一種甘草藥材的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥材質(zhì)量檢測領域，具體涉及一種甘草藥材的質(zhì)量檢測方法。該方法包括對甘草苷有效成分總量的測定步驟以及農(nóng)藥殘留量的測定步驟。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)理化特性的鑒別方法的操作復雜和局限性以及質(zhì)量難以調(diào)控的技術問題，以提供了一種準確度高，操作簡便快速，成本低廉的檢測方法，具有良好的應用前景和經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種甘草藥材的檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥材質(zhì)量檢測領域，具體涉及一種甘草藥材的質(zhì)量檢測方法。

【背景技術】
[0002]甘草為多年生草本植物甘草(Glycyrrhiza urlensis Fisch.)的根及根莖,性味甘平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，是臨床上常用的藥材之一，具有“十方九草”的美稱。藥理研究表明甘草具有補脾益氣、潤肺止咳、通經(jīng)脈、利氣血、清熱解毒、止血祛痰潤肺的功效，臨床上被廣泛地用于治療胃潰瘍和十二指腸潰瘍、咽喉腫痛、支氣管炎、咳嗽、關節(jié)炎、過敏等疾病及用于保肝、降血脂、抗癌、抗干擾素誘生及增強細胞免疫調(diào)節(jié)等。甘草含有多種化學成分，主要成分有甘草酸、甘草苷等?，F(xiàn)代研究表明甘草含有的成分甘草酸和甘草苷是甘草具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥等多種藥理活性。具有廣泛的生理活性作用，因此所含甘草酸、甘草苷含量的多少常作為甘草質(zhì)量控制的重要指標。
[0003]近幾年甘草的市場需求量持續(xù)增加，野生資源逐年減少，人工栽培發(fā)展緩慢，使得甘草資源蘊藏量和產(chǎn)量都在大幅下降。導致市場上出現(xiàn)了很多偽品，其中不少偽品的農(nóng)藥殘留量超標爆表，給甘草的質(zhì)量、用藥的安全性及有效性帶來了很大的沖擊，已成為制約甘草系列藥材開發(fā)的瓶頸。
[0004]目前，正品甘草的有效檢測方法是傳統(tǒng)的形態(tài)特征和理化特性的鑒別方法，具有一定的局限性，不足以從整體上控制甘草的質(zhì)量，作為一味臨床常用中藥，其真?zhèn)蝺?yōu)劣受其理化指標、農(nóng)藥殘留量多等諸多因素的影響，因此有必要建立一種科學的質(zhì)量檢測方法對甘草的質(zhì)量進行評價。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于現(xiàn)有技術中甘草檢測方法復雜，質(zhì)量難以調(diào)控的問題，進而提供一種準確度高，簡單、快速的檢測甘草的方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明提供了一種甘草的檢測方法，該方法包括如下甘草酸、甘草苷的含量測定步驟以及農(nóng)藥殘留量的測定步驟，其中:
[0008]一種甘草的檢測方法，其特征在于，該方法包括如下甘草苷有效成分總量的測定步驟以及農(nóng)藥殘留量的測定步驟，其中，
[0009]A:所述甘草酸、甘草苷總量的測定包括如下步驟:
[0010](I)精密稱取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品，加70%乙醇分別制成每Iml含甘草苷20 μ g、甘草酸銨0.2mg的溶液，即為對照品溶液；
[0011](2)精密稱取待測甘草藥材粉末0.2g，精密加入70%乙醇100ml，稱定重量并超聲處理，放冷再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，濾過并取續(xù)濾液，即得供試品溶液；
[0012](3)按照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以0.05 %的磷酸溶液為流動相B，按照如下程序進行梯度洗脫:從0-8min，流動相A:流動相B的體積比為19%:81%；/A8-35min，流動相A:流動相B的體積比由19%:81 % — 50%:50% ;從35-36min，流動相A:流動相B的體積比由50%:50%^ 100%:0 ;從36_40min，流動相A:流動相B的體積比由100%:0 - 19%:81% ;檢測波長為237nm ；
[0013]分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定；理論板數(shù)按甘草苷峰計算應不低于5000 ；
[0014]B:所述農(nóng)藥殘留量的測定包括如下步驟:
[0015](I)精密稱取三苯基磷酸酯適量，加丙酮制成每Iml含100μ g三苯基磷酸酯的溶液，作為內(nèi)標貯備液；
[0016]分別精密量取各農(nóng)藥對照品貯備溶液Iml及所述內(nèi)標貯備液1ml，加丙酮定容至100ml，作為混合對照品貯備溶液；分別精密量取適量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不同濃度的溶液，作為混合對照品溶液；
[0017]另取核糖酸內(nèi)酯適量，加乙腈溶解制成每Iml含20mg核糖酸內(nèi)酯的溶液，另取山梨醇適量，加水溶解制成每Iml含山梨醇1mg的溶液；分別精密量取上述核糖酸內(nèi)酯、山梨醇溶液各Iml混勻,加乙腈定容至1ml,作為分析保護劑；
[0018](2)精密稱取待測藥材細粉10g，并加入氯化鈉Ig混勻，精密加入丙酮100ml，冰浴超聲處理30分鐘，離心，將上清液迅速移入裝有Ig無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，放置30分鐘；隨后精密量取上述溶液60ml減壓濃縮至近干，并加入體積比為1:1的環(huán)已烷-乙酸乙酯溶液溶解樣品并定容至10ml，過濾后取濾液經(jīng)GPC凝膠滲透色譜凈化，以體積比為1:1的環(huán)已烷-乙酸乙酯溶液為流動相洗脫，收集洗脫液，移入KD瓶中，減壓濃縮至近干；
[0019]向上述樣品中加入體積比為1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并轉移至石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以體積比為1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，隨后加入所述內(nèi)標貯備液5μ 1，加乙腈定容至1ml，作為供試品溶液；
[0020](3)精密量取上述各濃度混合對照品溶液及供試品溶液各400 μ L，并分別加入所述分析保護劑100 μ L混勻，隨后分別精密吸取I μ L，進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定；其中，
[0021]所述氣相色譜分析條件為:取規(guī)格為30mX0.25mmX0.25um的彈性石英毛細管柱DB 17ms,以高純氦氣為載氣，柱流速1.3ml/分鐘，進樣量I μ I，采用高壓不分流進樣，設置進樣口溫度為230°C，升溫程序具體為:初始溫度60°C，以30°C /分鐘升至120°C、以10°C /分鐘升至200°C、以2°C /分鐘升至230°C、以30°C /分鐘升至300°C，并保持7分鐘；
[0022]更進一步的，所述EI源質(zhì)譜測定的條件為:設置電子能量70eV，離子源溫度230°C，接口溫度 250°C。
[0023]其中所述農(nóng)藥殘留量的測定中，所述GPC凝膠滲透色譜凈化步驟的條件具體為:填料為B1-Beads S-X3200-400目，凈化柱為2.5mmX 40cm，具體洗脫參數(shù)為凈化去雜900s，目標物收集1200s，柱子清洗300s。
[0024]更進一步的，所述農(nóng)藥殘留量的測定中，農(nóng)藥對照品包括敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β-六六六、Y-六六六、δ-六六六、氧化樂果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地蟲硫磷、磷胺1、樂果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏劑、克菌丹、磷胺I1、甲基對硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜靈、三唑酮、毒死蜱、馬拉硫磷、殺螟硫磷、對硫磷、二甲戊靈、順式環(huán)氧七氯、反式環(huán)氧七氯、三唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、順式硫丹、順式氯丹、反式硫丹、pp’ -DDE,PP' -DDD、OP’ -DDT,PP' -DDT、狄氏劑、
殺撲磷、異狄氏劑、乙硫磷、三苯基磷酸酯、聯(lián)苯菊酯、硫丹硫酸酯、異菌脲、甲氰菊酯、三氯殺螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯殺螨砜、伏殺硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
[0025]步驟A中，所述甘草酸、甘草苷含量的測定中，所述待測藥材的粒徑為180-2000 μm。
[0026]更進一步的，步驟B中，所述農(nóng)藥殘留量的測定中，所述待測藥材的粒徑為180-2000 μm。
[0027]所述甘草酸、甘草苷總量的測定步驟中，所述超聲處理的條件為:功率250W，頻率40kHz，超聲處理30分鐘。
[0028]本發(fā)明所述方法通過對甘草所含的甘草酸、甘草苷含量的測定以及對甘草農(nóng)藥殘留量的檢測，進行甘草真?zhèn)蝺?yōu)劣的判定標準。并通過高效液相色譜法測定甘草酸、甘草苷含量，所述方法不僅準確且簡單易行。本發(fā)明所述方法通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方式檢測藥材的殘留農(nóng)藥量，不僅檢測的準確度高，方法簡單、快速，而且通過對檢測條件的特定篩選，可一次性將甘草中常見的農(nóng)藥種類進行一次性的有效檢測，所述方法準確率及實用效果均較好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實驗例并結合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中:
[0030]圖1是本發(fā)明實施例2中農(nóng)藥標準品的全掃描氣相色譜圖；
[0031]圖2是本發(fā)明實施例2中農(nóng)藥標準品的0-10分鐘掃描氣相色譜圖；
[0032]圖3是本發(fā)明實施例2中農(nóng)藥標準品的10-20分鐘掃描氣相色譜圖；
[0033]圖4是本發(fā)明實施例2中農(nóng)藥標準品的20-40分鐘掃描氣相色譜圖。

【具體實施方式】
[0034]實施例1甘草中甘草酸、甘草苷總量的測定
[0035]1.藥材樣品收集了各地甘草樣品，供試藥材產(chǎn)地批次分別選自:民樂杏寨鄉(xiāng)、金昌雙灣鄉(xiāng)、金昌河西堡、金昌三岔鄉(xiāng)、民勤大壩3年生、民勤大壩4年生、民勤昌寧2年生、民勤昌寧3年生、民勤昌寧4年生、民勤石峰4年生、民勤東壩3年生、金塔I年生、金塔2年生、金塔3年生、金塔3批次，分別標注為1-3、景泰、敦煌3年生、肅南、民樂、民勤昌寧、慶陽、莊浪、蘭州、古浪、榆中北山、榆中北山、永登秦王川、清水、宕昌、岷縣、隴西菜子鎮(zhèn)、定西、積石山、環(huán)縣、永靖、臨洮。
[0036]2.方法本項目的研究采用HPLC梯度波長法同時測定甘草中甘草酸、甘草苷有效成分的含量，具體步驟如下:
[0037]精密稱取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品，加70%乙醇分別制成每Iml含甘草苷20 μ g、甘草酸銨0.2mg的溶液，即為對照品溶液；
[0038]精密稱取待測甘草藥材粉末0.2g，精密加入70%乙醇100ml，稱定重量并超聲處理，放冷再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，濾過并取續(xù)濾液，即得供試品溶液；
[0039]按照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以0.05 %的磷酸溶液為流動相B，按照如下程序進行梯度洗脫:從0-8min，流動相A:流動相B的體積比為19%:81% i8-35min，流動相A:流動相B的體積比由19%:81% — 50%:50% ;從35-36min，流動相A:流動相B的體積比由50%:50%^ 100%:0 ;從36_40min，流動相A:流動相B的體積比由100%:0 - 19%:81% ;檢測波長為237nm ；
[0040]分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定；理論板數(shù)按甘草苷峰計算應不低于5000 ；
[0041]3.結果對42批進行測定，具體結果見表1如下。
[0042]表1甘草規(guī)格與含量測定)
[0043]

【權利要求】
1.一種甘草的檢測方法，其特征在于，該方法包括如下甘草酸、甘草苷有效成分總量的測定步驟以及農(nóng)藥殘留量的測定步驟，其中， A:所述甘草酸、甘草苷總量的測定包括如下步驟: (1)精密稱取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品，加70%乙醇分別制成每Iml含甘草苷20 μ g、甘草酸銨0.2mg的溶液，即為對照品溶液； (2)精密稱取待測甘草藥材粉末0.2g，精密加入70%乙醇100 ml，稱定重量并超聲處理，放冷再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，濾過并取續(xù)濾液，即得供試品溶液； (3)按照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以0.05 %的磷酸溶液為流動相B，按照如下程序進行梯度洗脫:從0-8min，流動相A:流動相B的體積比為19%:81% ;從8-35min，流動相A:流動相B的體積比由19%:81% — 50%:50% ;從35-36min，流動相A:流動相B的體積比由50%:50%^ 100%:0 ;從36_40min，流動相A:流動相B的體積比由100%:0 - 19%:81% ;檢測波長為237nm ； 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定；理論板數(shù)按甘草苷峰計算應不低于5000 ； B:所述農(nóng)藥殘留量的測定包括如下步驟: (1)精密稱取三苯基磷酸酯適量，加丙酮制成每Iml含100μ g三苯基磷酸酯的溶液，作為內(nèi)標貯備液； 分別精密量取各農(nóng)藥對照品貯備溶液Iml及所述內(nèi)標貯備液1ml，加丙酮定容至100ml，作為混合對照品貯備溶液；分別精密量取適量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不同濃度的溶液，作為混合對照品溶液； 另取核糖酸內(nèi)酯適量，加乙腈溶解制成每Iml含20mg核糖酸內(nèi)酯的溶液，另取山梨醇適量，加水溶解制成每Iml含山梨醇1mg的溶液；分別精密量取上述核糖酸內(nèi)酯、山梨醇溶液各Iml混勻,加乙腈定容至1ml,作為分析保護劑； (2)精密稱取待測藥材細粉10g，并加入氯化鈉Ig混勻，精密加入丙酮100ml，冰浴超聲處理30分鐘，離心，將上清液迅速移入裝有Ig無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，放置30分鐘；隨后精密量取上述溶液60ml減壓濃縮至近干，并加入體積比為1:1的環(huán)已烷-乙酸乙酯溶液溶解樣品并定容至10ml，過濾后取濾液經(jīng)GPC凝膠滲透色譜凈化，以體積比為1:1的環(huán)已烷-乙酸乙酯溶液為流動相洗脫，收集洗脫液，移入KD瓶中，減壓濃縮至近干； 向上述樣品中加入體積比為1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并轉移至石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以體積比為1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，隨后加入所述內(nèi)標貯備液5μ 1，加乙腈定容至1ml，作為供試品溶液； (3)精密量取上述各濃度混合對照品溶液及供試品溶液各400μ L，并分別加入所述分析保護劑10yL混勻，隨后分別精密吸取lyL，進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定；其中， 所述氣相色譜分析條件為:取規(guī)格為30mX0.25mmX0.25um的彈性石英毛細管柱DB 17ms,以高純氦氣為載氣，柱流速1.3ml/分鐘，進樣量I μ 1，采用高壓不分流進樣，設置進樣口溫度為230°C，升溫程序具體為:初始溫度60°C，以30°C /分鐘升至120°C、以10°C /分鐘升至200°C、以2°C /分鐘升至230°C、以30°C /分鐘升至300°C，并保持7分鐘； 所述EI源質(zhì)譜測定的條件為:設置電子能量70eV，離子源溫度230°C，接口溫度250。。。
2.根據(jù)權利要求1所述的甘草的檢測方法，其特征在于，所述農(nóng)藥殘留量的測定中，所述GPC凝膠滲透色譜凈化步驟的條件具體為:填料為B1-Beads S-X3200-400目，凈化柱為2.5mmX 40cm，具體洗脫參數(shù)為凈化去雜900s，目標物收集1200s，柱子清洗300s。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的甘草的檢測方法，其特征在于，所述農(nóng)藥殘留量的測定中，所述農(nóng)藥對照品包括敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β -六六六、Y -六六六、δ -六六六、氧化樂果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地蟲硫磷、磷胺1、樂果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏劑、克菌丹、磷胺I1、甲基對硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜靈、三唑酮、毒死蜱、馬拉硫磷、殺螟硫磷、對硫磷、二甲戊靈、順式環(huán)氧七氯、反式環(huán)氧七氯、三唑醇Α、三唑醇B、反式氯丹、順式硫丹、順式氯丹、反式硫丹、PP’ -DDE,PP' -DDD、0P’ -DDT,PP' -DDT、狄氏劑、殺撲磷、異狄氏劑、乙硫磷、三苯基磷酸酯、聯(lián)苯菊酯、硫丹硫酸酯、異菌脲、甲氰菊酯、三氯殺螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯殺螨砜、伏殺硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的甘草的檢測方法，其特征在于，所述甘草酸、甘草苷含量的測定中，所述待測藥材的粒徑為180-2000 μ m。
5.根據(jù)權利要求1-4任一所述的甘草的檢測方法，其特征在于，所述農(nóng)藥殘留量的測定中，所述待測藥材的粒徑為180-2000 μ m。
6.根據(jù)權利要求1-4任一所述的甘草的檢測方法，其特征在于，所述甘草酸、甘草苷總量的測定步驟中，所述超聲處理的條件為:功率250W，頻率40kHz，超聲處理30分鐘。
【文檔編號】G01N30/02GK104198599SQ201410373582
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權日:2014年7月31日
【發(fā)明者】宋平順, 李登鵬, 李波, 韓斌, 趙建邦, 陳杰, 何祿仁, 楊錫, 李士博, 趙端瑋 申請人:甘肅中天藥業(yè)有限責任公司