一種妥布霉素單克隆抗體及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】一種妥布霉素單克隆抗體及其制備方法與應用，屬于食品安全免疫檢測領(lǐng)域。該單克隆抗體是由保藏編號為CGMCC No.9307的小鼠雜交瘤細胞株G號（1A10）產(chǎn)生的。其制備方法為：（1）用戊二醛法將妥布霉素上的氨基活化后再與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)，得到的偶聯(lián)物用硼氫化鈉將戊二醛與氨基形成的西弗氏堿的C=N還原成穩(wěn)定的C-N結(jié)構(gòu)，即最終穩(wěn)定的偶聯(lián)物，作完全抗原。（2）將步驟（1）的完全抗原經(jīng)免疫、融合、篩選；擴大培養(yǎng)、小鼠腹腔誘導產(chǎn)腹水，得到用于特異性檢測妥布霉素的單克隆抗體。（3）用DCC法活化丁二酸的羧基，將活化液與卵清蛋白氨基反應得到卵清蛋白-丁二酸的羧基化蛋白，透析后再應用EDC法將妥布霉素與蛋白上的羧基縮合制備篩選抗體的包被。
CGMCC No.9307
2014.05.28
【專利說明】一種妥布霉素單克隆抗體及其制備方法與應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種妥布霉素單克隆抗體及其制備方法與應用，涉及雜交瘤細胞株IAlO (單克隆細胞株G號)產(chǎn)生的抗妥布霉素特異性單克隆抗體。本發(fā)明屬于食品安全免疫檢測領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]妥布霉素(Tob)是第二代氨基糖苷類抗生素，相對第一代氨基糖苷類抗生素而言，其療效更好、毒性更低，通常用于注射給藥，治療嚴重的G菌感染，成為目前世界臨床應用最為廣泛的氨基糖甙類抗生素之一。妥布霉素在獸藥領(lǐng)域也獲得了較廣泛的使用，因此其在肉類、奶類等人們常用的食品中也有存在。由于其安全的治療濃度為4mg/L?8mg/L，長時間血藥濃度超過8mg/L就可能引起嚴重的腎毒性與耳毒性。所以在有關(guān)食品等樣品中對妥布霉素進行快速、靈敏的測定很有必要。
[0003]目前，常用的妥布霉素的分析方法主要有微生物法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用等。微生物法是耗時且重復性和專一性較差。高效液相色譜法因為妥布霉素缺少強紫外吸收的基團，故在使用紫外檢測時需要衍生。
[0004]免疫分析方法相對于儀器檢測方法低成本、高靈敏、對技術(shù)人員要求低等特點，適用于大量樣品的快速篩查，這些特點使其成為非常具有推廣價值的食品安全快速篩查方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種對妥布霉素具有較好檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法。本發(fā)明提供一種抗妥布霉素通用單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對妥布霉素檢測靈敏度高，可以用來建立妥布霉素的免疫學檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一株單克隆細胞株G號，即能分泌抗妥布霉素單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株G號，又命名1A10，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9307。
[0007]所述單克隆細胞株G號分泌產(chǎn)生的抗妥布霉素的單克隆抗體，其由單克隆細胞株G號，即能分泌抗妥布霉素單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株IAlO所分泌產(chǎn)生。
[0008]所述抗妥布霉素的單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟:
(O制備完全抗原:用戊二醛法將妥布霉素上的氨基活化后再與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)；得到的偶聯(lián)物用硼氫化鈉將戊二醛與氨基形成的西弗氏堿的C=N還原成穩(wěn)定的C-N結(jié)構(gòu)，作完全抗原；
(2)將步驟(I)的完全抗原免疫小鼠，間接ELISA檢測，取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞株；擴大培養(yǎng)該陽性雜交瘤細胞株，將陽性雜交瘤細胞株注入同系小鼠腹腔誘導產(chǎn)生腹水，得到抗妥布霉素的單克隆抗體。
[0009]將步驟(I)的完全抗原透析純化后免疫6?8周齡BALB/c小鼠，與等量QuickAntibody免疫佐劑?混合均勻后，通過腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過間接ELISA篩選和三次亞克隆篩選出陽性雜交瘤細胞株；擴大培養(yǎng)該陽性雜交瘤細胞株，將陽性雜交瘤細胞株注入同系小鼠腹腔誘導產(chǎn)生腹水，得到可用于特異性檢測妥布霉素的單克隆抗體。
[0010]所述步驟(I)制備完全抗原:取20mg Tob (妥布霉素)溶于ImL pH 7.4,0.0lM的PBS緩沖液，將新鮮配制的1%的戊二醛溶液0.5mL緩慢滴加入所述溶液中，室溫攪拌活化8min ;另取1mg BSA/HSA溶解于I mL的0.05 M、pH 9.6的CBS溶液中；將上述活化后的妥布霉素溶液慢速逐滴加入BSA/HSA溶液中，室溫攪拌反應Ih ;將溶液在4°C條件下預冷，稱取一定量的硼氫化鈉使反應體系的硼氫化鈉的終濃度為4mg/mL，攪拌2h，最終的偶聯(lián)物4°C透析三天，-20°C分裝保存。
[0011]所述步驟(2)用于免疫的小鼠為6?8周齡BALB/c小鼠；免疫方法為:透析純化后妥布霉素完全抗原I mg/mL與等量QuickAntibody免疫佐劑?混合均勻后,通過腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠,每只100 μ L,每次免疫間隔時間為28天,共免疫8只小鼠；所述步驟(2)中，小鼠骨髓瘤細胞為小鼠骨髓瘤細胞SP 2/0。
[0012]所述抗妥布霉素的單克隆抗體的制備方法，所述方法還包括所述抗妥布霉素單克隆抗體的純化步驟。
[0013]抗體建立的用于間接競爭ELISA檢測的妥布霉素包被抗原Tob-OVA的制備，先用DCC法將丁二酸連接到卵清蛋白的氨基上，得到的羧基化的蛋白通過透析去除多余的小分子后，再用EDC活化羧基化的蛋白，加入妥布霉素小分子偶聯(lián)得到篩選的包被抗體。
[0014]取丁二酸17mg, DCC (N, N’- 二環(huán)己基碳二亞胺)20mg, NHS (N_N_輕基琥拍酰亞胺)1mg溶于ImL的DMF中活化過夜，離心去除沉淀，取上清滴加入溶于9mL 0.2M BB (硼酸鹽緩沖溶液)含50mg卵清蛋白的溶液中偶聯(lián)過夜；將羧基化的卵清蛋白4°C透析三天；
取上述羧基化的卵清蛋白1mg溶于ImL 0.0lM的PBS中，加入8mg EDC和5mg NHS，攪拌15min后，將事先溶解于2mL 0.05M的CBS溶液中6.8mg的妥布霉素逐滴加入蛋白液中偶聯(lián)4h，4°C透析三天，_20°C分裝保存。
[0015]所述抗妥布霉素的單克隆抗體的應用，用于檢測食品中妥布霉素殘留。
[0016]本發(fā)明提供IAlO細胞株(CGMCC N0.9307)的制備基本步驟為:(I)免疫原的制備與鑒定:妥布霉素通過戊二醛法與蛋白載體相連，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過SDS-PAGE鑒定；(2)小鼠的免疫:將抗原與QuickAntibody免疫佐劑?混合均勻后，通過腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠。通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；
(3)細胞融合與細胞株建立:通過聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株IAlO ; (4)雜交瘤細胞株性質(zhì)的鑒定:抗體亞型的鑒定采用小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒方法，IC5tl值。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的優(yōu)點在于:(1)本發(fā)明獲得抗妥布霉素單克隆抗體細胞株的制備方法簡便，完全抗原和包被抗原合成方便快捷；(2)獲得的細胞株分泌的抗體有較好的靈敏度(IC5tl值為0.3ng/mL)。單克隆抗體不僅能應用于妥布霉素的酶標記抗體、熒光標記抗體、膠體金標記抗體等；而且在后續(xù)的競爭實驗中，滿足劑量依賴性的要求，為間接競爭ELISA試劑盒的研發(fā)推廣奠定了基礎。
[0018]生物材料樣品保藏:一株單克隆細胞株G號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2014年5月28日，保藏編號為CGMCC N0.9307。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1 免疫原電泳表征，1、BSA，2、Tob-GA-BSA ;
圖2 IAlO單克隆抗體對妥布霉素抗原競爭反應的對數(shù)曲線。

【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進一步說明，不作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0021]骨髓瘤細胞SP2/0種子來源于北京康為世紀生物科技有限公司。6周齡的BALB/c純系雌性小鼠購自北京維通利華實驗動物中心。胎牛血清(上海洛神，Lot20090525)，細胞融合用 PEG 4000 (sigma), 50XHAT 儲液(sigma，H0262，093K8931)，50XHT (sigma H0317，Lot 064K8927), 1640 培養(yǎng)基(Gibco，Lot )DMS0 (Amresco 0231)，石蠟油(國藥試劑公司)。BSA (Sigma, A7638), OVA (Sigma，A5378)。
[0022]實施例1:雜交瘤細胞株IAlO的獲得及其產(chǎn)生的抗妥布霉素的單克隆抗體的鑒定
一、雜交瘤細胞株IAlO的獲得
1、妥布霉素完全抗原Tob-BSA/Tob-HSA的制備
取20mg Tob (妥布霉素)溶于ImL pH 7.4的PBS (0.0lM磷酸鹽緩沖液)，將新鮮配制的1%的戊二醛溶液0.5mL緩慢滴加入該小分子溶液中，室溫攪拌活化8min。另取1mgBSA(HSA)溶解于I mL的0.05 M、pH 9.6的CBS溶液中。將上述活化后的妥布霉素溶液慢速逐滴加入BSA(HSA)溶液中，室溫攪拌反應lh。將溶液在4°C條件下預冷，稱取一定量的硼氫化鈉使反應體系的硼氫化鈉的終濃度為4mg/mL，攪拌2h。4°C透析三天，_20°C分裝保存。
[0023]2、妥布霉素包被抗原Tob-OVA的制備
取丁二酸17mg，DCC 20mg, NHS 1mg溶于ImL的DMF中活化過夜，離心去除沉淀，取上清滴加入溶于9mL 0.2M BB液的含50mg卵清蛋白的溶液中偶聯(lián)過夜。將羧基化的蛋白4°C
透析三天。
[0024]取1mg上述羧基化的卵清蛋白溶于ImL 0.0lM的PBS中，加入8mg EDC和5mgNHS,攪拌15min后，將事先溶解于2mL 0.05M的CBS溶液中6.8mg的妥布霉素逐滴加入蛋白液中偶聯(lián)4h。4°C透析三天，_20°C分裝保存。
[0025]3、動物免疫
選擇健康的6?8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取妥布霉素完全抗原(I mg/mL)與等量QuickAntibody免疫佐劑?混合均勻后，通過腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每只100μ L，間隔時間為28天。在第四次加強免疫后的第7天，對小鼠進行尾部靜脈取血，用間接ELISA法測定效價，其中，包被Tob-OVA的濃度為0.0Syg/mL。選擇抑制最好的小鼠進行一次沖擊免疫，進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行細胞融合。
[0026]4、細胞融合在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為4000)方法進行細胞融合，具體步驟如下:(1)無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；(2)收集SP2/0細胞，懸浮于RPM1-1640基礎培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；(3)將脾細胞和SP2/0細胞按照1: 10的比例混合，離心后用50% PEG融合，時間Imin,之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清的2%的50XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37 °C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0027]5、細胞篩選與細胞株建立在細胞融合的第三天對融合細胞進行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進行用含20%胎牛血清、1%的100 XHT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第9天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步:第一步先用間接ELISA篩選出陽性細胞孔，第二步選用妥布霉素為標準品，用間接競爭ELISA對陽性細胞進行抑制效果測定。
[0028]具體方法為:
用50mM碳酸緩沖液(pH9.6)稀釋包被抗原至0.05ug/ml,加入到96孔酶聯(lián)板中進行包被，每孔100yL，4°C包被12-24小時；充分洗滌后用含1%明膠的CBS封閉，每孔200 μ L ;每孔加入各個克隆孔上清液50yL，37°C溫育30min，充分洗滌后加入10yL1:3000的酶標二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG)，37°C溫育20min后，加入底物顯色，1min后終止，讀取A 450nm。A 450nm值大于1.0以上的孔挑出來繼續(xù)進行抑制的檢測。將包好并封閉好的板置于室溫，空白孔加入50 μ L的PBS，相對應的加標孔加入濃度為0.3ppb妥布霉素標準品50yL，再同時在空白孔和加標孔加入50μ L克隆孔上清液。讀取空白孔的A45。?為A (空白)，加標孔的A 450ηα為A (加標)。抑制率=1-A (加標)/ A (空白)。抑制率越大表明克隆孔中細胞株分泌抗體靈敏度越高。挑出高抑制率的孔采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復三次，獲得細胞株1Α10。
[0029]二、單克隆抗體的制備與鑒定
1、獲取抗體腹水和純化
選取4周齡BALB/c小鼠，接種細胞前7?14天預先腹腔注射液體石蠟ImL/只。用生理鹽水調(diào)整雜交瘤細胞株IAlO濃度至2.0X10 6個/ mL，腹腔接種雜交瘤細胞，將腹水通過辛酸-DEAE-硫酸銨法純化。腹水和pH4.0的乙酸鈉溶液1:1混合后加入辛酸，振蕩0.5h,9000rpm 離心 lOmin，取上清加入 1:1 的 pH 8.2 的 Tris。DEAE 柱子先用 1mL PBS沖洗，之后加入腹水上清。用離心管收集流出的液體，再加入1mL的PBS淋洗，收集淋洗液。加入固體飽和硫酸銨使得最終淋洗液的硫酸銨濃度為50%。振蕩溶解后4°C放置2h。9000rpm離心15min,去除上清,用PBS溶解沉淀,4°C透析三天,將獲得的單抗置于_20°C保存。
[0030]2、抗體亞型鑒定
采用單克隆抗體亞型檢測試劑盒(Southern B1tech Cat N0.530005)對步驟I獲得的抗體進行免疫球蛋白亞型的鑒定，具體方法為:用Tob-OVA以0.0Syg/mL包被在96孔酶聯(lián)板(每孔0.lmL)，4°C過夜，棄包被液，洗滌3次，按0.2mL/孔的量加入封閉液(含1%BSA的PBS)，37°C孵育I h后，棄封閉液，洗滌3次，用PBS以1: 50000比例稀釋妥布霉素單克隆抗體，按0.1mL/孔的量加入到酶聯(lián)板內(nèi)，37°C孵育I h后洗滌3次，加入用PBS以1: 5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的各類抗體(小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM)37°C、孵育0.5h后洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過氧化物酶底物反應液(lmg/mL TMB)，37°C反應10 min，出現(xiàn)藍色即為陽性結(jié)果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H2 SO 4終止反應。結(jié)果表明雜交瘤細胞IAlO分泌的抗體為IgGl亞類。
[0031]實施例2.用雜交瘤細胞株IAlO分泌的抗體建立間接競爭ELISA方法的應用
將雜交瘤細胞株IAlO通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應用于妥布霉素ELISA添加回收試驗，具體步驟如下:
(I)用碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋好的0.05 μ g/mL Tob-OVA作為包被原包被96孔酶標板，每孔100yL，37°C包被2 h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250 μ L，每次3 min，拍干。
[0032](2)用含0.1%酪蛋白的CBS進行封閉，每孔200yL，37°C封閉2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250 μ L,每次3 min,拍干。
[0033](3)用磷酸鹽緩沖液(PBS)分別配制 0,0.625,1.25,2.5，5，10，20，40 μ g/L 的妥布霉素標準溶液。將標準溶液以及待檢測樣品提取液，分別加入到已經(jīng)封閉好的酶標板中，每孔50 μ L，每個樣品重復3個孔，再每孔加入50 μ L I: 50000稀釋的抗妥布霉素單克隆抗體，37°C反應0.5h后，洗板拍干。
[0034](4)每孔加入100 UL用含0.01%明膠的PBS I: 3000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C反應0.5h后，洗板拍干。
[0035](5)每孔加入100 μ L TMB顯色液，37°C顯色15 min后，每孔加入50 μ L 2Μ H2SO4終止液，450 nm測吸光值。
[0036](6)添加回收及樣品前處理:稱取ImL液態(tài)牛奶置入2mL聚四氟乙烯離心管中，分別添加3ng、10 ng和30ng Tob0用樣品稀釋液(0.0lM PBS)稀釋30倍后，直接作為ELISA樣品檢測液，采用間接競爭ELISA進行添加回收試驗，其回收率分別為80%，98%，102%。
[0037]溶液的配制:
碳酸鹽緩沖液(CBS):稱取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至lOOOmL，4°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0038]磷酸鹽緩沖液(PBS):8.00 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4.12H2O,溶于800 mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2?7.4，定容至1000 mL ；
PBST:含 0.05% 吐溫 20 的 PBS ；
TMB 顯色液:A 液=Na2HPO4.12H20 18.43g，檸檬酸 9.33g，純水定容至 1000 mL ；B 液:60 mg TMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1: 5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0039]綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一株單克隆細胞株G號，即能分泌抗妥布霉素單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株G號，又命名1A10，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9307。
2.權(quán)利要求1所述單克隆細胞株G號分泌產(chǎn)生的抗妥布霉素的單克隆抗體，其特征在于:其由單克隆細胞株G號，即能分泌抗妥布霉素單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株IAlO所分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述抗妥布霉素的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (O制備完全抗原:用戊二醛法將妥布霉素上的氨基活化后再與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)；得到的偶聯(lián)物用硼氫化鈉將戊二醛與氨基形成的西弗氏堿的C=N還原成穩(wěn)定的C-N結(jié)構(gòu)，作完全抗原； (2)將步驟(I)的完全抗原免疫小鼠，間接ELISA檢測，取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞株；擴大培養(yǎng)該陽性雜交瘤細胞株，將陽性雜交瘤細胞株注入同系小鼠腹腔誘導產(chǎn)生腹水，得到抗妥布霉素的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗妥布霉素的單克隆抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)制備完全抗原:取20mg妥布霉素溶于ImL pH 7.4,0.0lM的PBS緩沖液，將新鮮配制的1%的戊二醛溶液0.5mL緩慢滴加入所述溶液中，室溫攪拌活化8min ;另取1mg BSA/HSA溶解于I mL的0.05 M、pH 9.6的CBS溶液中；將上述活化后的妥布霉素溶液慢速逐滴加入BSA/HSA溶液中，室溫攪拌反應Ih ;將溶液在4°C條件下預冷，稱取一定量的硼氫化鈉使反應體系的硼氫化鈉的終濃度為4mg/mL，攪拌2h，最終的偶聯(lián)物4°C透析三天，_20°C分裝保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗妥布霉素的單克隆抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)用于免疫的小鼠為BALB/c小鼠；免疫方法為:妥布霉素完全抗原I mg/mL與等量QuickAntibody免疫佐劑?混合均勻后，通過腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每只100 μ L，每次免疫間隔時間為28天，共免疫8只小鼠；所述步驟(2)中，小鼠骨髓瘤細胞為小鼠骨髓瘤細胞SP 2/0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗妥布霉素的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述方法還包括所述抗妥布霉素單克隆抗體的純化步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗妥布霉素的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，用于間接ELISA檢測的妥布霉素包被抗原Tob-OVA的制備:取丁二酸17mg，N, N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺DCC 20mg, N-N-羥基琥珀酰亞胺NHS 1mg溶于ImL的DMF中活化過夜，離心去除沉淀，取上清滴加入溶于9mL 0.2M硼酸鹽緩沖溶液BB含50mg卵清蛋白的溶液中偶聯(lián)過夜；將羧基化的卵清蛋白4°C透析三天； 取上述羧基化的卵清蛋白1mg溶于ImL 0.0lM的PBS中，加入8mg EDC和5mg NHS，攪拌15min后，將事先溶解于2mL 0.05M的CBS溶液中6.8mg的妥布霉素逐滴加入蛋白液中偶聯(lián)4h，4°C透析三天，_20°C分裝保存。
8.權(quán)利要求2所述抗妥布霉素的單克隆抗體的應用，其特征在于用于檢測食品中妥布霉素殘留。
【文檔編號】G01N33/577GK104312978SQ201410510516
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】匡華, 曹珊珊, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學