC1-779)和依維莫司(RAD001) ;Akt抑制劑如1L6-羥甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-0-甲基-3-0-十八烷基-sn-甘油碳酸酯，9-甲氧基-2-甲基乙酸玫瑰花堿(9-methoxy-2-methylellipticinium acetate), I, 3_二氫-1-(1-( (4_(6_苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹噁啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮，10-(4’-(N-二乙基氨基)丁基)-2_氯吩噁嗪，3-甲酰色酮縮氨硫脲(Cu(II)Cl2復合體)，AP1-2，衍生自原癌基因 TCLl 氨基酸 10-24 的 15 聚肽(Hiromura 等，J.B1l.Chem.，279:53407-53418 (2004)，KP372-1,和 Kozikowski 等，J.Am.Chem.Soc., 125:1144-1145(2003)和 Kau 等，CancerCell, 4:463-476(2003)所述的化合物；以及它們的組合。
[0082]化療劑的非限制性例子包括基于鉬的藥物(例如，奧沙利鉬，順鉬，卡鉬，螺鉬，異丙鉬，沙鉬等等)，烷基化劑(例如，環(huán)磷酰胺，異磷酰胺，苯丁酸氮芥，白消安，美法侖，氮芥，烏拉莫司汀，塞替派，亞硝基脲等等)，抗代謝物(例如，5-氟尿嘧啶，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，甲氨蝶呤，亞葉酸，卡培他濱，阿糖胞苷，氟尿苷，氟達拉濱，吉西他濱，培美曲塞，雷替曲塞等等)，植物生物堿(例如，長春新堿，長春堿，長春瑞濱，長春地辛，鬼白毒素，紫杉醇，多西他賽等等)，拓撲異構酶抑制劑(例如，伊立替康，托泊替康，安吖啶，依托泊苷(VP16)，磷酸依托泊苷，替尼泊苷等等)，抗腫瘤抗生素(例如，多柔比星，阿霉素，柔紅霉素，表柔比星，放線菌素，博來霉素，絲裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素等等)，其藥學上可接受的鹽，其立體異構體，其衍生物，其類似物，以及它們的組合。
[0083]在優(yōu)選實施方式中，所述細胞提取物中一種或多種分析物包含眾多信號轉導分子。感興趣的信號轉導分子的例子在上文中描述并包括受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶和/或酪氨酸激酶信號傳導級聯(lián)組分。
[0084]一些實施方式中，捕獲抗體的各稀釋系列包含一系列遞減的捕獲抗體濃度。某些情況下，所述捕獲抗體被連續(xù)稀釋至少2-倍(例如，2、5、10、20、50、100、500或1000-倍)以制得包含設定數(shù)目(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)遞減捕獲抗體濃度的稀釋系列，該稀釋系列被點在陣列上。優(yōu)選地，在陣列上點上各捕獲抗體稀釋液的至少2、3、
4、5或6個復本。
[0085]在其他實施方式中，所述固相支持體包括玻璃(例如，玻璃載玻片)、塑料、芯片、針、濾器、珠、紙、膜(例如，尼龍、硝酸纖維素、聚偏二氟乙烯(PVDF)等等)、纖維束或任何其他合適的基材。在一優(yōu)選實施方式中，所述捕獲抗體局限(例如，通過共價或非共價相互作用)在用硝酸纖維素聚合物涂布的玻璃載玻片上，例如，從新澤西州沃佛羅漢姆公園的沃特曼有限公司(Whatman Inc.，F(xiàn)lorham Park, NJ)購得的FAST?載玻片。
[0086]作為一個非限制性例子，圖14例舉了一種可尋址微陣列，其包含眾多捕獲抗體稀釋系列以測定EGFR、HER2、She、Erk和PI3K的活化狀態(tài)，其中各稀釋系列內的捕獲抗體定向于這些分析物中的一種。因此，本發(fā)明的陣列包含眾多一系列遞減濃度的不同捕獲抗體(即，連續(xù)稀釋液)，其中所述捕獲抗體偶聯(lián)于不同可尋址位點內的固相支持體表面。
[0087]本領域技術人員將了解，該陣列可采取允許各活化信號轉導分子的離散信號得以檢測的任何構型。例如，陣列可以是支持表面上的線形或網(wǎng)狀不同區(qū)域(例如，點或斑點)，各區(qū)域包含不同捕獲抗體或捕獲劑(即，用來結合捕獲抗體上的捕獲標簽)。所述陣列可被構造成用于在單次多重試驗中檢測眾多信號轉導分子的活化狀態(tài)的方法。在不同實施方式中，所述眾多信號轉導分子包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多信號轉導分子。
[0088]單檢測試驗
[0089]另一方面，檢測腫瘤細胞如實體瘤循環(huán)細胞的細胞提取物中感興趣特定分析物的活化狀態(tài)的試驗是一種具有高動態(tài)范圍的多重、高通量單檢測(即，兩-抗體)試驗。作為一個非限制性例子，用于該試驗的兩抗體可包含:(I)分析物的特異性捕獲抗體；和⑵該分析物活化形式的特異性檢測抗體(即，活化狀態(tài)依賴性抗體)。例如，所述活化狀態(tài)依賴性抗體能夠檢測分析物的磷酸化、泛素化和/或復合狀態(tài)?；蛘撸鰴z測抗體包含活化狀態(tài)非依賴性抗體，其檢測細胞提取物中分析物的總量。所述活化狀態(tài)非依賴性抗體通常能夠檢測活化和非活化形式的分析物。
[0090]在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種進行具有高動態(tài)范圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括:
[0091](a)將細胞提取物與該細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上；
[0092](b)將所述眾多捕獲分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物；
[0093](C)將眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第一和第二成員一起培育以產(chǎn)生放大信號；和
[0094](d)檢測該信號放大對的第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
[0095]一些實施方式中，所述細胞提取物包含實體瘤循環(huán)細胞的提取物。循環(huán)細胞通常采用本領域已知的一種或多種分離方法從患者樣品分離，所述方法包括，例如，免疫磁分離、微流體分離、FACS、密度梯度離心和耗竭法。本領域技術人員將了解適合分開和/或分離循環(huán)細胞的其他方法。
[0096]在其他實施方式中，所述患者樣品包含全血、血清、血漿、尿液、痰液、支氣管灌洗液、淚液、乳頭抽吸物、淋巴液、唾液和/或細針抽吸物樣品。在某些情況下，全血樣品被分離成血漿或血清部分以及細胞部分(即，細胞團)。所述細胞部分通常含有紅血細胞、白血細胞和/或實體瘤循環(huán)細胞如CTC、CEC、CEPC和/或CSC。所述血漿或血清部分通常含有核酸(例如，DNA、RNA)和由實體瘤循環(huán)細胞釋放的蛋白質，等等。
[0097]一些情況下，分離的循環(huán)細胞在與感興趣的一種或多種抗癌藥一起培育之前、期間和/或之后可用一種或多種生長因子體外刺激。刺激性生長因子在上文中描述。其他情況下，例如在生長因子刺激和/或抗癌藥處理之后可用本領域已知的任何技術裂解分離的循環(huán)細胞以產(chǎn)生細胞提取物(例如，細胞裂解液)。優(yōu)選地，在生長因子刺激后約1-360分鐘之間開始細胞裂解，更優(yōu)選在兩個不同時間間隔進行裂解:(I)生長因子刺激后約1-5分鐘；和⑵生長因子刺激后約30-180分鐘之間?；蛘?，細胞裂解液可儲存于-80°C直至使用。
[0098]在某些實施方式中，所述抗癌藥包括抗-信號傳導劑(例如，單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑，等等)、抗增殖劑、化療劑和/或能夠降低或消除異常細胞如癌性細胞不受控生長的任何其他化合物。落入這些常規(guī)治療劑類別的具體抗癌藥的例子在上文中提供。
[0099]在優(yōu)選實施方式中，所述細胞提取物中一種或多種分析物包含眾多信號轉導分子。感興趣的信號轉導分子的例子在上文中描述并包括但不限于受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶和/或酪氨酸激酶信號傳導級聯(lián)組分。
[0100]一些實施方式中，捕獲抗體的各稀釋系列包含一系列遞減的捕獲抗體濃度。某些情況下，所述捕獲抗體被連續(xù)稀釋至少2-倍(例如，2、5、10、20、50、100、500或1000-倍)以制得包含設定數(shù)目(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)遞減捕獲抗體濃度的稀釋系列，該稀釋系列被點在陣列上。優(yōu)選地，在陣列上點上各捕獲抗體稀釋液的至少2、3、
4、5或6個復本。
[0101]在其他實施方式中，所述固相支持體包括玻璃(例如，玻璃載玻片)、塑料、芯片、針、濾器、珠、紙、膜(例如，尼龍、硝酸纖維素、PVDF等等)、纖維束或任何其他合適的基材。在一優(yōu)選實施方式中，所述捕獲抗體局限在用硝酸纖維素聚合物涂布的玻璃載玻片上，例如新澤西州沃佛羅漢姆公園的沃特曼有限公司的載玻片。
[0102]某些情況下，細胞提取物與已經(jīng)局限在固相支持體上的捕獲抗體一起培育。在某些其他情況下，細胞提取物先與溶液中的捕獲抗體一起培育，然后接觸固相支持體以固定捕獲分析物，例如，通過與結合于固相支持體的捕獲劑相互作用的捕獲抗體上存在的捕獲標簽來固定。
[0103]一些實施方式中，檢測抗體與結合于溶液中的或局限在固相支持體上的捕獲抗體的分析物一起培育。某些情況下，包含眾多分析物的細胞提取物首先與溶液中的檢測抗體一起培育，然后接觸溶液中的或局限在固相支持體上的捕獲抗體。在某些其他情況下，包含眾多分析物的細胞提取物首先與溶液中的捕獲抗體和檢測抗體一起培育，然后接觸固相支持體以固定抗體-分析物復合體，例如，通過與結合于固相支持體的捕獲劑相互作用的捕獲抗體或檢測抗體上存在的捕獲標簽來固定。
[0104]某些情況下，檢測抗體包含活化狀態(tài)非依賴性抗體，它可用于檢測細胞提取物中一種或多種分析物的總量。作為一個非限制性例子，活化狀態(tài)非依賴性抗體可檢測一種或多種信號轉導分子的磷酸化和非磷酸化形式。在某些其他情況下，檢測抗體包含活化狀態(tài)依賴性抗體，它用于檢測細胞提取物中一種或多種分析物的活化狀態(tài)。優(yōu)選地，活化狀態(tài)依賴性抗體檢測一種或多種信號轉導分子的磷酸化、泛素化和/或復合狀態(tài)。
[0105]就分析物接合而言，通常選擇捕獲抗體和檢測抗體以盡可能減小它們之間的競爭(即，捕獲抗體和檢測抗體能同時結合它們相應的信號轉導分子)。
[0106]在一優(yōu)選實施方式中，檢測抗體包含結合對的第一成員(例如，生物素)，而信號放大對的第一成員包含該結合對的第二成員(例如，鏈霉抗生物素蛋白)。采用本領域熟知方法可將結合對成員直接或間接偶聯(lián)于檢測抗體或偶聯(lián)于信號放大對的第一成員。某些情況下，信號放大對的第一成員是過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶(HRP)，過氧化氫酶，氯過氧化物酶，細胞色素c過氧化物酶，嗜曙紅細胞過氧化物酶，谷胱甘肽過氧化物酶，乳過氧化物酶，髓過氧化物酶，甲狀腺過氧化物酶，脫碘酶等等)，信號放大對的第二成員是酪酰胺試劑(酪酰胺試劑)(例如，生物素-酪酰胺)。這些情況中，放大信號是在有過氧化氫(H2O2)存在時由過氧化物酶氧化酪酰胺試劑以產(chǎn)生活化的酪酰胺而生成的。
[0107]活化的酪酰胺可直接檢測或在加入信號檢測試劑后檢測，所述信號檢測試劑例如鏈霉抗生物素蛋白-標記的熒光團或鏈霉抗生物素蛋白-標記的過氧化物酶和顯色試劑的組合。適用于本發(fā)明的熒光團的例子包括但不限于:Alexa Π?ΙΟΓ?染料(例如，Alexa Fluor? 555),突光素,異硫氰酸突光素(FITC), Oregon Green? ;羅丹明，得克薩斯紅，異硫氰酸四羅丹明(TRITC)，CyDye?熒光素(例如，Cy2，Cy3，Cy5)，等等。可采用本領域熟知的方法將鏈霉抗生物素蛋白標簽直接或間接偶聯(lián)于熒光團或過氧化物酶。適用于本發(fā)明的顯色試劑的非限制性例子包括3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，4-氯-1-萘酚(4CN)，和/或卟啉原。
[0108]本領域技術人員將了解，按照這里所述的單檢測試驗，也可用除抗體外的結合伴侶來固定和/或檢測細胞提取物中的一種或多種分析物。這種結合伴侶的非限制性例子包括分析物的配體或受體、分析物的底物、結合域(例如，PTB、SH2等等)、適體，等等。
[0109]相近雙檢測試驗
[0110]另一方面，檢測腫瘤細胞如實體瘤循環(huán)細胞的細胞提取物中感興趣特定分析物的活化狀態(tài)的試驗是一種具有高動態(tài)范圍的多重、高通量相近(即，三-抗體)試驗。作為一個非限制性例子，用于該相近試驗的三抗體可包含:(I)分析物的特異性捕獲抗體；(2)該分析物活化形式的特異性檢測抗體(即，活化狀態(tài)依賴性抗體)；和(3)檢測分析物總量的檢測抗體(即，活化狀態(tài)非依賴性抗體)。例如，所述活化狀態(tài)依賴性抗體能夠檢測分析物的磷酸化、泛素化和/或復合狀態(tài)。所述活化狀態(tài)依賴性抗體通常能夠檢測活化和非活化形式的分析物。
[0111]在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種進行具有高動態(tài)范圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括:
[0112](a)將細胞提取物與所述細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上；
[0113](b)將所述眾多捕獲分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物，其中所述檢測抗體包含:
[0114](I)眾多用易化部分標記的活化狀態(tài)非依賴性抗體，和
[0115](2)眾多用信號放大對的第一成員標記的活化狀態(tài)依賴性抗體，
[0116]其中所述易化部分產(chǎn)生導向信號放大對的第一成員并與其反應的氧化劑；
[0117](c)將眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第二成員一起培育以產(chǎn)生放大信號；和
[0118](d)檢測信號放大對的第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
[0119]圖1列舉了一種示例性相近試驗，其中的分析物結合于捕獲抗體和兩種檢測抗體(即，一種活化狀態(tài)非依賴性抗體和一種活化狀態(tài)依賴性抗體)。捕獲抗體I和活化狀態(tài)非依賴性抗體2各自結合分析物6而與其活化狀態(tài)無關?；罨癄顟B(tài)依賴性抗體3根據(jù)分析物的活化狀態(tài)與其結合(例如，活化狀態(tài)依賴性抗體將僅結合具有磷酸化殘基的分析物的激活形式)?；罨癄顟B(tài)非依賴性抗體用易化部分(表示為Ml，4)標記，而活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放大對的第一成員(表示為M2，5)標記。兩種檢測抗體與分析物的結合使得其內的易化部分充分接近(用虛線7內的區(qū)域表示)信號放大對的第一成員，從而易化部分生成的信號能夠導向信號放大對的第一成員從而導致生成可檢測和/或可放大的信號。各種相近導向(proximity channeling)方法是本領域已知的并包括,例如，F(xiàn)RET,時間解析突光-FRET，L0CI等等。如本發(fā)明方法采用的相近導向的一個優(yōu)點是，只有那些結合所有三種抗體的分析物才產(chǎn)生單個可檢測的信號，從而提高了試驗特異性、降低了背景并簡化了檢測。
[0120]一些實施方式中，所述細胞提取物包含實體瘤循環(huán)細胞的提取物。循環(huán)細胞通常采用本領域已知的一種或多種分離方法從患者樣品分離，所述方法包括，例如，免疫磁分離、微流體分離、FACS、密度梯度離心和耗竭法。
[0121]在其他實施方式中，所述患者樣品包含全血、血清、血漿、尿液、痰液、支氣管灌洗液、淚液、乳頭抽吸物、淋巴液、唾液和/或細針抽吸物樣品。在某些情況下，全血樣品被分離成血漿或血清部分以及細胞部分(即，細胞團)。所述細胞部分通常含有紅血細胞、白血細胞和/或實體瘤循環(huán)細胞如CTC、CEC、CEPC和/或CSC。所述血漿或血清部分通常含有核酸(例如，DNA、RNA)和由實體瘤循環(huán)細胞釋放的蛋白質，等等。
[0122]一些情況下，分離的循環(huán)細胞在與感興趣的一種或多種抗癌藥一起培育之前、期間和/或之后可用一種或多種生長因子體外刺激。刺激性生長因子在上文中描述。其他情況下，例如在生長因子刺激和/或抗癌藥處理之后可用本領域已知的任何技術裂解分離的循環(huán)細胞以產(chǎn)生細胞提取物(例如，細胞裂解液)。優(yōu)選地，在生長因子刺激后約1-360分鐘之間開始細胞裂解，更優(yōu)選在兩個不同時間間隔進行裂解:(I)生長因子刺激后約1-5分鐘；和(2)生長因子刺激后約30-180分鐘之間?；蛘撸毎呀庖嚎蓛Υ嬗?80°C直至使用。
[0123]在某些實施方式中，所述抗癌藥包括抗-信號傳導劑(例如，單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑，等等)、抗增殖劑、化療劑和/或能夠降低或消除異常細胞如癌性細胞不受控生長的任何其他化合物。落入這些常規(guī)治療劑類別的具體抗癌藥的例子在上文中提供。
[0124]在優(yōu)選實施方式中，所述細胞提取物中一種或多種分析物包含眾多信號轉導分子。感興趣的信號轉導分子的例子在上文中描述并包括但不限于受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶和/或酪氨酸激酶信號傳導級聯(lián)組分。
[0125]一些實施方式中，捕獲抗體的各稀釋系列包含一系列遞減的捕獲抗體濃度。某些情況下，所述捕獲抗體被連續(xù)稀釋至少2-倍(例如，2、5、10、20、50、100、500或1000-倍)以制得包含設定數(shù)目(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)遞減捕獲抗體濃度的稀釋系列，該稀釋系列被點在陣列上。優(yōu)選地，在陣列上點上各捕獲抗體稀釋液的至少2、3、
4、5或6個復本。
[0126]在其他實施方式中，所述固相支持體包括玻璃(例如，玻璃載玻片)、塑料、芯片、針、濾器、珠、紙、膜(例如，尼龍、硝酸纖維素、PVDF等等)、纖維束或任何其他合適的基材。在一優(yōu)選實施方式中，所述捕獲抗體局限在用硝酸纖維素聚合物涂布的玻璃載玻片上，例如新澤西州沃佛羅漢姆公園的沃特曼有限公司的FAST.載玻片。
[0127]某些情況下，細胞提取物與已經(jīng)局限在固相支持體上的捕獲抗體一起培育。在某些其他情況下，細胞提取物先與溶液中的捕獲抗體一起培育，然后接觸固相支持體以固定捕獲的分析物，例如，通過與結合于固相支持體的捕獲劑相互作用的捕獲抗體上存在的捕獲標簽來固定。
[0128]一些實施方式中，檢測抗體與結合于溶液中的或局限在固相支持體上的捕獲抗體的分析物一起培育。某些情況下，包含眾多分析物的細胞提取物首先與溶液中的檢測抗體一起培育，然后接觸溶液中的或限制在固相支持體上的捕獲抗體接觸。在某些其他情況下，包含眾多分析物的細胞提取物首先與溶液中的捕獲抗體和檢測抗體一起培育，然后接觸固相支持體以固定抗體-分析物復合體，例如，通過與結合于固相支持體的捕獲劑相互作用的捕獲抗體或檢測抗體上存在的捕獲標簽來固定。在檢測步驟之前，可洗滌固定的復合體以除去未形成復合體的抗體,經(jīng)洗滌的復合體隨后可從支持體表面釋放并通過本文所述的合適方法檢測各測試分析物的相近導向。
[0129]在支持體表面包含局限在陣列內的捕獲劑的實施方式中，培育步驟可包括使溶液中的包含眾多分析物的細胞提取物接觸捕獲抗體和檢測抗體，使用的所有三種抗體應過量以使反應完全進行。在該方法的一種變化中，所得抗體-分析物復合體附于固相并洗滌以除去未結合的抗體。參考圖2，捕獲抗體I可包含捕獲標簽10。該復合體通過粘附于固相并與捕獲標簽結合的捕獲劑11而附于固相12，從而固定該復合體。固定的復合體用合適的緩沖液洗滌，然后加入釋放劑13以從固相釋放。釋放劑可通過導致洗滌過的復合體釋放的任何機制起作用。一實施方式中，捕獲標簽包含被釋放劑識別和切割的可切割位點。在圖2所示的另一個實施方式中，釋放劑與捕獲標簽競爭結合捕獲劑。例如，捕獲劑可以是與附于捕獲抗體的部分互補寡核苷酸(即，捕獲標簽)雜交的第一寡核苷酸；而釋放劑可以是與捕獲劑完全互補的寡核苷酸，從而導致鏈置換和洗過的復合體從固相釋放。可使用的合適捕獲標簽/捕獲劑/釋放劑的其他例子包括但不限于:2，4- 二硝基酚(DNP) /抗-DNP抗體/2，4-DNP賴氨酸；T2/抗-Τ3抗體/Τ3 ；G毒毛旋花苷/抗-地高辛抗體/地高辛；以及脫硫生物素/鏈霉抗生物素蛋白/生物素(參見，例如，Ishikawa等，J.Clin.Lab Anal.，12:98-107(1998))。
[0130]洗滌過的復合體從固相釋放之后對其進行以下處理之一:(I)與包含局限在陣列中的捕獲分子的支持體表面接觸，所述分子特異性結合捕獲抗體上的捕獲標簽，或(2)解離，并使解離的檢測抗體接觸包含捕獲劑的支持體表面，所述捕獲劑特異性結合檢測抗體上的捕獲標簽。圖2描繪的實施方式中洗滌過的復合體是解離的并使解離的檢測抗體接觸支持體表面14。支持體表面包含眾多局限在〃可尋址〃或〃郵編碼〃陣列內的捕獲分子。陣列的各個不同區(qū)域包含特異性結合活化狀態(tài)非依賴性檢測抗體2或活化狀態(tài)依賴性抗體3上存在的捕獲標簽8的獨特的捕獲劑9，從而將有標簽的檢測抗體局限并組織在陣列內。在一優(yōu)選實施方式中，所述捕獲劑和捕獲標簽是相互特異性雜交的寡核苷酸。包含寡核苷酸捕獲分子的可尋址陣列是本領域熟知的(參見，例如，Keramas等，Lab Chip, 4:152-158 (2004) ；DeIr1-Lafreniere 等，Diag.Microb1l.1nfect.Dis., 48:23-31(2004))。
[0131]陣列的各個不同區(qū)域處檢測抗體的存在可用諸如易化部分(表示為Ml，4)或信號放大對的第一成員(表示為M2，5)等部分直接或間接檢測?？芍苯訖z測的部分的例子包括熒光團、生色團、膠體金、有色乳膠等等。一實施方式中，所述兩個部分是獨立選擇的熒光團?？墒褂卯斚嗷シ浅＝咏鼤r能提供可區(qū)別讀數(shù)的任何熒光團對，例如，Cy3/Cy5, Cy5/藻紅蛋白，等等。或者，如果使用寡核苷酸可尋址陣列，這兩個部分可以是遞送到不同郵編碼的相同熒光團?？刹捎眉す鈷呙韫步癸@微術來檢測附在陣列上的熒光團部分。在復合體在檢測之前從陣列上釋放的試驗中，如在標準置換試驗中，檢測熒光團部分的合適方法包括毛細管流共焦激光誘導的熒光、納米-HPLC、微毛細管電泳等等。
[0132]一些實施方式中，活化狀態(tài)非依賴性抗體還包含可檢測部分。這種情況下，可檢測部分的量與細胞提取物中一種或多種分析物的量相關?？蓹z測部分的例子包括但不限于:熒光標記物，化學反應性標記物，酶標記物，放射性標記物，等等。優(yōu)選地，所述可檢測部分是熒光團如Alexa Fluor響染料(例如，Alexa FlUOl*? 647)，熒光素，異硫氰酸熒光素(FITC), Oregon Green? ;羅丹明，得克薩斯紅，異硫氰酸四羅丹明(TRITC)，CyDye?熒光素(例如，Cy2，Cy3，Cy5)，等等?？刹捎帽绢I域熟知的方法將可檢測部分直接或間接偶聯(lián)于活化狀態(tài)非依賴性抗體。
[0133]某些情況下，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用易化部分直接標記?？刹捎帽绢I域熟知的方法將易化部分偶聯(lián)于活化狀態(tài)非依賴性抗體。用于本發(fā)明的合適的易化部分包括任何能夠生成導向(即，定向于)相近(即，在空間上接近或靠近)易化部分的另一個分子并與之反應(即，結合、被結合或與之形成復合體)的氧化劑的分子。易化部分的例子包括但不限于:酶類如葡萄糖氧化酶或任何其他催化涉及分子氧(O2)作為電子受體的氧化/還原反應的酶，以及光敏劑如亞甲基藍，玫瑰紅，卩卜啉，方酸(squarate)染料,酞箐染料,等等。氧化劑的非限制性例子包括:過氧化氫(H2O2)，單線態(tài)氧，以及在氧化/還原反應中轉移氧原子或獲得電子的任何其他化合物。優(yōu)選地，有合適底物(例如，葡萄糖、光等等)存在時，當兩個部分相互相近時易化部分(例如，葡萄糖氧化酶，光敏劑等等)生成導向信號放大對的第一成員(例如，辣根過氧化物酶(HRP)，被保護基保護的半抗原，被連接于酶抑制劑的硫醚滅活的酶，等等)并與之反應的氧化劑(例如，過氧化氫(H2O2)，單線態(tài)氧等等)。
[0134]在某些其他情況下，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體通過偶聯(lián)于活化狀態(tài)非依賴性抗體的寡核苷酸接頭與偶聯(lián)于易化部分的互補寡核苷酸接頭之間的雜交而用易化部分間接標記。可采用本領域熟知的方法將寡核苷酸接頭偶聯(lián)于易化部分或偶聯(lián)于活化狀態(tài)非依賴性抗體。一些實施方式中，偶聯(lián)于易化部分的寡核苷酸接頭與偶聯(lián)于活化狀態(tài)非依賴性抗體的寡核苷酸接頭100%互補。在其他實施方式中，例如，在嚴格雜交條件下雜交時，寡核苷酸接頭對包含至少1、2、3、4、5、6或更多錯配區(qū)。本領域技術人員將了解，不同分析物的特異性活化狀態(tài)非依賴性抗體可偶聯(lián)于相同的寡核苷酸接頭或偶聯(lián)于不同的寡核苷酸接頭。
[0135]偶聯(lián)于易化部分或偶聯(lián)于活化狀態(tài)非依賴性抗體的寡核苷酸接頭的長度可以不同。通常，接頭序列的長度可以是至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100個核苷酸。通常，可產(chǎn)生隨機核酸序列進行偶聯(lián)。作為一個非限制性例子，可設計具有三個不同毗連區(qū)的寡核苷酸接頭文庫:間隔區(qū)；特征區(qū)；和偶聯(lián)區(qū)。優(yōu)選地，寡核苷酸接頭被設計成足以進行偶聯(lián)而不破壞它們所偶聯(lián)的易化部分或活化狀態(tài)非依賴性抗體的功能。
[0136]寡核苷酸接頭序列可被設計成能防止或盡可能減小各種試驗條件下二級結構的形成。通常小心監(jiān)測接頭內各區(qū)段的解鏈溫度以使它們參與所有試驗過程。通常，接頭序列區(qū)段的解鏈溫度范圍不大于5°C。測定規(guī)定離子濃度下的解鏈溫度、二級結構和發(fā)夾結構的計算機算法(例如，0LIG06.0)可用于分析各接頭內的各自三個不同區(qū)域。也可分析整體組合序列的結構特征以及它們與其他偶聯(lián)的寡核苷酸接頭序列的可比性，例如，它們在嚴格雜交條件下是否將與互補寡核苷酸接頭雜交。
[0137]寡核苷酸接頭的間隔區(qū)使得偶聯(lián)區(qū)與寡核苷酸交聯(lián)位點充分分開。偶聯(lián)區(qū)的功能是通過核酸雜交將互補寡核苷酸接頭序列標記的分子連接于偶聯(lián)區(qū)?？稍诳贵w-分析物(即，抗原)復合體形成之前或之后進行核酸-介導的雜交以提供更加靈活的試驗模式。與許多直接抗體偶聯(lián)法不同，將相對小的寡核苷酸連接到抗體或其他分子對抗體對它們的靶分析物的特異性親和力或對偶聯(lián)分子功能的影響最小。
[0138]一些實施方式中，寡核苷酸接頭的特征序列區(qū)可用于復合體多重蛋白質試驗。多重抗體可與具有不同特征序列的寡核苷酸接頭偶聯(lián)。在多重免疫測定中，用合適探針標記的報告寡核苷酸序列在多種試驗模式中可用于檢測抗體與它們的抗原之間的交叉雜交。
[0139]可采用若干不同方法將寡核苷酸接頭偶聯(lián)于抗體或其他分子。例如，可在寡核苷酸接頭的5’或3’端與硫醇基團合成?？捎眠€原劑(例如，TCEP-HC1)將該硫醇基團去保護并用脫鹽旋轉柱純化所得接頭?？刹捎卯愲p功能交聯(lián)接頭如SMCC將所得去保護的寡核苷酸接頭偶聯(lián)于抗體或其他類型蛋白質的伯胺上?；蛘?，寡核苷酸上的5’-磷酸基可用水溶性碳二亞胺EDC處理以形成磷酸酯并隨后與含胺分子偶聯(lián)。某些情況下，3’ -核糖殘基上的二醇可被氧化成醛基然后采用還原性胺化與抗體或其他類型蛋白質的胺基偶聯(lián)。在某些其他情況下，可合成在3’或5’端有生物素修飾的寡核苷酸接頭并與鏈霉抗生物素蛋白-標記的分子偶聯(lián)。
[0140]寡核苷酸接頭可采用本領域已知的各種技術合成,如Usman等，J.Am.Chem.Soc.,109:7845 (1987) ;Scaringe等，Nucl.Acids Res.，18:5433(1990) ;Wincott等，Nucl.AcidsRes.,23:2677-2684(1995) ；and Wincott 等，Methods Mol.B1.,74:59(1997)中描述的那些。通常，合成寡核苷酸時采用常規(guī)核酸保護基和偶聯(lián)基，如5’-端的二甲氧基三苯甲基和3’ -端的亞磷酰胺。寡核苷酸合成的合適試劑、核酸去保護方法以及核酸純化方法是本領域技術人員已知的。
[0141]某些情況下，活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放大對的第一成員直接標記?？刹捎帽绢I域熟知的方法將信號放大對成員偶聯(lián)于活化狀態(tài)依賴性抗體。在某些其他情況下，所述活化狀態(tài)依賴性抗體通過偶聯(lián)于活化狀態(tài)依賴性抗體的結合對第一成員與偶聯(lián)于信號放大對的第一成員的結合對第二成員之間的結合而用信號放大對的第一成員間接標記?？刹捎帽绢I域熟知方法將結合對成員(例如，生物素/鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)于信號放大對成員或活化狀態(tài)依賴性抗體。信號放大對成員的例子包括但不限于:過氧化物酶類如辣根過氧化物酶(HRP)、過氧化氫酶、氯過氧化物酶、細胞色素c過氧化物酶、嗜曙紅細胞過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、乳過氧化物酶、髓過氧化物酶、甲狀腺過氧化物酶、脫碘酶，等等。信號放大對成員的其他例子包括被保護基保護的半抗原以及通過硫醚連接于酶抑制劑而滅活的酶。
[0142]就分析物接合而言，通常選擇的捕獲抗體、活化狀態(tài)非依賴性抗體和活化狀態(tài)依賴性抗體應盡可能減小它們之間的競爭(即，所有抗體能同時結合它們相應的信號轉導分子)。
[0143]在相近導向的一個例子中，易化部分是葡萄糖氧化酶(GO)，而信號放大對的第一成員是辣根過氧化物酶(HRP)。當GO與葡萄糖之類底物接觸時生成氧化劑(即，過氧化氫(H2O2))。如果HRP與GO導向相近，則由GO生成的H2O2被導向HRP并與之形成HRP-H2O2復合體，當存在信號放大對的第二成員(例如，化學發(fā)光底物如魯米諾或異魯米諾，或生熒光底物如酪酰胺(例如，生物素-酪酰胺)、高香草酸或4-羥苯基乙酸)時該復合體生成放大信號。在相近試驗中使用GO和HRP的方法描述于，例如，Langry等，美國能源部第UCRL-1D-136797號報告(1999)。當使用生物素-酪酰胺作為信號放大對的第二成員時，HRP-H2O2復合體氧化酪酰胺以產(chǎn)生共價結合附近的親核殘基的反應性酪酰胺殘基?；罨睦阴０房芍苯訖z測或在加入信號檢測試劑后檢測，所述信號檢測試劑例如鏈霉抗生物素蛋白-標記的熒光團或鏈霉抗生物素蛋白-標記的過氧化物酶和顯色試劑的組合。適用于本發(fā)明的熒光團的例子包括但不限于:Alexa Fluor?染料(例如，Alexa Fluor? 555)，熒光素，異硫氰酸熒光素(FITC)，Oregon Green? ;羅丹明，得克薩斯紅，異硫氰酸四羅丹明(TRITC)，CyDye?熒光素(例如，Cy2，Cy3，Cy5)，等等?？刹捎帽绢I域熟知的方法將鏈霉抗生物素蛋白標記直接或間接偶聯(lián)于熒光團或過氧化物酶。適用于本發(fā)明的顯色試劑的非限制性例子包括3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，4-氯-1-萘酚(4CN)，和/或卟啉原。
[0144]在相近導向的另一個例子中，易化部分是光敏劑，而信號放大對的第一成員是用多個半抗原標記的大分子，所述半抗原被保護基保護以防該半抗原與特異性結合伴侶(例如，配體，抗體等等)結合。例如，信號放大對成員可以是用保護的生物素、香豆素和/或熒光素分子標記的右旋糖分子。合適的保護基包括但不限于:苯氧基_，苯胺基(analino-)，烯烴_，硫醚_，以及硒代醚(selenoether)-保護基。適用于本發(fā)明的相近試驗的其他光敏劑和保護的半抗原分子描述于美國專利號5，807，675。當光敏劑被光激發(fā)時生成氧化劑(即，單線態(tài)氧)。如果半抗原分子與光敏劑導向相近，則光敏劑生成的單線態(tài)氧被導向半抗原保護基上的硫醚并與之反應產(chǎn)生羰基(酮或醛)和亞磺酸，從半抗原上釋放保護基。未保護的半抗原然后可特異性結合信號放大對的第二成員(例如，可生成可檢測信號的特異性結合伴侶)。例如，當半抗原是生物素，所述特異性結合伴侶可以是酶-標記的鏈霉抗生物素蛋白。示例性的酶包括堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、HRP等等。洗滌除去未結合試劑之后可加入酶的可檢測(例如，熒光、化學發(fā)光、生色等等)底物以生成可檢測信號并用本領域已知的合適方法和設備進行檢測?；蛘?，可采用酪酰胺信號放大來放大可檢測的信號并直接檢測或加入如上所述的信號檢測試劑后檢測活化的酪酰胺。
[0145]在相近導向的再一個例子中，易化部分是光敏劑，而信號放大對的第一成員是酶-抑制劑復合體。所述酶和抑制劑(例如，磷酸-標記的右旋糖)由可切割接頭(例如，硫醚)連接在一起。當光敏劑被光激發(fā)時生成氧化劑(即，單線態(tài)氧)。如果酶-抑制劑復合體與光敏劑導向相近，則光敏劑生成的單線態(tài)氧導向到可切割接頭并與之反應，從酶上釋放抑制劑，從而將酶激活。加入酶底物以產(chǎn)生可檢測信號，或者加入放大試劑以產(chǎn)生放大信號。
[0146]在相近導向進一步的例子中，易化部分是HRP，信號放大對的第一成員是上述保護的半抗原或酶-抑制劑復合體，而保護基包含對-烷氧基苯酚。加入苯二胺和H2O2能生成反應性亞苯基二亞胺，其導向被保護的半抗原或酶-抑制劑復合體并與對苯氧基苯酚保護基反應以產(chǎn)生暴露的半抗原或反應性酶。生成放大信號并按照上文描述進行檢測(參見，例如，美國專利號5，532，138和5，445，944)。
[0147]本領域技術人員將了解，按照這里所述的相近(即，三-抗體)試驗也可用除抗體外的結合伴侶來固定和/或檢測細胞提取物中的一種或多種分析物。這種結合伴侶的非限制性例子包括分析物的配體或受體、分析物底物、結合域(例如，PTB、SH2等等)、適體，等坐寸ο
[0148]試劑盒
[0149]在進一步的方面，本發(fā)明提供了進行上述基于抗體的陣列方法的試劑盒，其包含:(a)局限在固相支持體上的眾多捕獲抗體的稀釋系列；和(b)眾多檢測抗體(例如，活化狀態(tài)非依賴性抗體和/或活化狀態(tài)依賴性抗體)。一些情況下，所述試劑盒可進一步包含用該試劑盒來檢測實體瘤循環(huán)細胞的眾多信號轉導分子的活化狀態(tài)的使用說明書。所述試劑盒還可包含上文就進行本發(fā)明具體方法所述的任何其他試劑，如信號放大對的第一和第二成員、酪酰胺信號放大試劑、易化部分底物、洗滌緩沖液、捕獲/釋放試劑，等等。
[0150]抗體陣列的構建
[0151]在某些方面，本發(fā)明提供基于抗體的陣列，它采用局限在固相支持體上的捕獲抗體的稀釋系列來檢測實體瘤循環(huán)細胞的細胞提取物中眾多信號轉導分子的活化狀態(tài)。用于本發(fā)明試驗的陣列通常包含偶聯(lián)于固相支持體表面不同可尋址位點的一定捕獲抗體濃度范圍內的眾多不同的捕獲抗體。
[0152]固相支持體可包含用于固定蛋白質的任何合適基材。固相支持體的例子包括但不限于:玻璃(例如，玻璃載玻片)、塑料、芯片、針、濾器、珠(例如，磁珠、聚苯乙烯珠等)、紙、膜、纖維束、凝膠、金屬、陶瓷等等。諸如尼龍(B1trans?，加州科斯達麥薩的ICNB公司
(ICN B1medicals, Inc., Costa Mesa, CA) ; Zeta-Prob(/i;，加州赫爾克里斯的伯樂公司
(B1-Rad Laboratories, Hercules, CA))，硝酸纖維素(ProtraU-- 新澤西州沃佛羅漢姆公園的沃特曼有限公司(Whatman Inc., Florham Park, NJ))和 PVDF(Immobilon?,馬薩諸塞州比勒瑞卡的微孔公司(Millipore Corp.,Billerica,MA))之類的膜適合用作本發(fā)明陣列的固相支持體。優(yōu)選地，所述捕獲抗體局限在用硝酸纖維素聚合物涂布的玻璃載玻片上，例如，從新澤西州沃佛羅漢姆公園的沃特曼有限公司(Whatman Inc.,Florham Park,NJ)購得的FAJST?載玻片。
[0153]所需的固相支持體的具體方面包括能夠結合大量捕獲抗體、能結合捕獲抗體而變性最小、以及無法結合其他蛋白質。另一種合適方面是當在固相支持體上施加含有捕獲抗體的抗體溶液時支持體顯示出最小“芯吸(wicking) ”。具有最小芯吸的固相支持體能夠將捕獲抗體溶液的小試樣施加到支持體上從而得到固定捕獲抗體的小而確定的斑點。
[0154]捕獲抗體通常通過共價或非共價相互作用(例如，離子鍵、疏水相互作用、氫鍵、范德華力、偶極-偶極鍵)直接或間接(例如，經(jīng)捕獲標簽)局限在固相支持體上。一些實施方式中，用同雙功能或異雙功能交聯(lián)劑通過標準交聯(lián)方法和條件將捕獲抗體共價附于固相支持體。合適的交聯(lián)劑可從例如伊利諾伊州羅克福德的皮爾斯生物技術公司(PierceB1technology, Rockford, IL)購得。
[0155]生成本發(fā)明陣列的方法包括但不限于任何用來構建蛋白質或核酸陣列的技術。一些實施方式中，捕獲抗體用微型點樣器(miCTospotter)點到陣列上，所述微型點樣器通常是裝備有開口銷、鈍銷釘或噴墨印刷器的自動印刷機。用來印刷本文所述抗體陣列的合適自動系統(tǒng)包括裝備有ChipMaker2開口銷(加州桑尼維爾泰萊化學國際公司(TeleChemInternat1nal ；Sunnyvale, CA))的PixSys 5000機器人(加州歐文的笛卡爾技術有限公司(Cartesian Technologies ；Irvine, CA))以及購自馬薩諸塞州烏本的生物自動化公司(B1Robics, Woburn, MA)和康涅狄格州麥瑞登的派卡德儀器公司(Packard InstrumentC0., Meriden, CT)的其他自動印刷機。優(yōu)選地，在陣列上點上各捕獲抗體稀釋液的至少2、
3、4、5或6個復本。
[0156]產(chǎn)生本發(fā)明的抗體陣列的另一種方法包括在能將規(guī)定體積液體吸取到支持體上的有效條件下使毛細管分配器接觸固相支持體從而將已知體積的捕獲抗體稀釋液分配到各個選定陣列位置，其中，在各選出的陣列位置上用選擇的捕獲抗體溶液重復該過程以形成完整陣列?？蓪嵤┰摲椒ㄒ孕纬杀姸啻祟愱嚵?，其中溶液沉積步驟適用于各個重復周期內眾多固相支持體各自的選定位置。該方法的進一步描述可在例如美國專利號5，807，522中找到。
[0157]某些情況下，可使用在紙上印刷的裝置來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體陣列。例如，可將所需捕獲抗體稀釋液加載到桌面噴墨打印機的打印頭上并印刷到合適的固相支持體上(參見，例如，Silzel 等，Clin.Chem.,44:2036-2043 (1998))。
[0158]一些實施方式中，固相支持體上所產(chǎn)生陣列的密度至少約5個斑點/cm2，優(yōu)選至少約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000 或 9000、或者 10000 個斑點 /
2
cm ο
[0159]某些情況下，固相支持體上的斑點各自代表不同的捕獲抗體。在某些其他情況下，固相支持體上的多個斑點代表相同的捕獲抗體，例如，當稀釋系列包含一系列遞減的捕獲抗體濃度時。
[0160]在固相支持體上制備和構建抗體陣列的方法的其他例子描述于美國專利號6197599,6777239,6780582,6897073,7179638 和 7192720 ;美國專利公布號 20060115810、20060263837,20060292680 和 20070054326 ；以及 Varnum 等，Methods Mol.B1l.，264:161-172(2004)。
[0161]掃描抗體陣列的方法是本領域已知的且包括但不限于用來掃描蛋白質或核酸陣列的任何技術。適用于本發(fā)明的微陣列掃描儀獲自馬薩諸塞州波士頓的PE公司(PerkinElmer, Boston, MA)、加州帕洛阿托的 AT 公司(Agilent Technologies, PaloAlto, CA),華盛頓州依沙庫哈的AP公司(Applied Precis1n, Issaquah, WA)，馬薩諸塞州比勒瑞卡的GSIL公司(GSI Lumonics Inc.，Billerica, MA)，以及加州聯(lián)合城的Al公司(Axon Instruments, Un1n City, CA)。作為一個非限制性例子，用于突光檢測的GSIScanArray3000可與進行量化的ImaGene軟件一起使用。
[0162]抗體的制造
[0163]尚未市售獲得的根據(jù)本發(fā)明分析稀有循環(huán)細胞內信號轉導分子的活化狀態(tài)和/或總量的抗體可通過幾種方法制造。例如，一種方法是用本領域已知的蛋白質表達和純化方法來表達和/或純化感興趣的多肽(即，抗原)，而另一種方法是用本領域已知的固相肽合成方法來合成感興趣的多肽。參見，例如，《蛋白質純化指南》(Guide to ProteinPurificat1n)，Murray P.Deutcher 編，Meth.Enzymo1.，第 182 卷(1990);《固相妝合成》(Solid Peptide Synthesis), Greg B.Fields 編，Meth.Enzymol.,第 289 卷(1997) ；Kiso等，Chem.Pharm.Bull.,38:1192-99(1990) ；Mostafavi 等，B1med.Pept.《蛋白質核酸》(Proteins Nucleic Acids), 1:255-60, (1995);和 Fujiwara 等，Chem.Pharm.Bull.,44:1326-31 (1996)。例如，純化或合成的多肽然后可注射到小鼠或家兔體內以產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。本領域技術人員將知道有許多方法可用來制造抗體，例如《抗體實驗室手冊》(Antibodies, A Laboratory Manual), Harlow 和 Lane 編，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1988)中所述。本領域技術人員還將知道，也可采用各種方法從遺傳信息制備模擬抗體的結合片段或Fab片段(參見,例如，《抗體工程:實踐方法》(Antibody Engineering:A Practical Approach), Borrebaeck 編，牛津大學出版社，牛津(1995)；和 Huse 等，J.1mmunol.，149:3914-3920(1992))。
[0164]此外，許多出版物已經(jīng)報道了用噬菌體展示技術來制造和篩選與選定的靶抗原結合的多肽文庫(參見，例如，Cwirla 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,87:6378-6382(1990)；Devlin 等，Science, 249:404-406(1990) ；Scott 等，Science, 249:386-388(1990)；和Ladner等，美國專利號5，571，698)。噬菌體展示方法的基本概念是在噬菌體DNA編碼多肽和靶抗原之間建立物理相關性。這種物理相關性由噬菌體顆粒提供，其展示的多肽作為圍繞編碼該多肽的噬菌體基因組的衣殼的一部分。多肽與它們遺傳物質之間物理相關性的建立能同時普查非常大量的帶有不同多肽的噬菌體。展示對靶抗原具有親和力的多肽的噬菌體結合該靶抗原，并通過親和力篩選將這些噬菌體富集于靶抗原。這些噬菌體展示的多肽的相同性可從它們各自的基因組來確定。采用這些方法，然后可通過常規(guī)方法大量合成被鑒定為對所需靶抗原具有結合親和力的多肽(參見，例如，美國專利號6，057，098)。
[0165]然后可對通過這些方法產(chǎn)生的抗體進行選擇，首先就對純化的感興趣多肽抗原的親和力和選擇性進行篩選，如果需要可將該抗體與不需要結合的其他多肽抗原的親和力和特異性結果進行比較。篩選過程可包括將純化的多肽抗原固定在微滴定板的不同孔中。然后在各個微滴定孔內加入含有潛在抗體或抗體組的溶液并培育約30分鐘至2小時。然后洗滌微滴定孔并在孔中加入標記的第二抗體(例如，如果產(chǎn)生的抗體是小鼠抗體則加入偶聯(lián)于堿性磷酸酶的抗-小鼠抗體)并培育約30分鐘，然后洗滌。在孔中加入底物，當存在固定的多肽抗原的抗體時將出現(xiàn)顯色反應。
[0166]然后進一步分析如此鑒定的抗體的親和力和特異性。在靶蛋白的免疫測定法的開發(fā)中，純化的靶蛋白作為標準品來判斷用所選抗體進行免疫測定試驗的靈敏度和特異性。由于各種抗體的結合親和力可能不同，例如，某些抗體組合可能會在空間上相互影響，因此抗體的試驗性能是比抗體的絕對親和力和特異性更重要的度量。
[0167]本領域技術人員將了解，可采取許多方法來制造抗體或結合片段并篩選和選擇其對各種感興趣多肽的親和力和特異性，但這些方法不改變本發(fā)明的范圍。
[0168]多克隆抗體
[0169]多克隆抗體優(yōu)選通過多點皮下注射(SC)或腹膜內注射(ip)感興趣多肽和佐劑在動物內制備。用雙功能試劑或衍生化試劑將感興趣多肽偶聯(lián)于在要免疫物種中呈免疫原性的蛋白質載體是有用的，所述蛋白質載體例如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。雙功能試劑或衍生化試劑的非限制性例子包括馬來酰亞氨基苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基偶聯(lián))、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2和R1N = C = NR(其中R和R1是不同的烷基基團)。
[0170]用感興趣多肽或其免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，例如，將100微克(用于兔)或5微克(用于小鼠)抗原或偶聯(lián)物與3倍體積的弗氏完全佐劑組合并在多個部位皮內注射溶液。I個月后用約1/5到1/10初始量的弗氏不完全佐劑配制的多肽或偶聯(lián)物在多個部位皮下注射來加強免疫動物。7-14天后采集動物血液，檢驗血清的抗體效價。通常再加強免疫動物次直到平臺期。優(yōu)選用相同多肽的偶聯(lián)物來加強免疫動物，但可采用偶聯(lián)于不同免疫原性蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑。偶聯(lián)物也可作為融合蛋白在重組細胞培養(yǎng)物內制造。某些情況下，可使用明礬等凝聚劑來增強免疫應答。
[0171]單克隆抗體
[0172]單克隆抗體通常從一群基本均質的抗體(即該群所含的各抗體除了可能天然發(fā)生的數(shù)量很少的突變外都是一致的)獲得。因此，修飾語"單克隆"表示抗體的特征為不是離散抗體的混合物。例如，單克隆抗體可通過Kohler等,Nature, 256:495 (1975)描述的雜交瘤方法或者通過本領域已知的任何重組DNA方法(參見，例如，美國專利號4，816，567)制備。
[0173]在雜交瘤方法中，按照本文所述的免疫小鼠或其他合適的宿主動物(例如，倉鼠)以刺激能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細胞，其中的抗體可與用于免疫的感興趣多肽特異性結合。另外，也可在體外免疫淋巴細胞。然后用合適的融合試劑如聚乙二醇將免疫的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(參見，例如，Goding，單克隆抗體:原理和實踐(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice),學術出版社(Academic Press),第59-103頁(1986))。將如此制備的雜交瘤細胞接種到合適培養(yǎng)基中并在其中生長，培養(yǎng)基內優(yōu)選含有一種或多種能抑制未融合的母體骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果母體骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)，則雜交瘤細胞培養(yǎng)基一般包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質能防止HGPRT-缺陷細胞的生長。
[0174]優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些可有效融合并支持所篩選出的抗體產(chǎn)生細胞穩(wěn)定高水平地生產(chǎn)抗體的細胞，和/或對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的細胞。用于制造人單克隆抗體的這種優(yōu)選的骨髓瘤細胞系的例子包括但不限于:鼠骨髓瘤細胞系如衍生自M0PC-21和MPC-1l小鼠腫瘤的細胞系(獲自美國加州圣地亞哥的索爾克細胞銷售中心(Salk Institute Cell Distribut1n Center ;San Diego, CA), SP-2 或 X63_Ag8_653 細胞(獲自美國馬里蘭州羅克維爾的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollect1n ；Rockville, MD)，以及人骨髓瘤或小鼠-人雜骨髓瘤細胞系(參見，例如，Kozbor, J.1mmunol., 133:3001 (1984)；和Brodeur等，《單克隆抗體制造技術和應用》(Monoclonal Antibody Product1n Techniques and Applicat1ns)，MD 公司(MarcelDekker, Inc.)，紐約,第 51-63 頁(1987))。
[0175]檢測培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中是否產(chǎn)生針對感興趣多肽的單克隆抗體。優(yōu)選的是，雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉淀或通過體外結合分析如放免分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)來確定。單克隆抗體的結合親和力可以采用，例如，Scatchard 分析(Munson 等，Anal.B1chem., 107:220 (1980))來確定。
[0176]鑒定到產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可通過有限稀釋步驟亞克隆該克隆并通過標準方法培養(yǎng)(參見，例如，Goding，《單克隆抗體:原理和實踐》(Monoclonal Antibodies !Principles and Practice),學術出版社，第 59-103 頁(1986))。適用于此種目的培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPM1-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可以作為腹水瘤在動物體內培養(yǎng)。通過常規(guī)抗體純化方法，如A蛋白-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析由培養(yǎng)基、腹水或血清分離所述亞克隆分泌的單克隆抗體。
[0177]利用常規(guī)方法(例如，通過利用能夠特異性結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)不難分離和測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細胞用作這類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，則可將該DNA放入表達載體中，然后轉染入大腸桿菌(E.coli)細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等宿主細胞，或不產(chǎn)生抗體的骨髓瘤細胞中，從而在重組宿主細胞中誘導單克隆抗體合成。參見，例如，Skerra等，Curr.0pin.1mmunol.，5:256-262(1993);和 Pluckthun，Immunol Rev.，130:151-188 (1992)。DNA 也可被修飾，例如，用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)編碼序列替代同源的鼠序列(參見，例如，美國專利號 4，816，567 ;和 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851 (1984))，或將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽編碼序列的的全部或一部分共價連接。
[0178]在進一步的實施方式中，可從抗體噬菌體文庫分離單克隆抗體或抗體片段，所述文庫是米用例如 McCafferty 等，Nature, 348:552-554 (1990) ；Clackson 等，Nature, 352:624-628 (1991);和 Marks 等，J.Mol.B1l.，222:581-597 (1991)描述的技術產(chǎn)生。通過鏈改組制造高親和力(nM范圍)人單克隆抗體描述于Marks等，B1Technology,10:779-783 (1992)。用組合感染和體內重組作為構建極大噬菌體文庫的方案描述于Waterhouse等，Nuc.Acids Res.,21:2265-2266 (1993)。因此，這些技術可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單克隆抗體雜交瘤方法來生產(chǎn)單克隆抗體。
[0179]人源化抗體
[0180]將非人抗體人源化的方法是本領域已知的。優(yōu)選地，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，該殘基通常取自“輸入”可變結構域。人源化實質上可用非人抗體的超變區(qū)序列代替人抗體的相應序列來進行。參見，例如，Jones 等，Nature, 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature, 332:323-327(1988);和 Verhoeyen 等，Science，239:1534-1536 (1988)。因此，這種〃人源化〃抗體是嵌合抗體(參見，例如，美國專利號4，816，567)，其中基本上不到完整的人可變結構域被非人種類的相應序列替代。實際上，人源化抗體通常是其中的某些超變區(qū)殘基以及可能的一些框架區(qū)(FR)殘基被嚙齒類抗體類似位點的殘基取代的人抗體。
[0181]為降低抗原性需要著重考慮用于制造本文所述人源化抗體的人可變結構域(包括輕鏈和重鏈)的選擇。根據(jù)所謂的“最佳匹配(best-fit)”方法，用已知的人可變結構域序列的完整文庫篩選嚙齒類抗體的可變結構域序列。與嚙齒類序列接近的人序列然后被接受作為人源化抗體的人FR(參見，例如，Sims等，J.1mmunol.，151:2296(1993);和Chothia等，J.Mol.B1l.，196 =901(1987)) ο另一種方法使用衍生自特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的特定FR。相同F(xiàn)R可用于數(shù)種不同的人源化抗體(參見，例如，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4285 (1992);和 Presta 等，J.1mmunol., 151:2623 (1993))。
[0182]人源化抗體保留與抗原的高親和力和其它優(yōu)良的生物學特性也是重要的。為實現(xiàn)該目的，通過母體序列的分析方法和利用母體和人源化序列的三維模型的各種概念性人源化產(chǎn)物制備人源化抗體。本領域技術人員通?？色@得并且熟悉三維免疫球蛋白模型。也可利用計算機程序說明和顯示所選的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構。檢查這些顯示信息能夠分析所述殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以這種方式，可從受者和輸入序列選擇和合并FR殘基，從而獲得所需抗體特性，如提高的對靶抗原的親和力。通常，超變區(qū)殘基直接地并特異性地影響抗原結合。
[0183]本發(fā)明考慮了人源化抗體的各種形式。例如，所述人源化抗體可以是抗體片段，如Fab片段。或者，所述人源化抗體可以是完整抗體，如完整的IgA、IgG或IgM抗體。
[0184]人抗體
[0185]作為人源化的替代方案，可產(chǎn)生人抗體。一些實施方式中，可制造轉基因動物(例如，小鼠)，在免疫之后這種動物能夠在不產(chǎn)生內源免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生人抗體的所有成分。例如，已經(jīng)描述過嵌合和種系突變型小鼠中抗體重鏈結合區(qū)(JH)基因的純合缺失導致完全抑制內源性抗體產(chǎn)生。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這種種系突變型小鼠將導致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。參見，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,90:2551 (1993) ； Jakobovits 等，Nature, 362:255-258(1993) ；Bruggermann 等，Year inImmun.，7:33 (1993)；以及美國專利號 5591669,5589369 和 5545807。
[0186]或者，可采用卩遼菌體展示技術(參見，例如，McCafferty等，Nature, 348:552-553(1990))，利用未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結構域基因的所有組分在體外制造人抗體和抗體片段。根據(jù)該技術，抗體V結構域基因被框內克隆到如M13或fd等絲狀噬菌體的主要或次要衣殼蛋白基因內，并作為功能性抗體片段在噬菌體顆粒表面展示。由于這種絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功能特性進行選擇也能選出顯示那些特性的抗體的編碼基因。因此，這種噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可采取，例如，Johnson 等，Curr.0pin.Struct.B1l.,3:564-571 (1993)中描述的各種方式進行。一些來源的V-基因區(qū)段也用于噬菌體展示。參見，例如，Clackson等，Nature，352:624-628(1991)?；旧峡砂凑?Marks 等，J.Mol.B1l., 222:581-597 (1991) !Griffith 等，EMBO J.,12 =725-734(1993);以及美國專利號5565332和5573905中描述的技術構建未免疫的人供體的V基因的所有組分并分離針對不同抗原(包括自體抗原)陣列的抗體。
[0187]在某些情形中，人抗體也可以通過例如美國申請?zhí)?，567，610和5，229，275所述的體外活化B細胞來制備。
[0188]抗體片段
[0189]已經(jīng)開發(fā)了許多制造抗體片段的技術。傳統(tǒng)上，這些片段是通過蛋白水解消化完整抗體衍生得到的(參見，例如，Morimoto等，J.B1chem.B1phys.Meth., 24:107-117(1992);和 fcennan 等，Science，229:81 (1985))。然而，可使用重組宿主細胞直接產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘撸現(xiàn)ab’-SH片段可從大腸桿菌細胞直接回收并化學偶聯(lián)以形成F(ab’)2片段(參見，例如，Carter等，B1Technology, 10:163-167 (1992))。根據(jù)另一種方法，F(xiàn) (ab’)2片段可從重組宿主細胞培養(yǎng)物直接分離。制造抗體片段的其他技術對于本領域技術人員顯而易見。在其他實施方式中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見，例如，PCT公布號WO 93/16185 ;和美國專利號5571894和5587458?？贵w片段也可以是線性抗體，如美國專利號5641870中所述。這種線性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
[0190]雙特異性抗體
[0191]雙特異性抗體是對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。示范性雙特異性抗體可結合于同一感興趣多肽的兩種不同表位。其他雙特異性抗體可將感興趣多肽的結合位點與一種或多種其他抗原的結合位點組合。雙特異性抗體可作為全長抗體或作為抗體片段(例如，F(xiàn)(ab’)2雙特異性抗體)來制備。
[0192]制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共同表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，Nature，305:537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四體雜交瘤)產(chǎn)生10種不同抗體分子的可能混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析來純化正確的分子。PCT公布號WO 93/08829和Traunecker等，1991，EMBO J.，10:3655-3659 披露了類似方法。
[0193]根據(jù)不同方法，將具有所需結合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結合位點)融合于免疫球蛋白恒定區(qū)序列。優(yōu)選與含有絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有結合輕鏈所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)出現(xiàn)在至少一個融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物，如果需要還有免疫球蛋白輕鏈的DNA插入單獨的表達載體中，共同轉染到合適的宿主生物體中。在用于構建的不同比例的三種多肽鏈提供最優(yōu)產(chǎn)率的實施方式中，這為調節(jié)三個多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，當表達比例相同的至少兩種多肽鏈導致高產(chǎn)率或該比例沒有特別意義時，可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
[0194]在該方法的一個優(yōu)選實施方式中，雙特異性抗體由一條臂中具有第一結合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈和另一條臂中的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。這種不對稱結構有助于分離所需的雙特異性化合物與不需要的免疫球蛋白鏈組合，因為免疫球蛋白輕鏈僅存在于一半雙特異性分子中提供了一種容易的分離方式。參見，例如，PCT 公布號 WO 94/04690 和 Suresh 等，Meth.Enzymol., 121:210 (1986)。
[0195]根據(jù)美國專利號5，731，168中描述的另一種方法，可以工程改造一對抗體分子之間的界面以盡可能增大從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異源二聚體百分比。優(yōu)選界面包含抗體恒定結構域的CH3結構域的至少一部分。在這種方法中，來自于第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈被較大的側鏈取代(如，酪氨酸或色氨酸)。用較小的氨基酸側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代大的氨基酸側鏈會在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側鏈大小相同或相似的補償“空洞”。這提供了提高異二聚體相對于不良終產(chǎn)物如同二聚體的產(chǎn)率的機制。
[0196]雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異偶聯(lián)物”抗體。例如，異偶聯(lián)物中的一種抗體可偶聯(lián)于親和素，另一種抗體偶聯(lián)于生物素?？刹捎萌魏纬Ｒ?guī)的交聯(lián)方法制備異偶聯(lián)物抗體。合適的交聯(lián)劑和技術是本領域眾所周知的并描述于美國專利號4，676，980。
[0197]從抗體片段制備雙特異性抗體的合適技術技術也是本領域已知的。例如，可以利用化學連接的方法制備雙特異性抗體。某些情況下，雙特異性抗體是通過蛋白水解切割完整抗體以產(chǎn)生F(ab’)2片段而產(chǎn)生的(參見，例如，Brennan等，Science, 229:81 (1985))。這些片段在二巰基復合試劑亞砷酸鈉存在的條件下被還原以穩(wěn)定連位二巰基化合物，防止分子間二硫鍵形成。產(chǎn)生的Fab’片段再被轉化成硫代硝基苯甲酸酯(th1nitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原將一個Fab’ -TNB衍生物轉化成Fab’ -巰基，與等摩爾量的其他Fab’ -TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。
[0198]一些實施方式中，F(xiàn)ab’-SH片段可從大腸桿菌直接回收并化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。例如，完全人源化的雙特異性抗體F (ab’ )2分子可通過Shalaby等，J.Exp.Med.,175 =217-225(1992)描述的方法來制造。各Fab’片段由大腸桿菌單獨分泌并對其進行定向體外化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。
[0199]直接從重組細胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術也已有報道。例如，利用亮氨酸拉鏈可制備出雙特異性抗體。參見，例如，Kostelny等,J.1mmunol.,148:1547-1553 (1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合的方式連接到兩個不同抗體的Fab’部分?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原形成單體，然后再氧化形成抗體異二聚體。這種方法還被用于制備抗體同二聚體。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,90 =6444-6448(1993)所述的〃二體〃技術為制造雙特異性抗體片段提供了另一種機制。該片段包含通過接頭與輕鏈可變結構域(VL)相連的重鏈可變結構域(VH)，所述接頭過短而不能使同一鏈上的兩個結構域之間配對。因此，一個片段中的VH和VL結構域被迫與另一片段的互補VL和VH結構域配對,從而形成兩個抗原結合位點。使用單鏈Fv(sFv) 二聚體制造雙特異性抗體片段的另一種方法描述于Gruber等，J.1mmunol., 152:5368(1994)。
[0200]本發(fā)明還包括二價以上的抗體。例如，可制備三特異性抗體。參見，例如，Tutt等，J.1mmunol.147:60 (1991)。
[0201]抗體純化
[0202]當采用重組技術時，抗體可在分離的宿主細胞內、宿主細胞的壁膜間隙中產(chǎn)生，或從宿主細胞直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在胞內產(chǎn)生抗體，則首先通過，例如，離心或超濾去除顆粒碎片。Carter等,B1Tech, 10:163-167 (1992)描述了分離分泌到大腸桿菌壁膜間隙中的抗體的方法。簡言之，細胞漿在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA和苯基甲磺酰氟(PMSF)存在下解凍約30分鐘。離心去除細胞碎片。如果抗體被分泌到培養(yǎng)基中，那么通常采用市售的蛋白質濃縮濾器如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮這種表達系統(tǒng)的上清液。任何上述步驟中可包含蛋白酶抑制劑如PMSF以抑制蛋白酶解，還可包含抗生素以防止偶發(fā)性污染物的生長。
[0203]可采用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化從細胞制備的抗體組合物。蛋白A是否合適作為親和配體依賴于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fe區(qū)的種類和同種型?？捎玫鞍譇來純化基于人Y 1、γ2或Y 4重鏈的抗體(參見,例如，Lindmark等，J.1mmunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人γ3(參見，例如，Guss等，EMBO J.,5:1567-1575(1986)) ο連接親和配體的最常見基質是瓊脂糖，但也可采用其它基質。與瓊脂糖相比，機械穩(wěn)定的基質如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯的流動速率較快和加工時間較短。如果抗體包含CH3區(qū)，那么可以利用Bakerbond
月旨(新澤西州飛利浦堡的JTB公司(J.Τ.Baker, Phillipsburg, N.J.))進行純化。根據(jù)所回收的抗體，用于蛋白純化的其他技術如利用離子交換柱分級、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅層析、肝素SEPHAR0SE?層析、陰離子或陽離子交換樹脂層析(例如聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦、SDS-PAGE以及硫酸銨沉淀也可以使用。
[0204]初步純化步驟后，對包含感興趣抗體和污染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，該層析使用PH為約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度下進行(例如，約0-0.25M 鹽)。
實施例
[0205]提供以下實施例來闡述，而非限制本發(fā)明。
[0206]實施例1循環(huán)細胞的分離、刺激和裂解
[0207]實體瘤循環(huán)細胞從實體瘤轉移或微轉移的細胞，并包括循環(huán)腫瘤細胞(CTC)、癌癥干細胞(CSC)和/或移行到腫瘤的細胞(例如，循環(huán)內皮祖細胞(CEPC)、循環(huán)內皮細胞(CEC)、循環(huán)前血管生成骨髓細胞、循環(huán)樹突細胞等等)。含有循環(huán)細胞的患者樣品可從任何可接觸的生物流體(例如，血液、尿液、乳頭抽吸物、淋巴液、唾液、細針抽吸物等等)獲得。所述循環(huán)細胞可采用一種或多種分離方法從患者樣品分離，所述方法例如:免疫磁分離(參見，例如，Racila 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 95:4589-4594 (1998) ；Bilkenroth等，Int.J.Cancer, 92:577-582 (2001)),微流體分離(參見，例如,Mohamed 等，IEEE Trans.Nanob1sc1.，3:251-256 (2004) ；Lin 等，摘要編號 5147，第 97 屆 AACR 年會，華盛頓特區(qū)(2006))，F(xiàn)ACS(參見，例如，Mancuso 等，Blood,97:3658-3661 (2001))，密度梯度離心(參見，例如，Baker 等，Clin.Cancer Res.，13:4865-4871 (2003))，以及耗竭法(參見，例如，Meye 等，Int.J.0ncol.,21:521-530 (2002))。
[0208]豐工分離CTC
[0209]免疫磁分離CTC-手工分離后進行激活試驗:
[0210]I)采用已經(jīng)偶聯(lián)于抗-EpCAM單克隆抗體(KLS公司(Kordia Life Sciences);萊頓(Leiden),荷蘭)的磁珠(Dynal M450 ;戴納公司(Dynal AS);奧斯陸，挪威)。
[0211]2)就在使用之前用等體積的含0.01 % BSA的PBS洗滌預涂布的Dyna珠一次。
[0212]3)在Iml樣品中加入25微升預涂布的Dyna珠。
[0213]4)將混合物在2-8 V培育20分鐘同時溫和傾斜和旋轉。
[0214]5)將試管在磁力分離器(MPL-1磁體)上放置2分鐘。
[0215]6)棄去上清液，將與珠結合的細胞重懸于含0.01% BSA的PBS然后磁力分離，以此洗滌三次。
[0216]7)將樣品重懸于100微升刺激緩沖液。
[0217]樣品制備:
[0218]I)將人對象的外周血吸到含I毫克/毫升EDTA的硅化管內。棄去前3_5毫升以避免被刺穿的靜脈釋放的上皮細胞所污染。
[0219]2)在使用前用0.9% NaCl以1:3稀釋I毫升全血。
[0220]制備對照:
[0221]I)將人癌細胞系加入HL-60細胞以制造細胞系對照。
[0222]2)細胞系對照以2.5xl06細胞/毫升的濃度使用。
[0223]豐工分離CEC和CEPC:
[0224]作為一個非限制性例子，可米取Beerepoot 等，Ann.0ncology, 15:139-145 (2004)描述的免疫磁分離/富集技術分離活的CEC和CEPC。簡言之，將外周血與已經(jīng)偶聯(lián)于抗-⑶146單克隆抗體(KLS公司)的磁珠(Dynal IMSOIgG1) —起培育。該抗體識別外周血中的所有內皮細胞譜系，但不識別造血細胞或上皮細胞(George等，J.1mmunol.Meth.,139:65-75(1991))。用偶聯(lián)于合適抗體的磁珠(例如，用Dynal-⑶45珠耗盡白細胞，用Dynal-CDH珠耗盡單核細胞，用Dynal-EpCAM耗盡上皮細胞(加州卡爾斯拜德的英杰公司(Invitrogen ；Carlsbad, CA)))進行正選擇之前可對造血細胞和上皮細胞進行負選擇。在該實施例中僅采用正選擇。
[0225]免疫磁分離CEC和CEPC-手工分離后進行激活試驗:
[0226]I)采用已經(jīng)偶聯(lián)于抗-0)146單克隆抗體(KLS公司)的磁珠(Dynal M450)。
[0227]2)就在使用之前用等體積的含0.01 % BSA的PBS洗滌預涂布的Dyna珠一次。
[0228]3)在Iml樣品中加入25微升預涂布的Dyna珠。
[0229]4)將混合物在2-8 V培育20分鐘同時溫和傾斜和旋轉。
[0230]5)將試管在磁力分離器(MPL-1磁體)上放置2分鐘。
[0231]6)棄去上清液，將與珠結合的細胞重懸于含0.01% BSA的PBS然后磁力分離，以此洗滌三次。
[0232]7)將樣品重懸于100微升刺激緩沖液。
[0233]樣品制備:
[0234]I)將人對象的外周血吸到含I毫克/毫升EDTA的硅化管內。棄去前3_5毫升以避免被刺穿的靜脈釋放的內皮細胞所污染。
[0235]2)在使用前用0.9% NaCl以1:3稀釋I毫升全血。
[0236]制備對照:
[0237]I)將人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)加入HL-60細胞以制造細胞系對照。
[0238]2)細胞系對照以2.5xl06細胞/毫升的濃度使用。
[0239]豐工分離CEPC (無 CEC):
[0240]CEPC是能夠響應各種生血管生成因子而分化成成熟內皮細胞的骨髓衍生祖細胞的循環(huán)亞型?？捎米R別表面標記⑶34的抗體進行選擇來分離CEPC。⑶133是一種區(qū)分不成熟內皮祖細胞(EPC)或原始造血干細胞(HSC)與CEPC的表面標記。使用貼壁培養(yǎng)或磁性微珠從不同來源分離CEPC的各種方法已見諸描述。在本實施例中，采用了 Asahara等，Science, 275:964-967(1997)所述的改進方法。
[0241 ] 免疫磁分離CEPC-手工分離后進行激活試驗:
[0242]I)使用磁珠(Dynal M450⑶34)。這些珠用⑶34表面抗原的特異性單克隆抗體涂布。
[0243]2)就在使用之前用等體積的含0.01 % BSA的PBS洗滌預涂布的Dyna珠一次。
[0244]3)在Iml樣品中加入25微升預涂布的Dyna珠。
[0245]4)將混合物在2-8 V培育20分鐘同時溫和傾斜和旋轉。
[0246]5)將試管在磁力分離器(MPL-1磁體)上放置2分鐘。
[0247]6)棄去上清液，將與珠結合的細胞重懸于含0.01 % BSA的PBS然后磁力分離，以此洗滌三次。
[0248]7)將樣品重懸于100微升刺激緩沖液。
[0249]樣品制備:
[0250]I)將人對象的外周血吸到含I毫克/毫升EDTA的硅化管內。棄去前3_5毫升以避免被刺穿的靜脈釋放的內皮細胞所污染。
[0251]2)用平衡鹽溶液以1:1稀釋10毫升血液。
[0252]3)使4毫升稀釋的血液疊加在10毫升試管內的3毫升菲可帕克(Ficoll-Paque)上。
[0253]4)試管在 18_20°C下 400x g 旋轉 30-40 分鐘。
[0254]5)用無菌巴斯德吸管吸出含有血漿和血小板的上層，不攪動界面上的單核的細胞層。
[0255]6)用無菌移液管將單核的細胞轉移到無菌離心管中。
[0256]7)在細胞中加入6毫升平衡鹽溶液溫和重懸。
[0257]8)混合物在18_20°C下60-1OOx g旋轉10分鐘。
[0258]9)除去上清液并將各管的單核的細胞重懸于I毫升PBS。
[0259]用Veridex 系統(tǒng)分離 CTC、CEC 和 CEPC
[0260]新澤西州沃倫的偉德公司(Veridex, Warren, NJ)出售CellSearch系統(tǒng),該系統(tǒng)由CellPrep系統(tǒng)、CellSearch上皮細胞試劑盒和CellSpotter分析儀構成。CellPrep系統(tǒng)是一種半自動的樣品制備系統(tǒng)(Kagan 等，J.Clin.Ligand Assay, 25:104-110 (2002))。CellSearch上皮細胞試劑盒的構成為:涂布有上皮細胞的特異性抗-EpCAM抗體的鐵磁流體；細胞角蛋白8、18和19的藻紅蛋白-偶聯(lián)抗體；偶聯(lián)于別藻藍蛋白的抗-CD45抗體；DAPI染料；和用于洗滌、透化和重懸細胞的緩沖液。該實施例采用的方法還描述于Allard等，Clin.Cancer Res.，10:6897-6904(2004)。完整的 Veridex 系統(tǒng)可用于 CTC 計數(shù)，或者，用CellPrep系統(tǒng)分離之后通過手工除去樣品可提供一種在分析途徑活化(pathwayactivat1n)之前分離的方法。CTC的數(shù)目可為算法開發(fā)提供信息。
[0261]Veridex系統(tǒng)-CTC富集然后計數(shù):
[0262]I)將7.5毫升血液與6毫升緩沖液混合，800x g離心10分鐘，并置于CellPrep系統(tǒng)上。
[0263]2)儀器吸出上清液后，加入鐵磁流體。
[0264]3)儀器進行培育和隨后的磁力分離步驟。
[0265]4)吸出未結合的細胞和剩余的血漿。
[0266]5)加入染色試劑和透化緩沖液進行熒光染色。
[0267]6)培育系統(tǒng)之后再次機械分離細胞并將其重懸于MagNest細胞呈遞裝置以便使用CellSpotter分析儀進行分析。
[0268]7)將該裝置置于CellSpotter分析儀(一種四色半自動熒光顯微鏡)。
[0269]8)捕獲滿足Veridex規(guī)定標準的圖像并通過基于網(wǎng)絡的瀏覽器顯示以進行最終的手工選擇。
[0270]9)細胞計數(shù)結果表示為每7.5毫升血液的細胞數(shù)。
[0271]Veridex系統(tǒng)-CTC富集然后進行活性測定:
[0272]I)將7.5毫升血液與6毫升緩沖液混合，800x g離心10分鐘，然后置于CellPr印系統(tǒng)上。
[0273]2)儀器吸出上清液后，加入鐵磁流體。
[0274]3)儀器進行培育和隨后的磁力分離步驟。
[0275]4)吸出未結合的細胞和剩余的血漿。
[0276]5)將樣品重懸于100微升刺激緩沖液。
[0277]Veridex系統(tǒng)-CEC和CEPC富集然后進行活性測定:
[0278]l)Veridex提供了一種CellTrack上皮細胞試劑盒，其利用抗-0)146抗體捕獲CEC和CEPC。所述CellTracks上皮細胞試劑盒與用于制備血液樣品的Veridex的CellTracks AutoPrep系統(tǒng)和CellTracks分析儀II聯(lián)用以計數(shù)和表征全血的CEC和CEPC。該方案與CellSearch上皮細胞試劑盒相同。
[0279]樣品制備:
[0280]I)按照制造商的說明把人對象的外周血吸入Cellsave防腐管。棄去前3_5毫升以避免被刺穿的靜脈釋放的上皮或內皮細胞所污染。
[0281]豐工分離CSC:
[0282]已知證據(jù)表明，腫瘤含有一小群具有獨特自我更新和存活機制的假定癌癥干細胞(參見，例如，Sells, Crit.Rev.0ncol.Hematol.,51: 1-28 (2004) ；Reya 等，Nature,414:105-111(2001) ;Dontu 等，Trends Endocrinol.Metal.，15:193-197 (2004);和 Dick，Nature, 423:231-233 (2003))。癌癥干細胞(CSC)可長時間以休眠狀態(tài)存在，這使得它們能抵抗靶向分裂細胞的化療藥。這種癌癥初始群體可表征為在遭受選擇性除去的定向治療時能激活自我更新和存活途徑。已經(jīng)描述過用貼壁培養(yǎng)或磁性微珠分離CSC的過程。在該實施例中，采用了 Cote等，Clin.Can.Res.,12:5615(2006)所述的改進方法。
[0283]免疫磁分離CSC-手工分離后進行激活試驗:
[0284]I)使用磁珠(挪威奧斯陸的戴納公司(Dynal AS ；0slo, Norway))。這些珠用0)34或CD133表面抗原的特異性單克隆抗體涂布。
[0285]2)就在使用之前用等體積的含0.01 % BSA的PBS洗滌預涂布的Dyna珠一次。
[0286]3)在3ml樣品中加入1_107預涂布的Dyna珠。
[0287]4)將混合物在2-8 V培育60分鐘同時溫和傾斜和旋轉。
[0288]5)將混合物分成I毫升一份，并將各個將試管在磁力分離器(MPL-1磁體)上放置至少6分鐘。
[0289]6)棄去上清液，將與珠結合的細胞重懸于含0.01 % BSA的PBS然后磁力分離，以此洗滌三次。
[0290]7)將樣品重懸于100微升刺激緩沖液。
[0291]樣品制備:
[0292]I)征得患者同意后，從早期乳腺癌患者獲得骨髓標本。
[0293]2)如 Bauer et al.，Clin.Can.Res., 6:3552-3559 (2000))所述加工骨髓抽吸物。通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心,采用Beckman GS-6離心機在4000x g離心35分鐘并用PBS洗滌兩次來富集含有任何彌散性腫瘤細胞的單核細胞組分。
[0294]分離的CTC的細胞刺激和裂解:
[0295]細胞刺激:
[0296]I)在細胞中加入生長因子TGF-a (10nM)、調蛋白(10nM)和/或IGF(10nM)并在37 °C培育5分鐘。
[0297]用藥物處理進行細胞刺激:
[0298]1)37°C用治療有效濃度的赫賽汀、拉帕它尼(Lapatanib)、塔可弗(Tarceva)和/或雷帕霉素類似物處理樣品30分鐘。
[0299]2)然后加入生長因子TGF-a (10nM)、調蛋白(10nM)和/或IGF(10nM)刺激細胞并在37 °C培育5分鐘。
[0300]用藥物處理進行細胞刺激(反饋環(huán)(feedback loop)):
[0301]I)樣品用治療有效濃度的赫賽汀、拉帕它尼(Lapatanib)、塔可弗(Tarceva)和/或雷帕霉素類似物在37°C處理30分鐘。
[0302]2)然后用 TGF-a (10nM)、調蛋白(10nM)和 / 或 IGF(10nM)刺激細胞并在 37°C培育120分鐘。
[0303]采用以下方案裂解刺激過的CTC:
[0304]I)將表I中所列試劑混合來新鮮制備新鮮的裂解緩沖液。
[0305]2)最后的洗滌后在冰上將細胞重懸于100微升冷卻的緩沖液。
[0306]3)在冰上培育30分鐘。
[0307]4)混合物在微量離心機(microfuge)中以最大速度旋轉10分鐘以分離珠和裂解液。
[0308]5)將裂解液轉移到新的試管中進行測定或儲存于_80°C。
[0309]M I
[0310]裂解緩沖液配方(1ml)
[0311]
【權利要求】
1.一種進行具有高動態(tài)范圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括: (a)將細胞提取物與該細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上； (b)將所述眾多捕獲的分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物，其中所述檢測抗體包含: (1)眾多用易化部分標記的活化狀態(tài)非依賴性抗體，和 (2)眾多用信號放大對的第一成員標記的活化狀態(tài)依賴性抗體， 其中所述易化部分產(chǎn)生導向信號放大對的第一成員并與其反應的氧化劑； (c)將眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第二成員一起培育以產(chǎn)生放大信號；和 (d)檢測信號放大對的第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號， 其中所述方法不用于疾病的診斷或治療。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞提取物包括實體瘤循環(huán)細胞的提取物。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細胞是通過免疫磁分離從患者樣品中分離的。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述患者樣品選自下組:全血，血清，血漿，尿液，痰液，支氣管灌洗液，淚液，乳頭抽吸物，淋巴液，唾液，細針抽吸物，以及它們的組合。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離細胞選自下組:循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)內皮細胞，循環(huán)內皮祖細胞，癌癥干細胞，以及它們的組合。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離細胞用生長因子體外刺激。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述分離細胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥選自下組:單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，免疫抑制劑，以及它們的組合。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述分離細胞用細胞因子刺激之后被裂解以產(chǎn)生細胞提取物。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述一種或多種分析物包括眾多信號轉導分子。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持體選自下組:玻璃，塑料，芯片，針，濾器，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體還包含可檢測部分。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述可檢測部分是熒光團。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述可檢測部分的量與一種或多種分析物的量相關。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用導向部分直接標記。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體通過偶聯(lián)于活化狀態(tài)非依賴性抗體的寡核苷酸與偶聯(lián)于導向部分的互補寡核苷酸之間的雜交而用導向部分標記。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放大對的第一成員直接標記。
18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)依賴性抗體通過偶聯(lián)于活化狀態(tài)依賴性抗體的結合對第一成員與偶聯(lián)于信號放大對的第一成員的結合對第二成員之間的結合而用信號放大對的第一成員標記。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述結合對的第一成員是生物素。
20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述結合對的第二成員是鏈霉抗生物素蛋白。
21.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述導向部分是葡萄糖氧化酶。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述氧化劑是過氧化氫(H2O2)15
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第一成員是過氧化物酶。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶(HRP) ο
25.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第二成員是酪酰胺試劑。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺試劑是生物素-酪酰胺。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述放大信號由過氧化物酶氧化生物素-酪酰胺產(chǎn)生活化的酪酰胺而生成。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺是直接檢測的。
29.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺在加入信號檢測試劑后檢測。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋白-標記的熒光團。
31.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋白-標記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述顯色試劑是3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
33.一種具有高動態(tài)范圍的陣列，其包含細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上。
34.如權利要求33所述的陣列，其特征在于，所述細胞提取物包括實體瘤循環(huán)細胞的提取物。
35.如權利要求34所述的陣列，其特征在于，所述細胞是通過免疫磁分離從患者樣品中分離的。
36.如權利要求35所述的陣列，其特征在于，所述患者樣品選自下組:全血，血清，血衆(zhòng)，尿液，痰液，支氣管灌洗液，淚液，乳頭抽吸物，淋巴液，唾液，細針抽吸物，以及它們的組口 ο
37.如權利要求35所述的陣列，其特征在于，所述分離細胞選自下組:循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)內皮細胞，循環(huán)內皮祖細胞，癌癥干細胞，以及它們的組合。
38.如權利要求35所述的陣列，其特征在于，所述分離細胞用生長因子體外刺激。
39.如權利要求38所述的陣列，其特征在于，所述分離細胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。
40.如權利要求39所述的陣列，其特征在于，所述抗癌藥選自下組:單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，免疫抑制劑，以及它們的組合。
41.如權利要求38所述的陣列，其特征在于，所述分離細胞用細胞因子刺激之后被裂解以產(chǎn)生細胞提取物。
42.如權利要求33所述的陣列，其特征在于，所述一種或多種分析物包括眾多信號轉導分子。
43.如權利要求33所述的陣列，其特征在于，所述固相支持體選自下組:玻璃，塑料，芯片，針，濾器，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。
44.如權利要求33所述的陣列，其特征在于，各稀釋系列包含至少3種遞減的捕獲抗體濃度。
45.如權利要求33所述的陣列，其特征在于，各稀釋系列包含至少6種遞減的捕獲抗體濃度。
46.如權利要求33所述的陣列，其特征在于，各稀釋系列內的捕獲抗體連續(xù)稀釋至少2倍。
47.如權利要求33所述的陣列，其特征在于，所述一種或多種分析物在約I個細胞內檢測。
48.一種進行具有高動態(tài)范圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括: (a)將細胞提取物與該細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上； (b)將眾多捕獲的分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物； (c)將眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第一和第二成員一起培育以產(chǎn)生放大信號；和 (d)檢測信號放大對的第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號， 其中所述方法不用于疾病的診斷或治療。
49.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述細胞提取物包括實體瘤循環(huán)細胞的提取物。
50.如權利要求49所述的方法，其特征在于，所述細胞是通過免疫磁分離從患者樣品中分離的。
51.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述患者樣品選自下組:全血，血清，血漿，尿液，痰液，支氣管灌洗液，淚液，乳頭抽吸物，淋巴液，唾液，細針抽吸物，以及它們的組口 ο
52.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述分離細胞選自下組:循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)內皮細胞，循環(huán)內皮祖細胞，癌癥干細胞，以及它們的組合。
53.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述分離細胞用生長因子體外刺激。
54.如權利要求53所述的方法，其特征在于，所述分離細胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。
55.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥選自下組:單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，免疫抑制劑，以及它們的組合。
56.如權利要求53所述的方法，其特征在于，所述分離細胞用細胞因子刺激之后被裂解以產(chǎn)生細胞提取物。
57.如權利要求48所述的方法,其特征在于，所述一種或多種分析物包含眾多信號轉導分子。
58.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述固相支持體選自下組:玻璃，塑料，芯片，針，濾器，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。
59.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述檢測抗體包括結合對的第一成員。
60.如權利要求59所述的方法，其特征在于，所述結合對第一成員是生物素。
61.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第一成員包括結合對的第二成員。
62.如權利要求61所述的方法，其特征在于，所述結合對的第二成員是鏈霉抗生物素蛋白。
63.如權利要求61所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第一成員是過氧化物酶。
64.如權利要求63所述的方法，其特征在于，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶(HRP) ο
65.如權利要求63所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第二成員是酪酰胺試劑。
66.如權利要求65所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺試劑是生物素-酪酰胺。
67.如權利要求66所述的方法，其特征在于，所述放大信號由過氧化物酶氧化生物素-酪酰胺產(chǎn)生活化的酪酰胺而生成。
68.如權利要求67所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺是直接檢測的。
69.如權利要求67所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺在加入信號檢測試劑后檢測。
70.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋白-標記的熒光團。
71.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋白-標記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。
72.如權利要求71所述的方法，其特征在于，所述顯色試劑是3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
【文檔編號】G01N33/543GK104198705SQ201410364918
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2007年9月20日 優(yōu)先權日:2006年9月21日
【發(fā)明者】J·哈維, S·辛格, P·金, X·劉, R·巴罕姆, L·劉 申請人:雀巢產(chǎn)品技術援助有限公司