一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法
【專(zhuān)利摘要】一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法，涉及一種初步篩選轉(zhuǎn)基因母羊的方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因羊質(zhì)量檢測(cè)方法中存在的取材困難，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)的技術(shù)問(wèn)題。方法：一、采集TLR4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)；二、用多聚甲醛固定，然后依次用Triton-100、HCl、BSA封閉液處理；三、經(jīng)PBS吹洗，加入一抗，孵育過(guò)夜，然后于二抗中孵育，染色，制片，顯微鏡觀察并拍照；四、采用圖像分析軟件將耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析比較，選擇與非轉(zhuǎn)基因母羊相比無(wú)顯著性差異的TLR4轉(zhuǎn)基因母羊耳成纖維細(xì)胞，即完成。本發(fā)明應(yīng)用于初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種初步篩選轉(zhuǎn)基因母羊的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 自1982年轉(zhuǎn)基因鼠問(wèn)世W來(lái)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在疾病模型、醫(yī)藥、品種培育、環(huán)境保護(hù) 及資源保藏等領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)展。隨著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用的不斷擴(kuò)大和人們對(duì)生物安 全的擔(dān)憂和關(guān)注，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物安全研究應(yīng)運(yùn)而生。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物安全研究立足于轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物及其產(chǎn)品的潛在風(fēng)險(xiǎn)，它與目的基因及其操作方式密切相關(guān)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的目的 基因和表達(dá)產(chǎn)物，W及在長(zhǎng)期使用與積累過(guò)程中，都有可能帶來(lái)新的風(fēng)險(xiǎn)。為防范轉(zhuǎn)基因生 物對(duì)環(huán)境及人類(lèi)健康的風(fēng)險(xiǎn)，并促進(jìn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的每一環(huán)節(jié) 都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)密的檢測(cè)和評(píng)價(jià)，盡可能地防范一切有害于人類(lèi)健康、動(dòng)物健康和環(huán)境安全的 因素。
[0003] 在當(dāng)前動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在不同程度上表現(xiàn)出生理異常和缺陷，一 直是研究者們面對(duì)的最棘手的問(wèn)題之一，而該些問(wèn)題與全基因組DNA甲基化異常導(dǎo)致的癥 狀非常相似，而且在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中也檢測(cè)到一些甲基化水平異常的現(xiàn)象，DNA甲基化修飾成 為體細(xì)胞重新編程領(lǐng)域的主要內(nèi)容之一，因此分析全基因組DNA甲基化水平變化應(yīng)該是探 討轉(zhuǎn)基因動(dòng)物缺陷的主要任務(wù)之一，進(jìn)而評(píng)估轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生物安全性。DNA甲基化是最基 本的表觀遺傳修飾方式之一，對(duì)哺乳動(dòng)物的發(fā)育至關(guān)重要。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn) 移酶值nmts)的作用下，由S-腺巧甲硫氨酸（SAM)作為甲基供體，在基因組內(nèi)CpG二核巧 酸中胞嚼巧的5位碳原子加上一個(gè)甲基基團(tuán)巧mC)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu) 象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化分為 維持甲基化和從頭甲基兩種模式，參與很多重要的發(fā)育事件，例如，基因表達(dá)調(diào)控、基因組 印跡、X染色體失活及異染色質(zhì)的形成。在細(xì)胞分化的過(guò)程中，基因的甲基化狀態(tài)將遺傳給 后代細(xì)胞。由于DNA甲基化與人類(lèi)發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致 抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活問(wèn)題，為此DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究 內(nèi)容。
[0004] 通過(guò)顯微注射方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因羊，外源基因的隨機(jī)插入，W及目的基因過(guò)表達(dá)， 是否影響繁殖性能尚不清楚。另外，顯微操作也是影響全基因組DNA甲基化水平的重要因 素。由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物稀缺，尤其是大家畜動(dòng)物，因此評(píng)估轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁殖性能困難重重，女口 取材困難，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等。本發(fā)明將通過(guò)培養(yǎng)耳組織成纖維細(xì)胞，采用免疫英光染色的方 法，利用confocal采集圖片，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因羊和非轉(zhuǎn)基因羊耳成纖維細(xì)胞全基因組甲基化水 平差異，來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)基因母羊繁殖能力，W創(chuàng)建新的評(píng)估方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因羊質(zhì)量檢測(cè)方法中存在的取材困難，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)的 技術(shù)問(wèn)題，從而提供一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法。
[0006] 本發(fā)明的一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法是按W下步驟進(jìn)行：
[0007] -、采集化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后得 到纖維細(xì)胞制片；
[0008] 二、用體積百分濃度為4%的多聚甲酵固定耳成纖維細(xì)胞至少30分鐘，然后依次 用體積百分濃度為1 %的Triton-100處理30分鐘、體積百分濃度為1 %的肥1處理30分 鐘、2mg/mL的BSA封閉液封閉30分鐘；
[0009] H、將耳成纖維細(xì)胞經(jīng)PBS吹洗3次，然后加入一抗，4C賠育過(guò)夜，然后于FITC標(biāo) 記的抗小鼠二抗中37C賠育1.化，接著于楓化丙旋中室溫染色lOmin，制片，Con化cal顯微 鏡觀察并拍照；
[0010] 四、采用圖像分析軟件將化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行 英光強(qiáng)度定量分析比較，選擇與非轉(zhuǎn)基因母羊相比無(wú)顯著性差異的化R4轉(zhuǎn)基因母羊耳成 纖維細(xì)胞，即完成可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的初步篩選。
[0011] 本發(fā)明包括W下有益效果：
[0012] 受到目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)水平的限制，外源基因的整合效率非常低，轉(zhuǎn)基因家畜的數(shù) 量非常稀少，所W轉(zhuǎn)基因家畜的繁殖性能顯的尤為重要，直接關(guān)系到轉(zhuǎn)基因家畜自身健康 狀況和后代擴(kuò)群效率。該方法的建立從分子水平直接檢測(cè)體細(xì)胞的全基因組甲基化水平， 進(jìn)而篩選為繁殖能力正常的轉(zhuǎn)基因羊提供科學(xué)依據(jù)。經(jīng)繁殖生產(chǎn)驗(yàn)證，本方法具有一定的 準(zhǔn)確性和實(shí)用性，是一種高效便捷的初步篩選具有正常繁殖性能轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新方法。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為試驗(yàn)一中化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞免疫英光染色 圖片；
[0014] 圖2為試驗(yàn)一中化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞的英光強(qiáng)度圖。

【具體實(shí)施方式】

【具體實(shí)施方式】 [0015] 一；本實(shí)施方式的一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法 是按W下步驟進(jìn)行：
[0016] 一、采集化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后得 到纖維細(xì)胞制片；
[0017] 二、用體積百分濃度為4%的多聚甲酵固定耳成纖維細(xì)胞至少30分鐘，然后依次 用體積百分濃度為1 %的Triton-100處理30分鐘、體積百分濃度為1 %的肥1處理30分 鐘、2mg/mL的BSA封閉液封閉30分鐘；
[0018] H、將耳成纖維細(xì)胞經(jīng)PBS吹洗3次，然后加入一抗，4C賠育過(guò)夜，然后于FITC標(biāo) 記的抗小鼠二抗中37C賠育1.化，接著于楓化丙旋中室溫染色lOmin，制片，Con化cal顯微 鏡觀察并拍照；
[0019] 四、采用圖像分析軟件將化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行 英光強(qiáng)度定量分析比較，選擇與非轉(zhuǎn)基因母羊相比無(wú)顯著性差異的化R4轉(zhuǎn)基因母羊耳成 纖維細(xì)胞，即完成可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的初步篩選。
[0020] 本實(shí)施方式包括W下有益效果：
[0021] 受到目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)水平的限制，外源基因的整合效率非常低，轉(zhuǎn)基因家畜的數(shù) 量非常稀少，所W轉(zhuǎn)基因家畜的繁殖性能顯的尤為重要，直接關(guān)系到轉(zhuǎn)基因家畜自身健康 狀況和后代擴(kuò)群效率。該方法的建立從分子水平直接檢測(cè)體細(xì)胞的全基因組甲基化水平， 進(jìn)而篩選為繁殖能力正常的轉(zhuǎn)基因羊提供科學(xué)依據(jù)。經(jīng)繁殖生產(chǎn)驗(yàn)證，本方法具有一定的 準(zhǔn)確性和實(shí)用性，是一種高效便捷的初步篩選具有正常繁殖性能轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新方法。

【具體實(shí)施方式】 [0022] 二；本實(shí)施方式與一不同的是；步驟H中一抗為5-甲 基胞嚼巧。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0023] H ;本實(shí)施方式與一或二不同的是：步驟四所述圖像 分析軟件為EZ-Cl化eeViewer。其它與一或二相同。
[0024] 通過(guò)W下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：
[00巧]試驗(yàn)一；本試驗(yàn)的一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法是按W下步驟 進(jìn)行：
[0026] 一、采集化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后得 到纖維細(xì)胞制片；
[0027] 二、用體積百分濃度為4%的多聚甲酵固定耳成纖維細(xì)胞至少30分鐘，然后依次 用體積百分濃度為1 %的Triton-100處理30分鐘、體積百分濃度為1 %的肥1處理30分 鐘、2mg/mL的BSA封閉液封閉30分鐘；
[0028] H、將耳成纖維細(xì)胞經(jīng)PBS吹洗3次，然后加入一抗，4C賠育過(guò)夜，然后于FITC標(biāo) 記的抗小鼠二抗中37°C賠育1.化，接著于楓化丙旋中室溫染色I(xiàn)Omin,制片，Con化cal顯微 鏡觀察并拍照；
[0029] 四、采用圖像分析軟件將化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行 英光強(qiáng)度定量分析比較，選擇與非轉(zhuǎn)基因母羊相比無(wú)顯著性差異的化R4轉(zhuǎn)基因母羊耳成 纖維細(xì)胞，即完成可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的初步篩選。
[0030] 本試驗(yàn)中化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞免疫英光染色圖片如 圖1所示，圖中TG表示轉(zhuǎn)化R4基因羊，WT表示非轉(zhuǎn)基因羊，5-Mec為5甲基胞嚼巧，在圖片 顯示綠色英光，DNA就是細(xì)胞核，顯示紅色英光，Merge是綠色英光和紅色英光疊加的效果， 其目的是為了表示DNA甲基化免疫英光染色位點(diǎn)的正確性，即綠色英光和紅色英光是完全 重合的。
[0031] 本試驗(yàn)中化R4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞的英光強(qiáng)度圖如圖2 所示，圖中TG表示轉(zhuǎn)化R4基因羊，WT表示非轉(zhuǎn)基因羊，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化R4基因羊母耳成纖 維細(xì)胞的耳成纖維細(xì)胞與非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞的英光強(qiáng)度無(wú)顯著差異（P〉〇. 05)。
[0032] 本試驗(yàn)初步篩選的可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊與非轉(zhuǎn)基因母羊的基本繁殖生理 指標(biāo)比較，如表1所示；
[0033] 表 1
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法，其特征在于初步篩選可用于繁殖 后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法是按以下步驟進(jìn)行： 一、 采集TLR4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后得到纖 維細(xì)胞制片； 二、 用體積百分濃度為4%的多聚甲醛固定耳成纖維細(xì)胞至少30分鐘，然后依次用體 積百分濃度為1 %的Triton-100處理30分鐘、體積百分濃度為1 %的HC1處理30分鐘、 2mg/mL的BSA封閉液封閉30分鐘； 三、 將耳成纖維細(xì)胞經(jīng)PBS吹洗3次，然后加入一抗，4°C孵育過(guò)夜，然后于FITC標(biāo)記的 抗小鼠二抗中37°C孵育1. 5h，接著于碘化丙碇中室溫染色lOmin，制片，Confocal顯微鏡觀 察并拍照； 四、 采用圖像分析軟件將TLR4轉(zhuǎn)基因母羊和非轉(zhuǎn)基因母羊的耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行熒光 強(qiáng)度定量分析比較，選擇與非轉(zhuǎn)基因母羊相比無(wú)顯著性差異的TLR4轉(zhuǎn)基因母羊耳成纖維 細(xì)胞，即完成可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的初步篩選。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法，其特征在 于步驟三中一抗為5-甲基胞嘧啶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種初步篩選可用于繁殖后代轉(zhuǎn)基因母羊的方法，其特征在 于步驟四所述圖像分析軟件為EZ-CIFreeViewer。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104237533SQ201410489940
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】房義, 鐘榮珍, 周道瑋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所