檢測尿液Clusterin含量試紙條的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測尿液Clusterin含量試紙條的制備及應(yīng)用，用于急性腎損傷和藥物腎毒性安全性監(jiān)測，屬于疾病檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明提供的Clusterin膠體金試紙條，基本原理為雙抗夾心法，在硝酸纖維素膜的兩端分別設(shè)有金標(biāo)墊和吸收墊，金標(biāo)墊上端為樣品墊，金標(biāo)墊包被有純化的單克隆Clusterin抗體1膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測線包被有純化的單克隆Clusterin抗體2，質(zhì)控線包被有正常羊抗小鼠IgG抗體，質(zhì)控線側(cè)貼有吸收墊，該試紙條操作簡單，無需儀器，結(jié)果易于判斷，且檢測手段無創(chuàng)，制備試紙條所用單克隆抗體為雜交瘤技術(shù)自行制備，費(fèi)用低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】檢測尿液Cluster in含量試紙條的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是一種急性腎臟損傷疾病的檢測方法，具體涉及一種應(yīng)用免疫膠體金技術(shù) 研制的Clusterin檢測試紙條，同時(shí)公開了其制備方法，屬于疾病檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性腎損傷在臨床是常見而嚴(yán)重的腎臟病變，其發(fā)病率和死亡率都很高，尋求 具有高敏感性、特異性、易檢測的新的腎損傷標(biāo)志物一直是研究熱點(diǎn)之一。簇集蛋白 (Clusterin)是一種分子量為80KD的異二聚體糖蛋白，廣泛存在于人類及動物的許多組織 中，急性腎損傷（acute kidney in jury, AKI)時(shí)，尿簇集蛋白表現(xiàn)出抗凋亡作用，并與脂肪 利用、細(xì)胞聚集及黏附有關(guān)。雖然它在多種組織廣泛表達(dá)，但由于其相對分子質(zhì)量較大，不 能從腎小球?yàn)V過，因此只有在腎損傷時(shí)才能在尿中檢測。動物研究表明當(dāng)腎毒素、腎切除術(shù) 后、多囊肝性腎病和腎細(xì)胞瘤引起的急性腎損傷時(shí)，Clusterin能在腎損傷后的去分化腎細(xì) 胞中表達(dá)增加，在鼠、狗和靈長類動物的尿中均可檢測出來。因此檢測尿中Clusterin水平 可以間接評價(jià)急性腎損傷和藥物腎毒性的情況。
[0003] 目前國內(nèi)外檢測Clusterin的方法包括免疫組化、ELISA、Western blot、PCR等， 但用于臨床則存在很多弊端，如有創(chuàng)、操作程序復(fù)雜、時(shí)間較長等。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是公開一種用于檢測尿液Clusterin含量的膠體金試紙條及制備 方法，用于急性腎損傷和藥物腎毒性安全性監(jiān)測。
[0005] 本發(fā)明提供的Clusterin的膠體金試紙條，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，基本原理為雙抗 夾心法，具體安裝方法參考了中國專利99203566. X、200510200394. 6等，在硝酸纖維素 膜的兩端分別設(shè)有金標(biāo)墊和吸收墊，金標(biāo)墊上端為樣品墊，金標(biāo)墊包被有純化的單克隆 Clusterin抗體1膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測線包被有純化的單克隆Clusterin抗體2,質(zhì)控 線包被有正常羊抗小鼠 IgG抗體，質(zhì)控線側(cè)貼有吸收墊。
[0006] 本Clusterin的膠體金試紙條的制備，包括以下步驟：
[0007] 1將自行制備的純化單克隆Clusterin抗體1用膠體金標(biāo)記，噴點(diǎn)于玻璃纖維膜 上制備成金標(biāo)墊，將自行制備的純化單克隆Clusterin抗體2和正常抗小鼠 IgG抗體分別 包被在硝酸纖維素膜（NC膜）上的檢測線處和質(zhì)控線處，當(dāng)被檢樣品中含有Clusterin抗 原時(shí)，則于金標(biāo)墊與膠體金標(biāo)記的Clusterin抗體結(jié)合，并在吸收墊的作用下，向前滲透泳 動，與檢測線上的Clusterin抗體再次結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的色帶。
[0008] 本發(fā)明試劑盒的使用方法如下：取尿標(biāo)本約0. 1-0. 5ml加入小試管中，然后插入 試紙條，待1-2分鐘反應(yīng)帶清晰后觀察結(jié)果（見圖2)。出現(xiàn)1條紅色（對照）沉淀線，為尿 檢診斷陰性；出現(xiàn)2條紅色（樣品和對照）沉淀線，為尿檢診斷陽性，未出現(xiàn)沉淀線則為無 效。
[0009] 本發(fā)明的積極效果在于：應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)制備Clusterin試紙條，可以快速， 靈敏檢測尿中Clusterin蛋白含量，避免了復(fù)雜的操作，無需特殊檢測儀器，結(jié)果易于觀察 判斷，可以適應(yīng)多種檢測環(huán)境，無專業(yè)技術(shù)人員均可操作。樣本用量小，對操作者無毒性，并 且檢測手段無創(chuàng)，除可用于臨床急性腎損傷的檢測還可用于藥物腎毒性安全性監(jiān)測。制備 試紙條所用單克隆抗體為雜交瘤技術(shù)自行制備，費(fèi)用低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010] 圖1.為Clusterin檢測裝置示意圖；
[0011] 圖2.為Clusterin試劑盒檢測結(jié)果判定不意圖；
[0012] 圖中：1 -樣品墊，2-金標(biāo)墊，3-硝酸纖維素膜，4-吸水墊，5-PVC板，6-檢測線， 7_質(zhì)控線。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例lClusterin單克隆抗體的制備
[0014] 用Clusterin蛋白（美國BD公司）多次免疫Balb/c小鼠，最后一次加強(qiáng)免疫后 第3天取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株X63-Ag8. 653雜交融合（融合劑為聚乙二醇）， 制備雜交瘤細(xì)胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌Clusterin單克隆抗體的細(xì)胞株制備抗Clusterin的 單克隆抗體1、2,測定單克隆抗體1、2效價(jià)，ELISA驗(yàn)證2者混合后效價(jià)疊加，證明1、2是針 對Clusterin蛋白抗原上不同的抗原決定簇。
[0015] 實(shí)施例2Clusterin膠體金試紙條的制備：
[0016] 根據(jù)圖1所示，試紙條在硝酸纖維素膜的兩端分別設(shè)有金標(biāo)墊和吸收墊，金標(biāo)墊 上端為樣品墊，金標(biāo)墊包被有純化的單克隆Clusterin抗體1膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測線包 被有純化的單克隆Clusterin抗體2,質(zhì)控線包被有正常羊抗小鼠 IgG抗體，質(zhì)控線側(cè)貼有 吸收墊。
[0017] (1)膠體金顆粒的制備：將1ml 1 %氯金酸溶液與99ml超純水混勻得終濃度為 0.01 %的氯金酸溶液，煮沸；吸取1 %檸檬酸三鈉1.6ml，將其一次并快速地加入煮沸的 氯金酸溶液中，溶液繼續(xù)加熱至淡黃色轉(zhuǎn)為藍(lán)黑色最終變?yōu)榱良t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱 5min，室溫下冷卻，補(bǔ)充失水至原體積（見流程圖）。在透射電鏡下觀察，可見金顆粒大小基 本一致，分布均勻。測量100個(gè)膠體金顆粒直徑，計(jì)算平均直徑約20nm。
[0018] 膠體金顆粒的制備過程：
[0019]
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測尿液Clusterin含量試紙條的制備，在硝酸纖維素膜的兩端分別設(shè)有金標(biāo) 墊和吸收墊，金標(biāo)墊上端為樣品墊，其特征在于：金標(biāo)墊包被有純化的自制Clusterin單克 隆抗體1膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測線包被有純化的自制Clusterin單克隆抗體2,質(zhì)控線包 被有正常羊抗小鼠 IgG抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Clusterin單克隆抗體1和單克隆抗體2,其特征在于 Clusterin單克隆抗體1和Clusterin單克隆抗體2為分別針對Clusterin不同抗原決定 簇的抗體，即結(jié)合位點(diǎn)不同。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Clusterin單克隆抗體1和Clusterin單克隆抗體2,其特 征在于Clusterin單克隆抗體1和Clusterin單克隆抗體2均為采用小鼠雜交瘤細(xì)胞法制 備。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測Clusterin含量的膠體金試紙條，其特征在于該試 紙條用于檢測人或動物尿液樣品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測Clusterin含量的膠體金試紙條，其特征在于該試 紙條在臨床急性腎損傷輔助診斷及藥物研究中腎毒性安全性監(jiān)測的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/577GK104267187SQ201410549920
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】于曉艷, 耿嘉男, 鄒穎剛, 石艷, 李相軍, 孫波, 苗春生, 劉凱 申請人:吉林大學(xué)