利用擬南芥的抗逆基因AtGST提高植物的抗逆性的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種來源于擬南芥的抗逆相關(guān)的基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中，由于不同的地理位置、氣候條件以及人類活動等多方面原因，造成了各 種逆境，植物常在不利的環(huán)境條件下生長，如干旱、水澇、鹽害、低溫、高溫、病蟲害等。對農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)來說，各種逆境是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)最直接、最重要的因素。因此，加強(qiáng)植物抗性 生理的研宄，探明植物在逆境下的生命活動規(guī)律并加以人為調(diào)控，培育具有抵抗不良環(huán)境 性狀的優(yōu)良品種，以提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，對于獲得農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。
[0003]谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，簡稱GST，EC2. 5. 1. 18)是廣 泛分布于植物、動物、鳥類、昆蟲及微生物體內(nèi)的一組多功能同工酶，其主要功能是催化各 種親電子化合物與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性而易于穿越細(xì)胞膜，分解后 排出體外，從而達(dá)到解毒的作用。植物GST分為8類，分別為phi(F)，tau(U)，theta(T)， zata(Z),lambda(L),DHAR,TCH0D和MAPEG。其中，最大的兩類phi(F)和tau(U)為植 物所特有，在植物修復(fù)有機(jī)化合物，尤其是對除草劑的分解過程中起著至關(guān)重要的作用。此 外，在提高植物抗逆性方面也具有重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種擬南芥抗逆相關(guān)的GST基因。
[0005] 所說的擬南芥抗逆相關(guān)基因，是AtGSTU19,它具有SEQIDNol的序列。
[0006] 上述基因編碼的蛋白質(zhì)，它具有SEQIDN〇2的氨基酸序列。
[0007] 上述基因AtGSTU19能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，在制備抗逆的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0008] 上述所說的擬南芥抗逆相關(guān)基因AtGSTU19,是通過以下方法得到： 1.擬南芥cDNA文庫的構(gòu)建 本發(fā)明將擬南芥種子經(jīng)2.5% (v/v) 0&((：10)2消毒后種植在黑土 ：蛭石：珍珠巖(1:1:1)混合基質(zhì)中，22 °C，16 h光照培養(yǎng)生長20 d。選生長健壯的幼苗提取總RNA。以 總RNA為模板，Oligo (dT)為引物，參照全式金生物科技有限公司cDNA合成試劑盒說明 (http ://www. transgen. com. cn)，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。
[0009] 2?引物的設(shè)計(jì)與合成 本發(fā)明設(shè)計(jì)一對引物，引物兩端分別引入和feci的酶切位點(diǎn)。
[0010]AtGSTU19-F: 5'-AAGGATCCATGGCGAACGAGGTGATTCTTC-3' AtGSTU19-R: 5'-AAGAGCTCTTACTCAGGTACAAATTTCTTC-3' 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成（http://www.sangon.com)。
[0011] 3.PCR的方法獲得擬南芥抗逆相關(guān)基因AtGSTU19片段 本發(fā)明的PCR擴(kuò)增采用大連寶生物工程有限公司（http://takara.com.cn)的PCR試 劑，在50y1的體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為：94°G預(yù)變性1min，94°G變性30s;55 °G退火30s;72 〇G延伸1min;共擴(kuò)增30個循環(huán)，再72 °G延伸10min。經(jīng)過1.0%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物為一條約600bp的片段。
[0012] 4.克隆鑒定與序列測定 擴(kuò)增片段采用愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州）有限公司（http://axygenbio.com)DNA瓊 脂糖凝膠回收試劑盒回收后，克隆到大連寶生物有限公司（http://takara.com.cn)的 pMD-18-SimpleT載體上進(jìn)行克隆鑒定和序列測定。
[0013] 5?序列分析 本發(fā)明通過核苷酸序列測定分析，最終獲得擬南芥抗逆相關(guān)基因AtGSTU19,其核苷酸 序列信息如SEQIDNol所示，其氨基酸序列如SEQIDN〇2所示。
[0014] 本發(fā)明所述的抗逆基因AtGSTU19能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，在培育提高抗逆性植物 中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果： 本發(fā)明克隆了擬南芥AtGSTU19基因，為了進(jìn)一步分析該基因在鹽、干旱脅迫中的作用 與功能，我們比較了轉(zhuǎn)AtGSTU19基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對鹽、干旱脅迫的 耐受性。結(jié)果表明，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)AtGSTU19基因的擬南芥植株在存活率上有明顯的差 異，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株有明顯的抗鹽、抗干旱能力，這也表明AtGSTU19基因的轉(zhuǎn)入 提高了擬南芥植株的抗鹽、抗干旱能力。
【附圖說明】
[0016] 圖1:瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產(chǎn)物。
[0017] 圖2 :瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
[0019] 下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源包括： 擬南芥的種子經(jīng)過2.5% (v/v)Ca(C10)2f_毒后種植在黑 土：蛭石：珍珠巖（1:1:1)的混合基質(zhì)中，22 °C，16h光照培養(yǎng)（16h光照，8h黑暗，冷 光源）生長20d。
[0020] 大腸桿菌coJ7)DH5a由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研宄所植物 基因工程研宄室保存。克隆載體PMD-18-SimpleT、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接 酶、dNTP、10XPCRbuffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試 劑都從美國西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑公司購買。
[0021] 下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻(xiàn)進(jìn)行【SambookJ，F(xiàn)retsEF， MannsdesTetal.In:MolecularCloning. 2nded.ColdSpringHarborLaboratory Press? 1989]〇
[0022] 實(shí)施例1 擬南芥幼苗RNA的抽提和cDNA合成 (一）試驗(yàn)方法： 植物總RNA的抽提試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州）有限公司（http://axygenbio. com)產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為全式金生物科技有限公司（http://www.transgen.com.cn)產(chǎn) 品，各種限制性內(nèi)切酶和T4DNALigase購自大連寶生物工程有限公司（http://takara. com.cn) 〇
[0023] 稱取約0. lg植物材料進(jìn)行總RNA的抽提，具體方法參照上述Axygen公司植物小 樣抽提說明書操作進(jìn)行，所抽提的總RNA進(jìn)行cDNA合成，具體方法參照TransGen公司說明 書操作進(jìn)行第一鏈合成。
[0024](二）試驗(yàn)結(jié)果： 采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產(chǎn)物的結(jié)果見圖1，圖中可見明顯的RNA條帶。
[0025] 實(shí)施例2 PCR方法獲得擬南芥抗逆相關(guān)基因AtGSTU19基因片段 (一）試驗(yàn)方法： 本發(fā)明設(shè)計(jì)一對引物（AtGSTU19-F和A